一种ProtoRAG转座子系统及其用图
【专利摘要】本发明提供了一种ProtoRAG转座子系统，该ProtoRAG转座子系统包括两种转座酶和两种转座酶识别的上下游末端重复序列，采用该系统能够很好地将目的基因导入受体基因组，实现基因的转移。
【专利说明】
一种ProtoRAG转座子系统及其用途
技术领域
[00011本发明涉及基因工程技术领域DNA转移技术，具体涉及一种ProtoRAG转座子系统。
【背景技术】
[0002] 转座子(Transposon)最早是由McClintock于20世纪50年代在研究玉米籽粒的颜 色变异中发现的一类不依靠同源重组而能在基因组内和基因组间发生位置改变的DNA序 列，因此也被称为跳跃基因或者可移动元件。转座子种类多样，数量庞大，且分布广泛。从细 菌，古细菌，到真核生物中都有发现，（占人类基因组的45%)被认为是基因组进化的重要驱 动力。根据其转座机制的不同主要分为两类:反转录转座子和DNA转座子。反转录转座子首 先通过转座酶转录出RNA中间体，再进行反转录合成dsDNA插入宿主基因组，这种工作方式 被称为"复制-粘贴"模式。DNA转座子则需要通过转座酶将转座子序列切出，然后通过DNA攻 击的方式插入新的基因组位置，也称为"剪切-粘贴"模式。而根据转座子是否自主编码转座 需要的转座酶基因，又将转座子分为：自主转座子和非自主转座子。基因组中自主转座子由 于更易于造成基因组的不稳定性，往往受到宿主更严格的调控甚至使其失活。非自主转座 子由于不编码完整功能的转座酶，因此必须借助自主转座子的转座酶进行转座。
[0003] 随着不同物种中新转座子的逐步发现，以及对转座机制和转座活性的深入研究， 利用转座子作为基因导入手段已经在多个技术领域得到广泛应用，如:成体和胚系转基因， 功能基因组研究，基因治疗等。其中使用较为广泛的有SleepingBeauty ,piggyBAC等转座 子。在自然状态下，因为大量累积突变的存在，SleepingBeauty都不具有转座活性。首个有 活性的SleepingBeauty转座子是通过对鱼类基因组中多个失活的Tcl/mariner转座子进行 分子重建产生的，能够插入到AT二碱基区域，同时倾向于插入到内含子中。此后，为了提高 SleepingBeauty的转座活性，研究人员对SleepingBeauty转座酶基因进行了广泛的氨基酸 突变筛选，最终获得了活性增加100倍的SleepingBeauty突变体，从而能够获得与病毒载体 相近的稳定重组效率。PiggyBAC最初在鳞翅目昆虫中发现，能够插入到TTAA的四碱基区域， 并且更倾向于插入到转录元件的转录起始位点附近。随后进一步研究发现其在哺乳动物细 胞系以及生殖细胞中都具有良好的转座活性，成为哺乳动物遗传操作的有力工具。此外，不 同的转座子在宿主选择，转座子活性，外源基因的荷载能力，转座插入位点的偏好性以及转 座子移动范围等方面表现出明显差异，使得转座子在具体的问题解决过程中表现出不同的 适用性。因此，对于新转座子的发现以及应用成为一个持续的需求。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种ProtoRAG转座子 系统，本发明还提供了采用该ProtoRAG转座子系统转移基因的方法，本发明还提供了该 ProtoRAG转座子系统的用途。
[0005]为实现上述目的，所采取的技术方案:一种ProtoRAG转座子系统，所述ProtoRAG转 座子系统包括可插入目的基因的转基因供体质粒和提供转座活性的转座酶辅助质粒，所述 转基因供体质粒依次包括转座子5 '末端重复序列、多克隆插入位点和转座子3 '末端重复序 列，所述转座子5'末端重复序列包括SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO: 10 具有至少95%同源性且与SEQ ID N0:10功能相同的核苷酸序列，所述转座子3'末端重复序 列包括SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO: 11具有至少95%同源性且与SEQ ID NO: 11功能相同的核苷酸序列。
[0006] 优选地，所述转座子5'末端重复序列包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列或者 与SEQ ID NO:8具有至少95%同源性且与SEQ ID NO:8功能相同的核苷酸序列。
[0007] 优选地，所述转座子3'末端重复序列包括SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或者与 SEQ ID NO:9具有至少95%同源性且与SEQ ID NO:9功能相同的核苷酸序列。
[0008] 优选地，所述转座酶辅助质粒表达转座酶BbRAGlL和转座酶BbRAG2L，所述转座酶 BbRAGlL的编码序列选自SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列中的一种，所述转 座酶BbRAG2L的编码序列选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列中的一种。
