一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统，属于微生物基因工程领域。本发明的恶臭假单胞菌基因敲除系统和基因组精简系统巧妙结合了自杀质粒敲除系统和位点特异性重组系统，大大提高了二轮筛选正确率，高达90％以上，在用于长达69个基因的基因簇的敲除时仍然表现出90％以上正确率。本发明实现基因簇的连续敲除，操作简便，高效，正确率高，成本低。本发明为精简优化恶臭假单胞菌基因组奠定了分子基础，有利于实现合成生物学底盘细胞的高效构建。
【专利说明】
一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统
技术领域
[0001] 本发明涉及一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统，特别是一种基于同源 重组与特异位点重组相结合的敲除系统，属于微生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 恶臭假单胞菌是一类革兰氏阴性菌，主要应用于生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)，即广 泛用于生物塑料及高附加值等医学材料的生产。为了改善菌株本身生产特性，除了常规的 代谢工程改造外，优化其基因组势在必行。从合成生物学角度出发，精简优化该菌株的基因 组是优化其作为生产底盘细胞的重要手段，因此构建一套高效、快捷、准确地基因簇连续敲 除系统显得尤为重要。
[0003] 随着恶臭假单胞菌生理学，生物化学和遗传学知识的积累，及恶臭假单胞菌全基 因组的测序，基因工程手段在精简优化其基因组中地位越来越重要，也为构建优良的恶臭 假单胞菌底盘细胞奠定了基础。从合成生物学角度出发，大范围连续地敲除其基因组上的 非必需基因簇序列是必经之路，而利用现有的恶臭假单胞菌的传统基因敲除方法就显得力 不从心。目前应用广泛的恶臭假单胞菌敲除载体为pKISmobsacB，传统的敲除质粒构建过程 中，同源臂连接到一起，进行二轮筛选，但其由于第二轮交换回复为野生型的概率非常大， 为敲除筛选带来很大麻烦，正确率很低，并且二轮筛选只能通过PCR验证，造成很高的经济 成本。这种传统的自杀质粒敲除方法不适用于恶臭假单胞菌的基因组精简。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统及其构建方法，通过 此敲除系统1)成功敲除恶臭假单胞菌KT2442基因 PP5288; 2)完成恶臭假单胞菌KT2442中基 因簇 PP3126-PP3142、PP1277-PP1290 和 PP4329-PP4397 的连续敲除。
[0005] 本发明构建的敲除系统包括：1)核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的模板质粒 PWJW101，用于扩增两端带有变异loxL/R位点的Gm抗性片段，作为二轮筛选的抗性标记;2) 核苷酸序列分别如SEQ ID N0.2、SEQ ID勵.3所示的表达质粒?1，102、？1，103，用于位点 特异性重组，其中，表达质粒PWJW102携带编码Cre重组酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因 ，Kan 抗性;表达质粒PWJW103携带编码Cre重组酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因，Gm抗性;表达质粒 PWJW102和pWJW103都是组成型表达Cre酶，强启动子PlacM用于SacB表达，用于蔗糖平板筛 选培养来丢失质粒。
[0006] 所述模版质粒pWJWl 01的构建方法包括以下步骤：
[0007] 第一步：以PBBR1MCS-5为模板，PCR扩增得到gm基因，并在其两端均引入Smal酶切 位点，经过酶切纯化后，备用；以PDTW202质粒为模板，PCR扩增得到含有loxL/R位点的线性 pBSloxL/R质粒片段，并在两端均引入Sma頂每切位点，经过酶切纯化后，备用；
[0008] 第二步:将已经处理好的gm片段和pBSloxL/R质粒片段连接，得到PWJW101。
[0009] 所述表达质粒pWJWl 02、pWJWl 03的构建方法包括以下步骤：
[0010] 第一步：以PSH47为模板，以相应引物扩增重组酶Cre可移阅读框，并在扩增片段的 5'和3'末端引入EcoRI和Xbal酶切位点，Cre片段经过EcoRI和Xbal酶切纯化后备用；以质粒 pDXW-3为模板，以相应引物扩增带有强启动子的PlacM-sacB片段，片段5'和3'末端分别引 入Xbal和SacI限制性内切酶切点，酶切纯化后备用；
[0011] 第二步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和Xba頂每切纯化的质粒 pBBRlMCS-2 连接，得到 pWJW102;
[0012] 第三步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和Xba頂每切纯化的质粒 pBBRlMCS-5 连接，得到 pWJW103。
