一种组蛋白去乙酰化酶基因转化杨树提高其耐盐性的方法及该基因的应用
【专利摘要】一种组蛋白去乙酰化酶基因转化杨树提高其耐盐性的方法及该基因的应用，它涉及一种提高其耐盐性的方法及该基因的应用。本发明的方法：通过PCR方法获得毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因，构建出植物表达载体，转化到根癌农杆菌中；转化到杨树中，并得到了转基因杨树株系；对转基因杨树进行PCR鉴定，即完成。该基因用于提高杨树的耐盐性。本发明对毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因研究发现，其具有很好的耐盐胁迫特性，因此，具有很好的应用价值，对杨树的耐盐胁迫具有很高的应用价值。
【专利说明】
一种组蛋白去乙酰化酶基因转化杨树提高其耐盐性的方法及 该基因的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种提高其耐盐性的方法。
【背景技术】
[0002] 盐害是农业和林业生产面临的一个急需解决的重大问题。在全球范围内，由于滥 砍乱伐、扩大耕种面积、不合理灌溉等因素造成了盐渍地面积不断扩大。通常情况下，木本 植物因有发达的根系而具有降低地下水位、防止腐蚀、改善微生态环境的功能，对土壤盐胁 迫的耐受性要高于农作物。因此，解决土壤盐渍化问题的一个十分有效的方法是进行土壤 改良、退耕还林。杨树是世界各国广泛种植的一种木本植物，不仅是造林树种，也是重要的 工业用材树种。由于其生长周期短、基因组小、可以无性繁殖等特点，已经成为木本植物研 究的模式植物。不同气候区域生长的杨树，其生理特性和对盐胁迫的耐受性也有很大的差 异。因此，提高耐盐性是培育优质和高抗杨树新品种的一个重要方法。
[0003] 组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)催化组蛋白去乙酰化，与组蛋白 乙酰基转移酶(hi stone acetyl transferase ,HAT)共同作用调节组蛋白乙酰化状态，进而 影响染色质的结构和基因的转录，在多种生命活动中具有十分重要的调控作用。HAT是将乙 酰基辅酶A上的乙酰基团转移到组蛋白的赖氨酸残基上，这种乙酰化能够减弱组蛋白与带 负电荷的DNA之间的相互作用，使染色质结构处于伸展状态;另一方面能够改变核小体表面 结构，有利于转录调节因子的结合。因此，一般认为HAT与基因的转录激活有关。而HDAC的作 用是将组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基团去除，引起染色质结构凝缩，不利于转录因子或转 录调节因子与DNA结合。因此，通常认为HDAC与基因的抑制或沉默有关。近年来，组蛋白去乙 酰化酶(HDAC)的功能研究越来越受到重视。目前，木本植物HDAC在逆境胁迫(如高盐、低温、 干旱)反应中的功能仍不清楚。对木本植物HDAC在盐胁迫反应中的功能解析，对于培育优质 和尚抗杨树新品种具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种组蛋白去乙酰化酶基因转化杨树 84K杨并提高其耐盐性的方法，利用该方法可以显著提高杨树对高盐的耐受性，而对其他性 状没有不利影响。
[0005] 本发明采用如下步骤解决上述问题：
[0006] 步骤一:通过PCR方法获得毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因，其中，PCR反应所用的引 物为：
[0007] 引物1 ：5J gctctagaatggacactggtggcaactc 3?；
[0008] 引物2:5'ggggtacctcatgacttggagaacatct 3'；
[0009] 步骤二:将步骤一得到的毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因插入到质粒PR0K2中，构建 出植物表达载体，将构建的植物表达载体转化到根癌农杆菌EHA105中；
[0010]步骤三:采用农杆菌介导法将该组蛋白去乙酰化酶基因遗传转化到杨树中，并得 到了转基因杨树株系；
[0011] 步骤四：对步骤三得到的转基因杨树叶片进行DNA提取和PCR鉴定，以及转基因杨 树叶片RNA提取和Real-time PCR鉴定，鉴定合格后，即完成所述的组蛋白去乙酰化酶基因 转化杨树提高其耐盐性的方法。
[0012] 本发明的一种组蛋白去乙酰化酶基因的应用，它用于提高杨树的耐盐性，所述的 组蛋白去乙酰化酶基因为采用上述的方法获得的，所述的组蛋白去乙酰化酶基因基因序列 如序列表Seq ID No: 1所示。