[0009] 优选地，所述转座酶辅助质粒表达转座酶BbRAG IL和转座酶BbRAG2L，所述转座酶 BbRAGlL的编码序列是与SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:6具有至少95%同源性，且与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 6功能相同的核苷酸序列；所述转座酶BbRAG2L的编码序列是与SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7具有至少95%同源性，且与SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7功能相同的核 苷酸序列。
[0010] 优选地，所述转座酶辅助质粒表达转座酶BbRAGlL和转座酶BbRAG2L，所述转座酶 BbRAGlL的氨基酸序列包括SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列，所述转座酶 BbRAG2L的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
[0011] 优选地，所述转基因供体质粒是将所述转座子5 '末端重复序列、多克隆插入位点 和转座子3 '末端重复序列连入真核表达载体pcDNA3.1而得的。
[0012] 优选地，所述转座酶辅助质粒是将转座酶编码序列连入真核表达载体PCDNA3.1而 得的。
[0013] 本发明提供了一种采用上述所述ProtoRAG转座子系统转移基因的方法，所述方法 是通过所述RAG转座子系统将目的基因导入受体基因组。
[0014] 本发明提供了上述所述ProtoRAG转座子系统在介导DNA导入细胞中的用途。
[0015] 文昌鱼属于脊索动物门（Chordata)，头索动物亚门（Cephalochordata)，是无脊椎 动物进化到脊椎动物的过渡类型。通过基因组的比较研究发现，文昌鱼基因组中包含具有 很高多样性的转座子群体，既涵盖了脊椎动物中的绝大部分的转座子家族，也包括许多无 脊椎动物所特有的转座子家族。本发明的发明人从文昌鱼中发现并率先克隆了 ProtoRAG转 座子，包含两端的TIR序列和中间的BbRAGlL和BbRAG2L转座酶。通过设计实验揭示了这一原 始转座子的转座特性，可以将其应用于制备基因重组载体、基因重组细胞和转基因动物等 生产实践。
[0016]本发明的有益效果在于:本发明提供了一种ProtoRAG转座子系统，该ProtoRAG转 座子系统包括两种转座酶和两种转座酶识别的上下游末端重复序列，采用该系统能够很好 地将目的基因导入受体基因组，实现基因的转移。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明所述ProtoRAG转座子基因组结构示意图，其包含的BbRAGlL和 BbRAG2L基因的编码区也如图所示；
[0018] 图2a为本发明所述真核重组表达质粒BbRAGlL-pcDNA3.1的构建示意图；
[0019]图2b为本发明所述真核重组表达质粒BbRAG2L-pcDNA3.1的构建示意图；
[0020] 图3a为BbRAGlL和BbRAG2L转座酶介导的TIR底物切出；
[0021]图3b为本发明实施例5中BbRAGlL和BbRAG2L转座酶介导的TIR底物切出后的琼脂 糖凝胶电泳图；
[0022]图4a为本发明实施例6中TIR关键序列设计策略；
[0023] 图4b为本发明实施例6中BbRAGlL和BbRAG2L转座酶介导的mini-TIR切出结果； [0024] 图5a为本发明实施例7中BbRAGlL和BbRAG2L转座酶介导的转座示意图；
[0025]图5b为BbRAGlL和BbRAG2L转座酶介导的转座插入位点统计图；
[0026]图5c为BbRAGlL和BbRAG2L转座酶介导的转座插入位点碱基序列组成统计图；
[0027]图6a为BbRAGlL转座酶关键结构域研究策略；
[0028]图6b为BbRAGlL转座酶不同结构域活性差异研究；
[0029]图7a为BbRAGlL转座酶关键氨基酸研究策略；
[0030]图7b为BbRAGlL转座酶关键氨基酸突变后的活性研究。
【具体实施方式】
[0031]为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。
[0032] 本申请发明人在中国白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)中发现的一种全新 的转座子基因，其编码的转座酶蛋白质与脊椎动物V(D)J重组中的RAG1/2重组酶具有较高 的相似度，故此命名为ProtoRAG转座子，包含上下游的末端重复序列(TIR)和两个转座酶基 因，ProtoRAG转座子基因组结构如图1所示，其DNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0033]本发明根据生物信息分析在文昌鱼基因组中找到的基因组片段，通过Bac文库筛 选获得完整的包含ProtoRAG转座子的基因组序列，进而在胚胎发育时期的cDNA中扩增获得 文昌鱼BbRAGlL和BbRAG2L基因编码区序列，本发明所述ProtoRAG转座子所包含的两个转座 酶基因 BbRAGlL和BbRAG2L，其编码区核苷酸序列分别如SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4所示， 其编码的BbRAGlL和BbRAG2L转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示。