[0013]本发明还提供一种应用上述敲除系统敲除恶臭假单胞菌KT2442的基因或基因簇 的方法，如附图4和附图5所示，分别以恶臭假单胞菌自杀质粒为例进行说明。两者所阐述的 基因敲除和基因簇敲除方法包括以下步骤：
[0014] 1)敲除质粒的构建，根据需要敲除的基因或基因簇的序列设计其同源臂，长度一 般为lOOObp左右，将同源臂扩增后酶切回收，同时扩增带有loxL/R的抗性标记基因，将上游 同源臂，抗性标记基因，下游同源臂依次连接于恶臭假单胞菌自杀质粒上，构成敲除质粒；
[0015] 2)敲除质粒的第一轮交换，制备恶臭假单胞菌感受态，将1)中敲除质粒电转入感 受态中，复苏涂布后，对长出的转化子进行蔗糖抗性筛选，有蔗糖致死的为一轮交换正确转 化子；
[0016] 3)敲除第二轮交换，将一轮交换正确转化子挑入Kan抗性LB培养基中培养12h，再 转接无抗LB培养基培养12h，即可稀释100倍涂布具有同源臂中间连接的抗性标记的抗性的 蔗糖平板，培养20h;对长出的单菌落进行抗性验证，即无出发自杀质粒自身抗性的转化子 为第二轮敲除正确转化子，并进一步通过PCR验证确定1-2个转化子即可；
[0017] 4)去除抗性标记，将第二轮敲除正确转化子制备成电转感受态，电转入表达质粒 PWJW102或pWJW103，在表达质粒相应的抗性平板培养20h，对长出的单菌落进行抗性验证， 无二轮交换抗性的单菌落为正确转化子，并进一步通过PCR验证确定1-2个转化子即可；
[0018] 5)表达质粒的去除，将抗性标记去除成功的菌落挑入LB培养基中培养12h，稀释 100倍涂布于含有15g/100mL的蔗糖平板上培养20h，对所长出的单菌落进行抗性验证，无 表达质粒抗性的单菌落为最终正确突变株，进一步PCR验证确定1-2个转化子即可。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述自杀质粒可以是pK18mobsacB或pZJD29c。
[0020] 本发明所要解决的另一个技术问题是应用所构建的基因敲除系统和基因组精简 系统 1)敲除 KT2442 中 PP5288; 2)KT2442 的基因簇 PP3126-PP3142，PP1277-PP1290 和 PP4329-PP4397的连续敲除，即KT2442的基因组精简。利用pWJWlOl和pK18mobsacB构建了PP5288的 敲除载体PWJW201，敲除了 KT2442中的PP5288;利用pDTW202和？2邛29(：分别构建了基因簇 PP3126-PP3142、PP1277-PP1290 和 PP4329-PP4397 的敲除载体 pWJW202、pWJW203 和 pWJW204， 敲除了〇2442中的基因簇？？3126-??3142、？？1277-??1290和？？4329-??4397;获得菌株 KT2442 Δ PP5288 和 KT2442 ΔΡΡ3126-ΡΡ3142;并完成 KT2442 中基因簇 PP3126-PP3142、 PP1277-PP1290和PP4329-PP4397的连续敲除，获得菌株KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-ΡΡ1290ΔΡΡ4329-ΡΡ4397。
[0021] 本发明很好地解决了传统敲除方法的弊端，首先构建了一种基于自杀质粒同源重 组与特异位点重组相结合的敲除系统。自杀质粒同源重组主要是依赖于敲除质粒与目标基 因组存在一定相同的同源DNA序列，经过同源区的配对产生一轮交换，完成敲除质粒重组到 基因组的过程;再经过二轮筛选，不仅用蔗糖复筛，同时用同源臂中间引入的抗性筛选来获 得正确敲除突变株，避免了传统的二轮交换中回复野生的重组，大大提高了正确突变的概 率。通过自杀质粒同源重组，我们在抗性标记两侧引入loxL/R位点，利用Cre/lox特异重组 系统去除抗性标记。
[0022]用于恶臭假单胞菌传统的敲除方法在第二轮交换中回复野生概率极大，突变株筛 选正确率很低，且只能通过PCR验证突变基因型。本发明构建的敲除系统同时利用自杀质粒 同源重组及带有变异loxL/R位点的位点特异性重组，结合两者优势克服传统自杀质粒敲除 系统的缺陷，可用于恶臭假单胞菌的基因敲除和基因组精简;敲除过程首先通过自杀质粒 同源重组到基因组上，然后通过蔗糖负筛和抗性标记筛选出被删除目的基因的转化子，该 步较传统方法的正确率大大提高，再通过位点特异重组去除基因组上抗性基因，操作简便 高效;可用于同一菌株中多个基因簇连续敲除;敲除完成后被改造菌株不携带任何抗性。适 用于有序精简恶臭假单胞菌的基因组。本发明在第二轮交换中尤其体现了很高的筛选优 势，正确率极高，通过菌落抗性验证即可初步筛选突变基因型，大大降低了成本。此外，本发 明敲除系统也可以实现基因簇的连续高效敲除，随着目的基因簇的增长，其正确率仍然很 高，并维持在90%以上，从而很好地实现恶臭假单胞菌KT2442的基因组精简。
【附图说明】
[0023]图1模板质粒pWJWlOl的物理图谱。
[0024] 图2表达载体pWJW102和pWJW103的物理图谱，分别为图2a和图2b所示。
[0025]图 3??5288，？？3126-??3142，？？1277-??1290和？？4329-??4397的敲除质粒 pWJW201，pWJW202，pWJW203 和 pWJW204 的物理图谱，分别为图 3a，3b，3c 和 3d。
