专利名称：一种聚磷转基因恶臭假单胞工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种聚磷转基因恶臭假单胞工程菌及其构建方法和应用，利用该聚磷转基因恶臭假单胞工程菌可以去除生活污水中的磷。
背景技术：
无机磷酸盐通常被认为是湖泊富营养化的关键因子。因而，降低水环境中磷的浓度是控制富营养化的重要手段之一。环境中磷的去除有物理、化学以及生物法。生物尤其是微生物，去除磷的机理在于包括Escherichia coli, Pseudomonas spp.等细菌均具有积累无机磷酸盐,生成多聚磷酸盐(poly-phosphate)的能力。但是，在天然条件下，微生物聚磷能力通常比较弱，或者需要厌氧好氧交替环境才能有效聚磷。多聚磷酸盐由聚磷激酶(Poly-phosphate Kinase,PPK)催化形成。是由3 1000 多个不等的正磷酸盐通过高能磷酸键连接而成的线性多聚体。聚磷通常被认为是能量储存的一种手段，同时具有多种生理功能。有学者通过转基因手段，将聚磷酸激酶基因PPk转化到各种质粒中，过量表达聚磷激酶。携带重组有PPk基因质粒的微生物或植物能够过量的吸收环境中磷酸盐形成大量聚磷。从而用于废水中磷的去除或者利用聚磷的络合能力降低环境中重金属毒性，增加重金属的生物有效性，增加植物对重金属的耐受性，提高植物对重金属的去除能力等。通过重组质粒表达PPk基因，虽然能够过量的表达聚磷激酶，但是，质粒表达的缺点同样明显，重组质粒容易丢失。只有在抗生素胁迫下才能够相对稳定存在，由此引发实际应用成本的增加。并且高拷贝质粒对菌的生命活动造成负担。因而质粒作为载体表达PPk基因有很大的局限。另外，当前用于废水中去除磷的研究中所用表达宿主全部为E. coli。E. coli直接用于废水或自然水体磷的去除是不切实际的。虽然整合表达一定程度上解决了质粒表达的遗传不稳定的问题，同时选择环境中以及废水处理的活性污泥中的优势种恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)作为宿主，可以用于实际的废水处理。但是由于整合表达会在一定程度上导致基因拷贝数较低，进而影响基因的表达、 翻译。因此，对于基因工程菌的聚磷能力有较大的影响。为了克服该问题，将PPk基因进行串联表达。在一定程度上提高了 PPk基因在基因工程菌中的拷贝数。提高了极影工程菌的效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有较高遗传稳定性的聚磷转基因恶臭假单胞工程菌，能够高效去除废水中的磷。本发明还要解决的技术问题是提供上述聚磷转基因恶臭假单胞工程菌的构建方法。本发明最后要解决的技术问题是提供上述聚磷转基因恶臭假单胞工程菌在废水除磷中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种聚磷转基因恶臭假单胞工程菌，它是DNA整合串联表达聚磷激酶PPk基因的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。上述聚磷转基因恶臭假单胞工程菌的构建方法，它包括ppk基因的获取、载体的构建、三亲接合三大步骤，具体步骤如下(l)ppk基因的犾取(Ia)提取E. coii DH5 α总DNA，具体方法参见《环境微生物实验技术》(北京中国环境科学出版社，2004. 71-72)。(Ib)根据大肠杆菌的基因序列(Genbank登录号L03719)设计引物，①并在引物上游引物5’端加入EcoR V和Sph I，下游引物5’端加入Sal I ;②上游引物5’端加入Sal I，下游引物5’端加入Xbal I ;③上游引物5’端加入Xbal I，下游引物5’端加入Small ； ④上游引物5’端加入Smal I，下游引物5’端添加EcoR V酶切位点，以总DNA为模板，分别 PCR扩增上述ppk基因片段。(Ic)将(Ib)中扩增的4种DNA片段，分别用对应的限制性内切酶进行双酶切或者单酶切。(Id)用T4 DNA连接酶将(Ic)中的酶切产物连接。得到4段ppk基因首尾相连的 DNA片段。(2)载体的构建(2a)将步骤(Id)得到的PCR产物插入到质粒pBBRlMCS_2中，获得重组质粒 pBBRlMCS-2-4ppk ;具体为将质粒pBBRlMCS-2以及步骤(Id)得到的PCR产物经EcoR V酶切，质粒pBBRlMCS-2进行去磷酸化反应，PCR产物经磷酸化反应，在5’端加磷，然后将上述处理的PCR产物和质粒酶连反应过夜，即获得重组质粒pBBRlMCS-2-4ppk。