该蛋 白预测的等电点分别为为7.31和8.05,分子量分别为126054和39461道尔顿。BbRAGlL和 BbRAG2L基因编码区密码子优化后的cDNA序列分别如SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示。 [0034]本发明所述的BbRAGlL和BbRAG2L转座酶介导转座所依赖的上、下游末端重复序列 (TIR)，分别如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
[0035] 本发明所述的BbRAGlL和BbRAG2L介导的DNA转座活性和机制如下（图5a和图5b): [0036]将BbRAGlL和BbRAG2L转座酶核苷酸序列分别克隆到哺乳动物真核表达载体 pcDNA3.1 上，得到真核表达载体BbRAGlL-pcDNA3.1 和BbRAG2L-pcDNA3.1 (图2a和图2b); [0037] 将转座子上下游末端重复序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9克隆到pcDNA3.1载体 上，呈对向排列。在TIR序列之间插入由Iac启动子控制的氯霉素基因，构成ProtoRAG的重组 底物，称为pTIR123(图5a)。
[0038]将BbRAGlL-pcDNA3.1 和BbRAG2L-pcDNA3.1 与pTIR123，pEGFPNl 共同转染 HEK293T 细胞。48小时后，能够检测到lac启动子控制的氯霉素基因转座插入到pEGFPNl载体中，形成 具有K+Chl+双重抗性的重组质粒。
[0039] 针对所述BbRAGlL转座酶开发的潜在变体，按照图6a的策略研究BbRAGlL转座酶的 关键结构域，从图6b结果可以看出不同结构域的活性差异，并且得出BbRAGlL转座酶的关键 结构域为468-1136aa;按照图7a的策略研究BbRAGlL转座酶的关键氨基酸，从图7b结果可以 看出突变后的BbRAGlL转座酶的活性差异，并且得出BbRAGlL转座酶的关键氨基酸为D701， D811，E1063,其完整序列如序列表中SEQIDN0:22所示。
[0040]针对所述转座依赖的TIR序列存在的潜在变体，其上游末端重复序列关键核苷酸 如SEQ ID NO: 10所示，下游末端重复序列关键核苷酸如SEQ ID NO: 11所示。
[0041 ] 实施例1:中国白氏文昌鱼受精卵mRNA的提取和cDNA合成
[0042]总RNA的提取和mRNA纯化：收集文昌鱼胚胎，采用Trizol试剂法提取总RNA，利用 QiagenOligotex mRNA Mini Kit(codeNo.70022)试剂盒纯化mRNA。
[0043] 普通cDNA-链的合成：取lygmRNA，按照Τ0Υ0Β0公司的First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace_a-TM(code No.FSK-100)说明书操作，进行逆转录合成用于 扩增基因片段和克隆基因全长的cDNA第一链。
[0044] 实施例2:扩增BbRAGlL和BbRAG2L基因的全长编码区序列
[0045] 根据基因组预测的编码区序列，设计BbRAGlL和BbRAG2L基因特异的编码区扩增引 物，扩增BbRAGlL的引物对：
[0046] BbeRAGl_FUl:5，-TAGCTAGATATTAGACGTTGAATGTTAA-3，（SEQ ID NO:12)，
[0047] BbeRAGl_FLl:5，-TTGGGCAATTAAATCATTACATACAGTT-3，（SEQ ID N0:13);
[0048] 扩增BbRAG2L的引物对：
[0049] BbeRAG2_FUl:5'-CAGCGCGAGATCTAAACAAACGCACATT-3'（SEQ ID NO:14)，
[0050] BbeRAG2_FLl:5'-TCGAGGCCTGATACATGTACACGAACAG-3'（SEQ ID N0:15)。
[0051 ] 采用Takara公司的PrimerStar聚合酶扩增BbRAGlL和BbRAG2L的全长基因，分别扩 增得到3468bp和1244bp长度的DNA片段。将扩增得到的DNA片段连接到pGEM T easy载体后 转化大肠杆菌DH5a感受态，挑选重组克隆测序。对测序结果进行拼接分析，获得BbRAGlL和 BbRAG2L基因的全长序列，分别包含完整的BbRAGlL和BbRAG2L基因的编码区序列，如 SEQIDN0:2和SEQIDN0:4所示。
[0052] 实施例3 :BbRAGlL和BbRAG2L编码区密码子优化