[0026] 图4以pK18mobsacB为自杀质粒的基因敲除过程示意图。
[0027]图5以pZJD29c为自杀质粒的基因簇敲除过程示意图。
[0028]图6实施例2-4中第二轮交换平板抗性验证图。
[0029] 图7基因型验证图；a，实施例2-5中，采用本发明基因敲除和基因簇敲除系统的敲 除转化子PCR验证;图b，对照实施例2中采用pK18mobsacB传统敲除方法敲除转化子PCR验证 图。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1模板质粒pWJWlOl及表达质粒PWJW102和PWJW103的构建
[0031 ] (1)用于扩增两端有同向的loxL/R位点的Gm抗性片段的模板质粒pWJWlOl的构建： 第一步：以pBBRlMCS-5(Kovach，M.E.et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRIMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes .Gene 166，175-176( 1995) ·)为模板，以gm-F/gm-R引物对作为模板，PCR扩增得 到gm基因，并在其两端均引入Smal酶切位点，经过酶切纯化后，备用；以pDTW202(Hu J， TanY，LiY，Hu X, Xu D,ffang X. Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.Plasmid，2013，70 (3):303-313)质粒为模板，以？851 〇认4和？851〇以-1?引物作为模板，？0財广增得到含有 loxL/R位点的线性pBSloxL/R质粒片段，并在两端均引入Smal酶切位点，经过酶切纯化后， 备用。
[0032] 第二步:将已经处理好的gm片段和pBSloxL/R质粒片段连接，转化JM109,新质粒命 名为 PWJW101。
[0033]用于基因或基因簇敲除的gm盒模板扩增的引物gm-F/gm-R位于重组位点外侧，扩 增产物两端带有变异10XL/R位点的Gm抗性片段，称为gm盒，便于后续的位点特异重组。 [0034] (2)Cre重组酶和蔗糖果聚糖酶SacB表达载体pWJW102和pWJW103的构建方法，两质 粒分别为Km抗性和Gm抗性，分别用于去除敲除质粒二轮交换的Gm抗性标记和Km抗性标记。 [0035] 表达载体pWJW102和pWJW103的构建步骤如下：
[0036]第一步：以pSH47(Guldener U，Heck S，Fielder T，et al ·A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res，1996， 24( 13) :2519-2524)为模板，以引物cre-F/cre-R扩增重组酶Cre可移阅读框，并在扩增片段 的5'和3'末端引入EcoRI和Xbal酶切位点，Cre片段经过EcoRI和Xbal酶切纯化后备用；以质 |ipDXff-3(Tan Y,Xu D,LiY,ffang X.Construction of a novel sacB-based system for marker-free gene deletion in Corynebacterium glutamicum.Plasmid,2012,67(1): 44-52)为模板，以PlacM-sacB-F/sacB-R扩增带有强启动子的PlacM-sacB片段，片段5'和3' 末端分别引入Xbal和SacI限制性内切酶切点，酶切纯化后备用。
[0037] 第二步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和Xba頂每切纯化的质粒 pBBRlMCS-2(Kovach,Μ.E.et al.Four new derivatives ofthe broad-host-range cloning vector pBBRIMCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene 166,175-176(1995) ·)连接，转化JM109,新质粒定名为pWJW102〇
[0038] 第三步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和Xba頂每切纯化的质粒 pBBRlMCS-5连接，转化JM109,新质粒定名为pWJW103。
[0039] Cre/lox重组系统发现于P1噬菌体，包括重组酶和重组位点两部分，其中，Cre是隶 属于AInt酶超基因家族的重组酶，可以接到重组位点间的基因序列被删除或重组；loxp位 点是可供Cre重组酶识别作用的重组位点，当两个loxp位点位于一条DNA链上并且方向相同 时，Cre重组酶能切除两个loxp位点间的序列。loxL/loxR为突变loxp位点，两个重组位点经 过Cre酶重组后，产生一个不能再被Cre重组酶识别的位点loxL/R，该位点不再参与位点重 组。
[0040] 该实施例中所需引物序列如下表1所示。
[0041] 表1本实施例涉及的引物序列
[0042]
[0043] 实施例2恶臭假单胞菌KT2442中PP5288的敲除 [0044] 1.敲除质粒PWJW201的获得