(2b)将步骤(2a)得到的重组质粒pBBRlMCS-2_4ppk转化E. coii DH5 α进行复制。(2c)提取重组质粒pBBRlMCS-2_4ppk，作为模板，设计含有NoT I酶切位点的引物，PCR扩增含有多克隆位点上游多重启动子序列和多克隆位点下游终止子序列的片段。(2d)将步骤(2c)得到的PCR产物经Not I酶切后插入到自杀质粒pUTmini_Tn5 中，得到重组质粒pUTmini-Tn5_4ppk。(3)三亲接合(3a)将步骤(2d)得到的重组质粒pUTmini-Tn5_4ppk经电击转化到供体菌E. coli SMlO(Apir)(电击转化及感受态细胞的制备参见《分子克隆指南》3汔北京科学出版社· 2002.)。(3b)将受体菌Pseudomonas putida KT2440、步骤(3a)得到的含重组质粒的供体菌 e. coli SMlO (Apir)/pUTmini-Tn5-4ppk和辅助菌E. coli DH5 a (pRK600)，分别在 LB 培养基中培养过夜；在受体菌培养基中加入终浓度为25μ g/mL的氯霉素，在供体菌培养基中加入终浓度为10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素,在辅助菌培养基中加入终浓度为10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素。受体菌在42°C下孵育15min使其限制性系统失活。
(3c)将步骤(3b)培养后的受体菌、供体菌和辅助菌按照1:2:2的体积比三亲接合，获得聚磷转基因恶臭假单胞工程菌KT4PPK。具体为受体菌、供体菌和辅助菌按照 1:2: 2的体积比混合，6000r/min下离心5min收集菌体,用盐水重悬菌体,洗去其中的抗生素，重复两遍；然后用LB培养液重悬，涂平板，28°C下培养过夜；再挑取菌体用LB培养液重悬，稀释不同梯度浓度涂在含有LB选择培养基的平板上(分别加入25 μ g/mL的Chl 和 5 μ g/mL 的 Kan)。上述聚磷转基因恶臭假单胞工程菌在废水除磷中的应用。有益效果尽管 Jones [Jones K L, Kim S ff,Keasling J D. Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic enginnering of bacteria[J]. Metabolic Engineering, 2000, 2 ;328_338.]等通过将 ppk 基因分别连入到低拷贝和高拷贝的质粒中，表明低拷贝质粒可以减轻菌株生长的负担；并通过采用强启动子提高基因表达；低拷贝质粒也表现出较强的稳定性和维持DNA大片段的能力。但是，质粒无疑具有丢失的可能性，尤其是重组质粒增加了遗传的不稳定性，本实验室构建的表达质粒pET28a(+)-ppk尽管能够比较稳定的维持3 4代，但是，随着微生物的不断繁殖，重组质粒确实出现了丢失的情况。而DNA整合表达很大程度上提高了遗传稳定性。同时不存在由于质粒拷贝数高而影响微生物生长繁殖的情况。另外，本发明选用Pseudomonas putida 作为PPk基因的宿主菌，该菌是废水中常见的菌种，甚至可以形成优势种，且该菌本身能够用于环境污染物的处理，因而能够应用于实际污水除磷工艺中。本实验室构建的表达质粒 pET28a(+)-ppk需要IPTG诱导才能表达。而KT4PPK不需要经过诱导，因而节省成本同时可以简化污水处理工艺。此外，在4h以后，KT4PPK菌的生长量大于KT2440，是因为培养基内的营养物质因为菌株的生长被消耗影响了菌株的生长速度；另一方面，在外源性营养物下降时，聚磷能促进E. coli的生长在培养基中营养物质减少的情况下，KT4PPK利用自身合成的聚磷提供磷源和能量继续生长。KT4PPK过量合成聚磷，不但可以有效地去除水体中的磷，还可以在菌株生长的稳定期促进菌株的生长，这对于提高生物除磷的效率具有重要意义。合成废水实验表明KT4PPK菌不需要经过常规的除磷工艺中的厌氧过程，就能够大量合成聚磷。这将大大降低处理成本和控制难度。本试验获得的可以有效地去除水体中磷的KT4PPK转基因菌可应用于废水的生物除磷。