[0053]由于BbRAGl L和BbRAG2L基因在哺乳动物细胞中表达量低，在保证不改变编码氨基 酸的情况下，对BbRAGlL和BbRAG2L编码区的密码子进行优化，使其能够在哺乳动物细胞中 顺利表达。优化后的BbRAGIL编码序列如SEQ ID NO: 6所示，优化后的BbRAG2L编码序列如 SEQ ID N0:7所示，优化后的cDNA序列克隆在pUC57载体上。
[0054] 实施例4:重组BbRAGlL和BbRAG2L表达载体的构建
[0055] 根据优化后的BbRAGlL基因序列，设计引物，上游引物包含HindIII内切酶切割位 点，下游引物包含XhoI内切酶切割位点。上游引物如SEQ ID NO: 16所示，下游引物如SEQ ID NO: 17所示。
[0056] BmRAGl_pCDNA3.1_Ul:CCCAAGCTTATGTTCTTTACAAGCTCTCA(SEQ ID N0:16)，
[0057] BmRAGl_pCDNA3.1_L1:CGGCTCGAGGTTAGAATCGCTTTCAATGT(SEQ ID NO:17)。
[0058] 根据优化后的BbRAG2L基因序列设计引物，上游引物包含HindIII内切酶切割位 点，下游引物包含EcoRI内切酶切割位点。上游引物如SEQ ID NO: 18所示，下游引物如SEQ ID NO: 19所示。
[0059] BmRAG2_pCDNA3.1_Ul:CCAAGCTTATGAGTAGCGGACCTATCTTTAG(SEQ ID N0:18)，
[0060] BmRAG2_pCDNA3.1_Ll:CCGGAATTCCAGGTTAGTGCAACAGTTCA(SEQ ID N0:19)。
[0061 ]分别以含有 BbRAGlL 和 BbRAG2L 基因的 pGEM-Teasy 质粒为模板，BmRAGl_pCDNA3.1_ U1/L1和BmRAG2_praNA3.1_Ul/Ll为引物进行PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小 分别为3400和IlOObp左右。将PCR扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3.1上，得到重组表达 载体BbRAGlL-pcDNA3.1和BbRAG2L-pcDNA3.1(其构建过程如图2a和图2b所示）。表达载体中 的外源基因序列经测序鉴定正确。
[0062] 实施例5:BbRAGlL和BbRAG2L介导的TIR基因盒切出
[0063] 根据TIR序列设计合成策略:基因盒包括呈对向排列的TIR，以及插入其中的polyA 转录终止序列，通过上游的XhoI和下游的Apa頂每切位点连入peGFPNl载体，得到重组载体 pTIRGl。载体构建示意图如图3a所示，其序列如序列表中SEQ ID N0:23所示。
[0064] BbRAGlL-pcDNA3 · I (1 · 6yg)和BbRAG2L-pcDNA3 · I (1 · 6yg)，pTIRGl (0 · 8yg)共同转 染HEK293T细胞。转染48小时后，收集细胞。通过Omegaplasmidextractionkit提取质粒。通 过P1/P2引物扩增（P1 :5'GTCGTAACAACTCCGC3'（SEQIDN0:20);P2:5'GTCGTAACAACTCCGC 3'（SEQ ID N0:21))，进行琼脂糖凝胶电泳（图3b)。未发生TIR基因盒切出的片段大小为 1168bp;发生TIR基因盒切出的片段大小约为240bp。
[0065] 实施例6:BbRAGlL和BbRAG2L介导的mini-TIR序列确立
[0066]根据图4a所示设计TIR序列合成策略：基因盒包括呈对向排列的TIR，以及插入其 中的PolyA转录终止序列，通过上游的XhoI和下游的ApaI酶切位点连入peGFPNl载体。载体 构建示意图如图3a所示。
[0067] BbRAGlL-pcDNA3 · I (1 · 6yg)和BbRAG2L-pcDNA3 · I (1 · 6yg)，pTIRGl (0 · 8yg)共同转 染HEK293T细胞。转染48小时后，收集细胞。通过Omegaplasmidextractionkit提取质粒。通 过P1/P2引物扩增（P1 :5'GTCGTAACAACTCCGC3'（SEQIDN0:20);P2:5'GTCGTAACAACTCCGC 3'（SEQ ID NO: 21))，进行琼脂糖凝胶电泳（图4b)。电泳结果显示，5TIR的上游和3TIR的上 游为TIR基因盒切出所必需的最短TIR，称为mini-TIR，上游末端重复序列关键核苷酸如SEQ ID NO: 10所示，下游末端重复序列关键核苷酸如SEQ ID NO: 11所示。
[0068] 实施例7 :BbRAGlL和BbRAG2L的细胞内转座
[0069] 根据TIR序列设计合成策略:基因盒包括呈对向排列的TIR，以及插入其中的由Iac 启动子控制的氯霉素表达框，通过上游的BamHI和下游的XholI酶切位点连入pcDNA3.1( + ) 载体，得到重组载体PTIR123。载体构建示意图如图5a所示，其序列如序列表中SEQ ID NO: 24所示。