[0045]以恶臭假单胞菌P.putidaKT2442基因组为模板，分别以相应引物扩增得到PP5288 基因的上游片段和下游片段。在上游片段的5'和3'末端分别引入EcoRI和Xbal，在下游片段 的5'和3'端分别引入BamHI和Hindm酶切位点。以pWJWlOl作为模板，以引物
[0046] gm-lox-Xbal(+)acctctagaAATACGACTCACTATAGGGCG,
[0047] gm-l〇x-BamHI(-)cgggatccGCGCAATTAACCCTCACTAAAG，
[0048] 扩增两端含有loxL/R位点的gm盒，在5'和3'末端分别引入Xbal和BamHI酶切位点。 将PP5288上游片段经过EcoRI和Xbal酶切纯化，下游片段经过BamHI和Hindlll酶切纯化，gm 盒片段经过Xbal和BamM酶切纯化，pK18mobsacB经过EcoRI和Hindlll酶切纯化，四个片段 连接，转化JM109，新的质粒即为PP5288敲除质粒，命名为pWJW201 (如附图2a);自杀质粒 pK18mobsacB可用于多种微生物基因的敲除，为Kan抗性，带有鹿糖果聚糖酶表达基因 sacB， 可降解蔗糖从而抑制细胞分裂，可用于蔗糖负筛选。
[0049] 2.敲除感受态的制备及电转化
[0050] 接种恶臭假单胞菌02442菌于1^液体培养基中，30°(：，200印111过夜培养。按2%接 种量转接50mL LB液体培养基，30°C，200rpm培养至0D6QQ = 0.7时，将培养液冰浴半小时后转 入预冷的50mL离心管中，4°C，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10%甘油洗涤3 次，最后用〇.5mL 10%甘油悬浮，每管80yL分装至预冷的无菌EP管中。
[0051 ] 将1000_5000ng敲除质粒pWJW201加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击 5ms，30°C，200rpm孵育lh，涂布30yg/mL卡那霉素的LB固体平板，30°C培养20h;
[0052] 3.敲除流程
[0053] (1)一轮交换
[0054]挑取电转转化子于含30yg/mL卡那霉素及15g/100mL蔗糖的LB固体上划线培养 20h，筛选菌周围有粘液化透明物质分泌的转化子，并PCR验证确认第一轮交换成功单菌落。 [0055] (2)二轮交换
[0056] 选取验证正确的单菌落，即pWJW201质粒通过同源臂重组与染色体交换使得整个 质粒整合到P. putidaKT2442的染色体上，接种于含30yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，30 °C培养约12h，转接至LB液体培养基中，30 °C培养12h，稀释100倍后涂布于含30yg/mL庆大霉 素和15g/100mL蔗糖的LB固体平板，30°C培养约20h;对所长出的单菌落进行Km抗性验证，即 划取50个单菌落在Km固体平板上培养20h，不生长的单菌落即为正确敲除转化子，仅有5个 转化子生长，正确率达到90%，抗性验证平板见附图6a所示，进一步PCR验证2个正确单菌 落，即P · putidaKT2442 Δ PP5288-gm。
[0057] (3)抗性标记去除
[0058]将PCR验证正确的单菌落接种含30yg/mL庆大霉素的LB液体培养基中，制备感受 态，转入PWJW102质粒，涂布于含30yg/mL卡那霉素的LB固体培养基上培养20h，挑取单菌落 验证其抗性，无 Gm抗性并PCR验证正确的转化子，即P. putidaKT2442 Δ PP5288/pWJW102。 [0059] 4.pWJW102 的去除
[0060] 将上一步验证正确的P.putidaKT2442 Δ PP5288/pWJW102单菌落挑取至LB液体培 养基中过夜培养，涂布含有15g/100mL蔗糖的固体平板，30 °C培养20h，对单菌落进行Km抗性 验证，即将单菌落划线卡那霉素的固体平板，30°C培养20h，不生长且进一步PCR验证正确的 菌落即为敲除成功的无抗目的菌株，即P.putidaKT2442 Δ PP5288。
[0061 ] 表2基因 PP5288敲除的PCR验证引物
[0062]
[0063] 结果如图7a基因型验证图：
[0064] Lane 1:PP5288U-F/PP5288D-R 引物验证 P.putidaKT2442APP5288-gm 基因型的 PCR图，结果正确；
[0065] Lane 2:PP5288U-F/PP5288D-R引物验证？411衍(^10'2442八？？5288无抗突变株基 因型的PCR图，结果正确；
[0066] Lane 3、4:PP5288-in-test-F/PP5288-in-test-R引物验证P.putidaKT2442 Δ PP5288无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
[0067] Lane 5:PP5288-in-test-F/PP5288-in_test-R引物验证P.putida KT2442野生菌 基因型的PCR图。
[0068] 对照实施例2恶臭假单胞菌KT2442中PP5288的敲除