[0013] 本发明包含以下有益效果：
[0014] 采用本发明的方法处理后的杨树抗逆性生理生化分析表明：转基因杨树对高盐的 耐受性明显提高。采用300mM NaCl处理杨树，盐胁迫处理5天时，转基因杨树生长良好，而非 转基因杨树叶片出现严重的盐斑（图4)，且盐斑面积较大，甚至叶片完全枯萎（图5,图6)。 NaCl处理10天时，非转基因植株叶片几乎完全干枯，转基因杨树受盐害较轻（图7)，转基因 植株鲜重（图8)和存活率(图9)显著高于非转基因植株。这些结果表明转基因杨树对盐的耐 受性明显提尚。
[0015] 本发明对毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因研究发现，其具有很好的耐盐胁迫特性， 因此，具有很好的应用价值，对杨树的耐盐胁迫具有很高的应用价值。
【附图说明】
[0016] 图1显示了携带杨树组蛋白去乙酰化酶基因的植物表达载体图；
[0017] 图2显示了转基因杨树PCR鉴定结果图，M是DNAmar ke r，1是阳性对照（携带杨树 HDAC基因的植物表达载体），2-14是不同的转基因杨树株系，15和16是非转基因杨树，17是 阴性对照(水）；
[0018] 图3显示了转基因杨树Real-time PCR鉴定结果图，WT是非转基因杨树，1-13是不 同的转基因杨树株系；
[0019] 图4显示了转基因杨树在盐处理5天时的生长情况图，WT是非转基因杨树，Tr代表 转基因杨树；
[0020] 图5显示了在盐胁迫条件下转基因杨树和非转基因杨树不同盐害等级的叶片（可 分为0、1和2三个等级）；
[0021] 图6显示了盐胁迫条件下转基因杨树和非转基因杨树不同盐害等级叶片所占的百 分率，A为WT是非转基因杨树，B为Tr-I、C为Tr-2是不同的转基因杨树株系；
[0022]图7显示了转基因杨树在盐处理10天时的生长情况图，a是转基因杨树和非转基因 杨树在对照条件(非盐处理）下的生长情况，b是转基因杨树和非转基因杨树在盐处理条件 下的生长情况，A为WT是非转基因杨树，B为Tr-I、C为Tr-2是不同的转基因杨树株系；
[0023]图8显示了转基因杨树在盐处理10天时植株鲜重的测量结果图，A为WT是非转基因 杨树，B为Tr-I、C为Tr-2是不同的转基因杨树株系；
[0024]图9显示了转基因杨树在盐处理10天时植株的存活率图，A为WT是非转基因杨树，B 为Tr-UC为Tr-2是不同的转基因杨树株系。
【具体实施方式】
[0025]【具体实施方式】一:本实施方式的一种组蛋白去乙酰化酶基因转化杨树提高其耐盐 性的方法，它是按照以下步骤进行的：
[0026] 步骤一:通过PCR方法获得毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因，其中，PCR反应所用的引 物为：
[0027] 引物1 ：5J gctctagaatggacactggtggcaactc 3?；
[0028] 引物2:5'ggggtacctcatgacttggagaacatct 3' ；
[0029] 步骤二:将步骤一得到的毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因插入到质粒pR0K2中，构建 出植物表达载体，将构建的植物表达载体转化到根癌农杆菌EHA105中；
[0030] 步骤三:采用农杆菌介导法将该组蛋白去乙酰化酶基因遗传转化到杨树中，并得 到了转基因杨树株系；
[0031] 步骤四：对步骤三得到的转基因杨树叶片进行DNA提取和PCR鉴定，以及转基因杨 树叶片RNA提取和Real-time PCR鉴定，鉴定合格后，即完成所述的组蛋白去乙酰化酶基因 转化杨树提高其耐盐性的方法。
【具体实施方式】 [0032] 二：本实施方式与一不同的是：步骤一中PCR反应的 PCR体系如下：
[0033] 体系 用量 模板. 1 μL 引物 1(]0μιηο.Ι/Ι^ 0,4 μL 引物 2(10 μωο?τ?) Q.4 μL
[0034] HS X Buffer 2： μL Taq DNA 聚合酶 0.2 μL ddHiO .1.4 μL dNTPs 2μ1
[0035] PCR 扩增条件：94 °C 预变性 5min; 94 °C 变性 30 s，58 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 2min，30 个 循环;最后72 °C延伸IOmin。
[0036] 其它与【具体实施方式】一相同。
[0037]