[0070] BbRAGlL-pcDNA3.1(1.6yg)和BbRAG2L-pcDNA3.1(1.6yg)，pTIR123(0.8yg)， pEGFPNl(lyg)共同转染HEK293T细胞。转染48小时后，收集细胞。通过 Omegaplasmidextract ionkit提取质粒。将得到的质粒转化大肠杆菌DH5a感受态，利用Chl+ K+双重抗性平板进行筛选，得到重组的阳性克隆(示意图如图5a所示）。挑取阳性克隆，进行 测序，然后比对PeGFPNl载体，确定TIR基因盒转座插入的位置，统计结果如图5b所示。同时 分析插入位点两侧的碱基组成发现，BbRAGlL和BbRAG2L介导的基因转座偏好于插入受体载 体的CG富集区，插入位点附近的碱基统计结果如图5c所示。
[0071]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
【主权项】
1. 一种ProtoRAG转座子系统，其特征在于，所述ProtoRAG转座子系统包括可插入目的 基因的转基因供体质粒和提供转座活性的转座酶辅助质粒，所述转基因供体质粒依次包括 转座子5 '末端重复序列、多克隆插入位点和转座子3 '末端重复序列，所述转座子5 '末端重 复序列包括SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO: 10具有至少95%同源性且 与SEQ ID NO: 10功能相同的核苷酸序列，所述转座子3'末端重复序列包括SEQ ID NO: 11所 示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO: 11具有至少95%同源性且与SEQ ID NO: 11功能相同的 核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的ProtoRAG转座子系统，其特征在于，所述转座子5 '末端重复序 列包括如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列或者与SEQ ID N0:8具有至少95%同源性且与SEQ ID NO:8功能相同的核苷酸序列。3. 根据权利要求1所述的ProtoRAG转座子系统，其特征在于，所述转座子3 '末端重复序 列包括SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列或者与SEQ ID N0:9具有至少95%同源性且与SEQ ID NO:9功能相同的核苷酸序列。4. 根据权利要求1所述的ProtoRAG转座子系统，其特征在于，所述转座酶辅助质粒表达 转座酶BbRAGIL和转座酶BbRAG2L，所述转座酶BbRAGIL的编码序列选自SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列中的一种，所述转座酶BbRAG2L的编码序列选自SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列中的一种。5. 根据权利要求1所述的ProtoRAG转座子系统，其特征在于，所述转座酶辅助质粒表达 转座酶BbRAGIL和转座酶BbRAG2L，所述转座酶BbRAGIL的编码序列是与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少95%同源性，且与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:6功能相同的核苷酸序列；所 述转座酶BbRAG2L的编码序列是与SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7具有至少95%同源性，且与 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7功能相同的核苷酸序列。6. 根据权利要求1所述的ProtoRAG转座子系统，其特征在于，所述转座酶辅助质粒表达 转座酶BbRAGIL和转座酶BbRAG2L，所述转座酶BbRAGIL的氨基酸序列包括SEQ ID NO: 3或 SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述转座酶BbRAG2L的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5所示 的氨基酸序列。7. 根据权利要求1所述的ProtoRAG转座子系统，其特征在于，所述转基因供体质粒是将 所述转座子5 '末端重复序列、多克隆插入位点和转座子3 '末端重复序列连入真核表达载体 pcDNA3.1而得的。8. 根据权利要求1所述的ProtoRAG转座子系统，其特征在于，所述转座酶辅助质粒是将 转座酶编码序列连入真核表达载体pcDNA3.1而得的。9. 一种采用如权利要求1-8任一所述ProtoRAG转座子系统转移基因的方法，其特征在 于，所述方法是通过所述ProtoRAG转座子系统将目的基因导入受体基因组。10. 如权利要求1-8任一所述ProtoRAG转座子系统在介导DNA导入细胞中的用途。
【文档编号】C12N15/85GK106086070SQ201610399041
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】陶鑫, 徐安龙, 黄盛丰, 元少春, 陈尚武
【申请人】中山大学