[0069] 1 ·敲除质粒 pK18mobsacB_PP5288 的获得
[0070]以P.putidaKT2442基因组为模板，分别以相应引物扩增得到PP5288基因的上游片 段和下游片段。在上游片段的5'和3'末端分别引入EcoRI和Xbal，在下游片段的5'和3'端分 别引入Xbal和Hindlll酶切位点。将PP5288上游片段经过EcoRI和Xba頂每切纯化，下游片段 经过Xbal和Hindin酶切纯化，pK18mobsacB经过EcoRI和Hindin酶切纯化，三个片段连 接，转化JM109,新的质粒即为PP5288敲除质粒，命名为pK18mobsacB-PP5288。
[0071] 2.敲除感受态的制备及电转化
[0072]同实施例2;
[0073] 3.敲除流程
[0074] (1)一轮交换
[0075] 同实施例2;
[0076] (2)二轮交换
[0077] 选取验证正确的单菌落，即pK18mobsacB_PP5288质粒通过同源臂重组与染色体交 换使得整个质粒整合到P.putidaKT2442的染色体上，接种于含30yg/mL卡那霉素的LB液体 培养基中，30 °C培养约12h，转接至无抗LB液体培养基中，30 °C培养12h，稀释100倍后涂布于 含15g/100mL蔗糖的LB固体平板，30°C培养约20h;对所长出的单菌落进行PCR验证，验证50 个单菌落，全部为回复野生型，无正确突变型。
[0078] 表3 PP5288传统方法敲除的PCR验证引物
[0079]
[0080] 转化子PCR验证结果均如同图7b基因型验证图：
[0081 ] Lane 1-14: PP5288U-F/PP5288D-R 引物验证采用pK18mobsacB 传统敲除方法筛选 的转化子PP5288基因型的部分PCR图，结果全部为野生型大小。
[0082] 实施例3恶臭假单胞菌KT2442中基因簇PP3126-PP3142的敲除 [0083] 1.敲除质粒PWJW202的获得
[0084] 以P.putidaKT2442基因组为模板，以相应引物扩增得到PP3126-PP3142基因簇的 上游片段和下游片段。在上游片段的5'和3'末端分别引入SacI和Xbal，在下游片段的5'和 3'端分别引入BamHI和Sac頂每切位点。以pDTW202作为模板，以引物
[0085] kan-lox_XbaI(+)acctctagaAATACGACTCACTATAGGGCG，
[0086] Kan-lox-BamHI(-)cgggatccGCGCAATTAACCCTCACTAAAG,
[0087] 扩增两端含有loxL/R位点的kan盒，在5'和3'末端分别引入Xbal和Bamm酶切位 点。将PP3126-PP3142基因簇的上游片段经过SacI和Xba頂每切纯化，下游片段经过BamHI和 SacI酶切纯化，kan盒片段经过Xbal和BamHI酶切纯化，pZJD29c(Yano T, Sanders C， Catalano J,Daldal F.sacB-5-Fluoroorotic acid-pyrE-based bidirectional selection for integration of unmarked alleles into the chromosome of Rhodobacter capsulatus.Appl Environ Microbiol.2005Jun;71(6): 3014-24.)经过 SacI酶切纯化，四个片段连接，转化JM109,新的质粒即为PP3126-PP3142敲除质粒，命名为 pWJW202(如附图213)。？2邛29〇质粒为Gm抗性，也带有sacB基因，我们发现该质粒在恶臭假单 胞菌中也是不能复制的，可以用于基因敲除或基因组精简。
[0088] 2.敲除感受态制备及电转
[0089]同实施例2,仅将电转质粒换成pWJW202;
[0090] 3.敲除流程 [0091] (1)-轮交换
[0092]同实施例2;
[0093] (2)二轮交换
[0094] 选取验证正确的单菌落，即pWJW202质粒通过同源臂重组与染色体交换使得整个 质粒整合到P. putidaKT2442的染色体上，接种于含30yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，30 °C培养12h，转接LB试管培养12h，稀释100倍后涂布于含30yg/mL卡那霉素和15g/100mL蔗糖 的LB固体平板，30°C培养约20h;对所长出的单菌落进行Gm抗性验证，即划取50个单菌落在 Gm固体平板上培养20h，不生长的单菌落即为正确敲除转化子，仅4个转化子生长，正确率达 到92%，如附图6b所示，进一步PCR验证2个单菌落，正确，即P.putida ΚΤ2442ΔΡΡ3126-PP3142-kan〇
[0095] (3)抗性标记去除
[0096]将PCR验证正确的单菌落接种含30yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，制备感受 态，转入PWJW103质粒，于含30yg/mL庆大霉素的LB固体培养基上培养20h，挑取单菌落验证 其抗性，无 Km抗性并PCR验证正确的转化子，即P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142/ pffJW103〇