【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是：步骤四中PCR鉴定的 PCR体系如下： 体系 用量 模板 1 .μL 引物 KlOpmol/L) α·4 μ1 'JI 物 2(? 0 μη?θΙ/L) 0 4 μL
[0038] 10 X BiiiTcr 2 μΙ Taq DNA 聚合酶 0,2 μL ddH^O 14 μL dNTPs 2μ1
[0039] ?0財广增条件:94°(：预变性51^11;94°(：变性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸6〇8,35个循 环;最后72 °C延伸IOmin。
[0040] 其它与【具体实施方式】一相同。
[0041] 本实施方式所用的引物如下：
[0042] 5'ggctacaccattcgaaatgtc 3'
[0043] 5，tctagcatgcccagaacttc 3'〇
[0044]
【具体实施方式】四：本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:Real-time PCR鉴定的 PCR体系如下： 体系 用量 模板 1 .μL 01 物(10 μη?θΙ/L) OJ μL
[0045] 'j I 物（丨 0 μηιοΙ/L) 0.6 μ I Q-PCR mix 10 μΙ ddH20 7,8 μL
[0046] PCR扩增条件:95°C预变性3min;95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，44个循 环。
[0047] 其它与【具体实施方式】一相同。
[0048]本实施方式所用的引物如下：
[0049] 5'gcaagccattaccaggcagagtc 3'
[0050] 5'cacttgcattctcggctattgttgt 3〇
【具体实施方式】 [0051] 五:本实施方式的一种组蛋白去乙酰化酶基因的应用，它用于提高 杨树的耐盐性，所述的组蛋白去乙酰化酶基因为采用上述的方法获得的，所述的组蛋白去 乙酰化酶基因基因序列如序列表Seq ID No: 1所示。
【具体实施方式】 [0052] 六:本实施方式与五不同的是:所述的杨树为84K杨。 其它与五相同。
[0053]本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个【具体实施方式】的组 合同样也可以实现发明的目的。
[0054] 通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0055] 实施例1
[0056]本实施例是按如下步骤进行的：
[0057] 第一步：通过PCR方法获得毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因，其编码区全长为 1506bp，PCR反应所用的引物是：
[0058] 5'gctctagaatggacactggtggcaactc 3'
[0059] 5'ggggtacctcatgacttggagaacatct 3'
[0060] 第二步:毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因克隆到PR0K2载体的多克隆位点上，并采用 冻融法将该植物表达载体转化到根癌农杆菌EHA105中；
[0061] 第三步:采用农杆菌介导法将该组蛋白去乙酰化酶基因遗传转化到杨树84K杨中。 方法是将携带该组蛋白去乙酰化酶基因的农杆菌EHA105与杨树叶片（I. 5cmX 1.5cm)共培 养2天，然后转移到含有250mg//L头孢霉素和30mg/L卡那霉素的MS培养基上进行筛选，每10 天换一次培养基，获得再生的不定芽;不定芽在含有200mg/L头孢霉素和40mg/L卡那霉素的 1/2MS培养基上再生出根，至此得到完整的转基因植株。
[0062] 第四步:对转基因植株进行PCR和real-time PCR鉴定：（1)提取转基因杨树叶片 DNA进行PCR鉴定，结果表明转基因己经整合到杨树基因组中；（2)提取转基因杨树叶片RNA 进行Real-time PCR鉴定，结果表明转基因在杨树中正常转录。PCR反应所用的引物是：
[0063] 5'ggctacaccattcgaaatgtc 3'
[0064] 5'tctagcatgcccagaacttc 3'
[0065] Real-time PCR所用的引物是：
[0066] 5'gcaagccattaccaggcagagtc 3'
[0067] 5'cacttgcattctcggctattgttgt 3