图IRT-PCR分析KT4PPK中ppk基因表达情况。图2KT4PPK细胞中聚磷含量随时间变化。图3模拟污水中磷酸盐含量随时间变化过程。图4KT4PPK及KT2440在合成废水中的生长曲线。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
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实施例I :ppk基因的犾取。提取E. coli DH5 α总DNA，具体方法参见《环境微生物实验技术》(北京中国环境科学出版社，2004. 71-72)。以Ε. coli DH5a基因组为模板，依据ppk基因DNA序列 (Genebank登录号L03719)设计引物(并分别在下面的引物的上游下游引物的5’端添加对应的限制性内切酶)，PCR扩增ppk基因用于转基因操作。正向引物5'-ATG CAG ATG GGT CA GGA AAA GCT ATA CAT-3'；反向引物5'-GGT ACC CAG GTT GTT CGA GTG ATT TGA-3'。PCR反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性30s，60°C退火45s，72 °C下延伸 2min，循环数为30。PCR所用酶是购自 TAKARA(JAPAN)的 PrimeSTAR HS DNA polymerase。扩增出大约2kb的片段。PCR所用酶是高保真酶，且产物是平滑末端。实施例2 :载体的构建。将实施例I得到的PCR产物经磷酸化反应，在5 '端加磷。质粒 pBBRlMCS-2 [Kovach, Μ. , P. Elzer, et al. (1995). " Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. " Gene 166(1) 175-176.]经 EcoR V 酶切后进行去磷酸化反应，从而避免自连。将上述处理的PCR产物(ppk)和质粒pBRlMCS-2酶连反应过夜。挑去单克隆进行测序。得到正向插入的重组质粒pBRlMCS-2-4ppk。经电击转化进入宿主E. coli DH5a进行复制。提取重组质粒pBBRlMCS-2_4ppk，作为模板，设计含有Not I 酶切位点的引物。正向引物5'-GCG GCC GCC GTT GCG TCG CGG TGCA-3' (Not I)；反向引物5'-GCG GCC GCT GAG CGG GAC TGT GGG GTT-3' (Not I)。PCR反应程序95 V预变性5min ；94 V变性30s，60 °C退火45s，72 °C下延伸
2.5min。循环数为30。PCR扩增含有多克隆位点上游多重启动子序列和多克隆位点下游终止子序列的片段。经Not I酶切后连入自杀质粒pUTmini_Tn5,得到重组质粒pUTmini-Tn5_4ppk。通过PCR扩增ppk基因，DNA测序表明，PCR所得片段含有完整的ppk基因完整的阅读框。且序列与E. coli的ppk基因序列相同。由于ppk基因含有质粒pBBRlMCS-2多克隆位点上酶切位点。只能采取单酶切的方法将PPk基因连入pBBRlMCS-2。对ppk基因进行磷酸化，对质粒进行去磷酸化。然后进行连接，有效避免质粒的自连，提高重组质粒的产量。 通过电击转化成功将重组质粒pBBRlMCS-2-4ppk转化到DH5a中。挑取单克隆测序表明PCR 产物成功插入到质粒pBBRlMCS-2的EcoR V位点。通过PCR从pBBRlMCS-2_4ppk中扩增出含有载体强启动子和终止子的PPk基因序列，将其插入pUTmini-Tn5的Not I酶切位点。挑取单克隆测序表明ppk基因成功插入到mini-Tn5转座子中到重组质粒pUTmini-Tn5_4ppk。 然后经三亲接合转化到Pseudomonas putida KT2440中并整合到Pseudomonas putida KT2440的DNA上。ppk基因受到来自质粒pBRlMCS_2上强启动子的调控能够在Pseudomonas putida KT2440中过量表达并且ppk基因且具有更高的遗传稳定性。实施例3 :三亲接合。重组质粒pUTmini-Tn5_ppk经电击转化到供体菌E. coli SMlO(Apir)(电击转化及感受态细胞的制备参见《分子克隆指南》3汔北京科学出版社.2002.)。受体菌(Pseudomonas putida KT2440)、含有相应质粒的供体菌[E. coli SMlO ( λ pir) /pUTmini-Tn5-ppk]和辅助菌 E. coli DH5 a (pRK600)分别在 LB 培养液中过夜培养。