[0097] 4.pWJW103 的去除
[0098] 将上一步验证正确的P.putida KT2442APP3126_PP3142/pWJW103单菌落挑取至 LB液体培养基中过夜培养，涂布含有15g/100mL蔗糖的固体平板，30 °C培养20h，对单菌落进 行Gm抗性验证，即将单菌落划线庆大霉素的固体平板，30°C培养20h，不生长且进一步PCR验 证正确的菌落即为敲除成功的无抗突变株，即P.putidaKT2442APP3126-PP3142。
[0099] 表4基因簇PP3126-PP3142敲除的PCR验证引物
[0100]
[0101] 结果如图7a基因型验证图：
[0102] Lane 6 :PP3126-PP3142-test-F/PP3126-PP3142-test-R 引物验证 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142-kan基因型的PCR图，结果正确；
[0103] Lane 7 :PP3126-PP3142-test-F/PP3126-PP3142-test-R引物验证P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
[0104] Lane 8、9:PP3126-PP3142-in-test-F/PP3126-PP3142-in-test-R引物验证 P. putida KT2442 Δ PP3126-PP3142无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
[0105] Lane 10:PP3126-PP3142-in-test-F/PP3126-PP3142-in-test-R引物验证 P.putida KT2442野生菌基因型的PCR图。
[0106] 实施例4恶臭假单胞菌KT2442 Δ PP3126-PP3142中基因簇PP1277-PP1290的敲除 [0107] 1.敲除质粒PWJW203的获得
[0108] 同实施例3;仅PP1277-PP1290基因簇上游同源臂的酶切位点换作SacI和BamHI，下 游同源臂的酶切位点换作Xba I和Sac I，中间带有1 〇xL/R位点的kan盒两端酶切位点换作 BamHI和质粒如附图3c。
[0109] 2.敲除感受态制备及电转
[0110] 同实施例2,仅将电转质粒换成PWJW203。
[0111] 3.敲除流程
[0112] 同实施例3，ΚΤ2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290: : loxL-kan-loxR命名为 KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290-kan;同样挑取50个单菌落，验证其抗性，5个单 菌落生长，正确率为90%，如附图6c所示。
[0113] 4.pWJW103 的去除
[0114] 同实施例 3,〇2442&??3126-??3142&??1277-??1290:1(?171?命名为1〇'2442厶 PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290。
[0115] 表5基因簇PP1277-PP1290敲除的PCR验证引物
[0116]
[0117] 结果如图7a基因型验证图：
[0118] Lane ll:PP1277-PP1290-test-F/PP1277-PP1290-test-R引物验证P.putida KT2442APP3126-PP3142APP1277-PP1290-kan基因型的PCR图，结果正确；
[0119] Lane 12: PP1277-PP1290-test-F/PP1277-PP1290-test-R 引物验证 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
[0120] Lane 13、14:PP1277-PP1290-in-test-F/PP1277-PP1290-in-test-R 引物验证 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290无抗突变株基因型的PCR图，结果正 确；
[0121] Lane 15:??1277-?卩1290-111-七68卜卩/??1277-??1290-111-七68七-1?引物验证 P.putida KT2442野生菌基因型的PCR图。
[0122] 实施例5恶臭假单胞菌KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290中基因簇 PP4329-PP4397 的敲除
[0123] 1.敲除质粒pWJW204的获得
[0124] 同实施例质粒如附图3d。
[0125] 2.敲除感受态制备及电转
[0126] 同实施例2,仅将电转质粒换成pWJW204。
[0127] 3.敲除流程
[0128] 同实施例3，ΚΤ2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397: : loxL-kan-loxR命名为KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397-kan;同样挑 取50个单菌落，验证其抗性，4个单菌落生长，其正确率达到92 %，如附图6d所示。