[0068]第五步:组蛋白去乙酰化酶基因转化杨树在杨树耐盐性中的应用。利用该方法得 到的转基因杨树耐盐性显著提高，其特征在于以下具体耐盐性分析，结果如图4至图9所示： [0069]采用300mM NaCI对4周龄的转基因杨树幼苗进行盐处理，分析转基因植株和非转 基因植株(对照）在盐处理5天时叶片盐斑分布情况，以及转基因植株和非转基因植株在盐 处理10天时的鲜重和存活率。
[0070] 在300mM NaCl盐处理5天时，转基因株系Tr-I和Tr-2生长良好，叶片出现的盐斑明 显少于非转基因植株。在盐处理10天时，转基因株系Tr-I和Tr-2生长良好，而非转基因植株 叶片几乎全部枯萎;盐胁迫抑制了杨树的生长，转基因株系Tr-I和Tr-2的鲜重分别减少了 12.42 %和34.15 %，而非转基因植株鲜重减少了 73.45 %。在盐胁迫处理10天时，转基因株 系Tr-I和Tr-2的存活率分别为77.78%和88.89%，而非转基因杨树的存活率仅为11.11%。 这些研究结果表明，毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因转化杨树能够显著提高杨树的耐盐性。
【主权项】
1. 一种组蛋白去乙酷化酶基因转化杨树提高其耐盐性的方法，其特征在于它是按照W 下步骤进行的： 步骤一：通过PCR方法获得毛果杨组蛋白去乙酷化酶基因，其中，PCR反应所用的引物 为： 引fg/l: 5 '邑ctcta邑aat邑邑acact邑邑t邑邑caactc 3 ' ； 弓|f&!2:5 ' 邑邑邑邑tacctcat邑actt邑邑a邑aacatct 3 ' ； 步骤二:将步骤一得到的毛果杨组蛋白去乙酷化酶基因插入到质粒PR0K2中，构建出植 物表达载体，将构建的植物表达载体转化到根癌农杆菌EHA105中； 步骤Ξ:采用农杆菌介导法将该组蛋白去乙酷化酶基因遗传转化到杨树中，并得到了 转基因杨树株系； 步骤四：对步骤Ξ得到的转基因杨树叶片进行DNA提取和PCR鉴定，W及转基因杨树叶 片RNA提取和Real-time PCR鉴定，鉴定合格后，即完成所述的组蛋白去乙酷化酶基因转化 杨树提高其耐盐性的方法。2. 根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酷化酶基因转化杨树提高其耐盐性的方法， 其特征在于步骤一中PCR反应的PCR体系如下： 体系 用量 模板 1 μ1 引物 1(10μιιιο1'υ 0 4 ul 引物 2(?0μηιο1/υ 0.4 μL 10. Bu恥r 2 μ1 Taq DNA 聚合酶 0,2 μ1 加化Ο 14 μ1 dNTPs 2μΙ PCR扩增条件:94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，30个循环； 最后72°C延伸lOmin。3. 根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酷化酶基因转化杨树提高其耐盐性的方法， 其特征在于步骤四中PCR鉴定的PCR体系如下： 体讓 用量 模板 1 μΙ 引物1(10 μ併0化） 0.4 μΙ 引物2〇0叫1〇1/1_) 0 4 μ! 10. Bunfcr 2μ1 Taq DNA聚合酶 化2 μ1 cldH：0 14 μ1 dNTPs 2μ1 PCR扩增条件:94°C预变性5min; 94°C变性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸60s，35个循环； 最后72°C延伸lOmin。4. 根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酷化酶基因转化杨树提高其耐盐性的方法， 其特征在于Real-time PCR鉴定的PCR体系如下： 体系 用量 模板 1 μ1 引物(10 μηιο!/?) 0,6 μ1 引物(ΙΟμηιοΙ/'υ 0.6 μ1 Q-PCR mix 10 μ1 ddH：0 7.8 μL PCR扩增条件:95 °C预变性3min; 95 °C变性30s，60 °C退火30s，72 °C延伸30s，44个循环。5. -种组蛋白去乙酷化酶基因的应用，其特征在于它用于提高杨树的耐盐性，所述的 组蛋白去乙酷化酶基因为采用权利要求1的方法获得的，所述的组蛋白去乙酷化酶基因基 因序列如序列表Seq ID No: 1所示。6. 根据权利要求5所述的一种组蛋白去乙酷化酶基因的应用，其特征在于所述的杨树 为84K杨。
【文档编号】C12N15/55GK106086066SQ201610716123
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月23日
【发明人】马旭俊, 夏德安, 刘春娟, 吕世博, 佟博通
【申请人】东北林业大学