[0129] 4pWJW103 的去除
[0130] 同实施例3，ΚΤ2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397: : loxL/R 命名为KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397。
[0131] 表6基因簇PP4329-PP4397敲除的PCR验证引物
[0132]
[0133] 结果如图7a基因型验证图：
[0134] Lane 16 : PP4329-PP4397-test-F/PP4329-PP4397-test-R引物验证P · putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397-kan基因型的PCR图，结果正 确；
[0135] Lane 17 : PP4329-PP4397-test-F/PP4329-PP4397-test-R引物验证P · putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397无抗突变株基因型的PCR图，结 果正确；
[0136] Lane 18、19:PP4329-PP4397-in-test-F/PP4329-PP4397-in-test-R 引物验证 P.putida KT2442 Δ PP3126-PP3142 Δ PP1277-PP1290 Δ PP4329-PP4397无抗突变株基因型 的PCR图，结果正确；
[0137] Lane 20:PP4329-PP4397-in-test-F/PP4329-PP4397-in-test-R引物验证 P.putida KT2442野生菌基因型的PCR图。
[0138] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统，其特征在于，包括：1)核苷酸序列如 SEQIDN0.1所示的模板质粒pWJW101;2)核苷酸序列分别如SEQIDN0.2、SEQIDN0.3所 示的表达质粒口1，102、?1，103;其中，表达质粒?1，102携带编码〇6重组酶和蔗糖果聚糖 酶SacB的基因，Kan抗性;表达质粒pWJW103携带编码Cre重组酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基 因，Gm抗性。2. -种构建权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统的方法，其特 征在于， 模板质粒PWJW101的构建方法包括以下步骤： 第一步：以PBBR1MCS-5为模板，PCR扩增得到gm基因，并在其两端均引入Smal酶切位点， 经过酶切纯化后，备用；以PDTW202质粒为模板，PCR扩增得到含有loxL/R位点的线性 pBSloxL/R质粒片段，并在两端均引入Sma頂每切位点，经过酶切纯化后，备用； 第二步:将已经处理好的gm片段和pBSloxL/R质粒片段连接，得到pWJWlOl; 所述表达质粒PWJW102、pWJW103的构建方法包括以下步骤： 第一步：以PSH47为模板，以相应引物扩增重组酶Cre可移阅读框，并在扩增片段的5'和 3'末端引入EcoRI和Xbal酶切位点，Cre片段经过EcoRI和Xbal酶切纯化后备用；以质粒 pDXW-3为模板，以相应引物扩增带有强启动子的PlacM-sacB片段，片段5'和3'末端分别引 入Xbal和SacI限制性内切酶切点，酶切纯化后备用； 第二步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和Xbal酶切纯化的质粒 pBBRlMCS-2 连接，得到 pWJW102; 第三步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和Xbal酶切纯化的质粒 pBBRlMCS-5 连接，得到 pWJW103。3. -种应用权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统敲除恶臭假单 胞菌的基因或基因簇的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 敲除质粒的构建，根据需要敲除的基因或基因簇的序列设计其同源臂，长度一般为 lOOObp左右，将同源臂扩增后酶切回收，同时扩增带有loxL/R的抗性标记基因，将上游同源 臂，抗性标记基因，下游同源臂依次连接于恶臭假单胞菌自杀质粒上，构成敲除质粒； 2) 敲除质粒的第一轮交换，制备恶臭假单胞菌感受态，将1)中敲除质粒电转入感受态 中，复苏涂布后，对长出的转化子进行蔗糖抗性筛选，有蔗糖致死的为一轮交换正确转化 子； 3) 敲除第二轮交换，将一轮交换正确转化子挑入Kan抗性LB培养基中培养12h，再转接 无抗LB培养基培养12h，即可稀释100倍涂布具有同源臂中间连接的抗性标记的抗性的蔗糖 平板，培养20h;对长出的单菌落进行抗性验证，即无出发自杀质粒自身抗性的转化子为第 二轮敲除正确转化子，并进一步通过PCR验证确定1-2个转化子即可； 4) 去除抗性标记，将第二轮敲除正确转化子制备成电转感受态，电转入表达质粒 PWJW102或pWJW103，在表达质粒相应的抗性平板培养20h，对长出的单菌落进行抗性验证， 无二轮交换抗性的单菌落为正确转化子，并进一步通过PCR验证确定1-2个转化子即可； 5) 表达质粒的去除，将抗性标记去除成功的菌落挑入LB培养基中培养12h，稀释100倍 涂布于含有15g/ 100mL的鹿糖平板上培养20h，对所长出的单菌落进行抗性验证，无表达质 粒抗性的单菌落为最终正确突变株，进一步PCR验证确定1-2个转化子即可。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述自杀质粒是pK18mobsacB或pZJD29c。5. -种应用权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统敲除恶臭假单 胞菌KT2442的PP5288基因的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 以自杀质粒pK18mobsacB为出发质粒，连接PP5288的同源臂和pWJWlOl中的gm盒，转 化E.coli JM109,构建PP5288敲除质粒； (2) 将（1)中PP5288敲除质粒从E. col i JM109中提取，电转化恶臭假单胞菌KT2442菌 株，涂布于含有卡那霉素的固体恢复培养基，30 °C培养约20小时； (3) 挑取平板上单菌落，即一轮转化子，进行PCR验证，选取验证正确的单菌落，进行蔗 糖平板划线培养，有明显透明粘液的菌为正确的转化子； (4) 挑取上述(3)中验证正确的一轮转化子，接到Kan抗性的LB培养基中，30 °C培养12小 时，转接LB无抗试管培养12h，稀释100倍，涂布Gm抗性的LB固体平板； (5) 挑取平板上单菌落进行PCR验证，选取验证正确的单菌落； (6) 将(5)所得菌株接种于LB液体培养基，30 °C过夜培养，并制备正确单菌落的电转感 受态； (7) 从E. co 1 i JM109中提取pWJWl02，电转入上述感受态中，30 °C培养约20小时，PCR验 证转化子，选取验证正确的单菌落； (8) 挑取平板上正确的单菌落入LB液体培养基，30 °C培养约12小时，稀释100倍涂布含 15g/100mL蔗糖的LB固体平板，30°C培养约20小时； (9) 挑取(8)中单菌落，画格子验证是否有Kan抗性，无 Kan抗性的单菌落，再经过PCR验 证，选取正确的单菌落，即为敲除无抗突变株。6. -种应用权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统敲除恶臭假单 胞菌基因簇的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 以自杀质粒pZJD29c为出发质粒，连接目的基因簇的同源臂和kan盒，转化 E.coliJM109,构建敲除质粒； (2) 将（1)中敲除质粒从E.coli JM109中提取，电转化要敲除的恶臭假单胞菌，涂布于 含有卡那霉素的固体恢复培养基，30°C培养约20小时； (3) 挑取平板上单菌落，即一轮转化子，进行PCR验证，选取验证正确的单菌落，进行蔗 糖平板划线培养，有明显透明粘液的菌正确； (4) 挑取上述(3)中验证正确的一轮转化子，接到Kan抗性的LB培养基中，30 °C培养12小 时，转接LB无抗试管培养12h，稀释100倍，涂布Kan抗性的LB固体平板； (5) 挑取平板上单菌落进行PCR验证，选取验证正确的单菌落； (6) 将上步所示菌株接种于液体培养基，30°C过夜培养，并制备正确单菌落的电转感受 态； (7) 从E. co 1 i JM109中提取pWJWl03，电转入上述感受态中，30 °C培养约20小时，PCR验 证转化子，选取验证正确的单菌落； (8) 挑取平板上正确的单菌落入LB液体培养基，30 °C培养约12小时，稀释100倍涂布含 15g/100mL蔗糖的LB固体平板，30°C培养约20小时； (9) 挑取(8)中单菌落，画格子验证是否有Kan抗性，无 Kan抗性的单菌落，再经过PCR，选 取正确的单菌落，即为敲除无抗突变株。7. 权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统在恶臭假单胞菌的基因 敲除中的应用。8. 权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统在恶臭假单胞菌的基因 组精简中的应用。
【文档编号】C12N15/78GK106086056SQ201610415109
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610415109.0, CN 106086056 A, CN 106086056A, CN 201610415109, CN-A-106086056, CN106086056 A, CN106086056A, CN201610415109, CN201610415109.0
【发明人】王小元, 王建莉, 马文渐, 林琳, 王雨舟, 王甜忆, 黄舒婷, 王雨倩, 张怡平, 孙康康, 李烨
【申请人】江南大学