并在KT2440培养基中加入氯霉素(终浓度为25 μ g/mL)，在供体菌和辅助菌的培养基中加入终浓度为10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素。受体菌在42°C下孵育 15min使其限制性系统失活。然后在ImL的受体菌中加入2mL的供体菌和2mL的辅助菌并混合。6000r/min下离心5min收集菌体。用ImL的盐水重悬菌体，洗去其中的抗生素，重复两遍。然后用IOOyL的LB培养液重悬，涂平板。28°C下培养过夜。挑取菌体用ImL的LB 培养液重悬，稀释不同梯度浓度涂在含有LB选择培养基的平板上(分别加入25 μ g/mL的氯霉素和5 μ g/mL的卡那霉素)，得到聚磷转基因恶臭假单胞工程菌KT4PPK。实施例4 :转基因菌株中ppk基因的检测。将实施例3得到的KT4PPK以及KT2440接种到人工合成生活污水中，培养不同时间，用TRIzoI试剂(Invitrogen，美国，含3g/L的溶菌酶)提取细菌总RNA。总RNA的逆转录所使用的逆转录酶酶为Superscript II RNase H-reverse (Invitrogen,美国)，引物为 5' -TGG ATC CTT ATT CAG GTT GTT CGA GTG ATT TG-3/ 以转基因菌株的总 RNA 为模板。检测PPk基因的表达时，采用5' -GGA CAA ATC TAA CCC GCT GAS1 (正向引物)和 5' -ACG ATC AAC CTG GCC TTT AT-3'(反向引物)，PCR 扩增出 ppk 基因的 cDNA 片段， PCR条件为94°C预变性Imin，然后在94°C下变性30s，55°C退火30s，72°C延伸Imin，循环数为20。以工程菌KT4PPK以及原始菌的总RNA为模板，RT-PCR结果表明工程菌中ppk基因表达远远高于原始菌株，尤其在低循环数拷贝下原始菌株PPk基因的表达几乎不可检测。 PPk基因受到强启动子调控，可以避免厌氧过程。将KT4PPK接种到人工合成生活污水中，其不同时间PPk基因转录水平见图I。实验表明，随着时间的增加，PPk基因的转录水平得到
显著提高。实施例5 :聚磷能力分析。将原始菌株和转基因菌株接种到一定量的人工合成生活污水中，在250mL的三角烧瓶中，37°C、150r/min连续培养。然后在不同时间间隔测定细胞中聚磷的含量。细胞中聚磷用钥蓝比色法测定。从菌体中提取聚磷及前处理过程如下I)取40mL菌液6000r/min下离心15min,吸出上清液到干净试管中备用；2)向沉淀中加入ImL 5. 4%碱性高氯酸,30°C恒温培养90min,然后13000r/min离心20min，得沉淀物；3)用 ImL. 5moL/l NaCl+5mmol/L EDTA 溶液洗 13000r/min 离心 15min,重复操作 I次；4)加入0. 5mL蒸懼水抽提,6000r/min离心15min,重复操作I次；5)取上清液,加入3mL无水乙醇，12000r/min离心30min,弃上清液；6)将沉淀物烘干后加入2mL蒸馏水溶解，取出ImL作空白样，另ImL作为测试样品，加入ImL 2mol/L HC1，100°C水浴加热15min，取出后调pH值至中性；7)将样品和空白样在700nm处用钥蓝比色法测定。培养液中磷酸盐含量的测定直接在在700nm处用钥蓝比色法测定。每个试验重复3次。聚磷和溶解性磷酸盐的含量以平均值土方差表示。试验结果进行t检验。由图2表明，原始菌株中的聚磷含量在O-IOh内没有较大变化，且有轻微的降低。 工程菌中的聚磷含量则明显增加。在Ih时达到最大。聚磷最大含量是3. 053mg/g。随后， KT4PPK含有的聚磷逐渐减少。起始时两株菌聚磷含量没有明显差别(P > O. 05)。O. 5h之后，KT4PPK中的聚磷含量增加很快，明显比KT2440含聚磷的量要高的多(P < O. 01)。图3表明模拟污水中磷酸盐含量随时间变化过程，由图可知，原始菌株培养液中的磷含量轻微下降。而工程菌培养液中磷酸盐浓度则明显下降。从Oh 10h，KT4PPK菌株培养液中的磷酸盐含量下降了 90%以上。图4为KT4PPK及KT2440在合成废水中的生长曲线。由图4可见，O 7h，KT2440 和KT4PPK的生长均处于增长期，7h以后基本处于稳定期。两菌株的D6tltl值均无显著性差异 (P > O. 05)。而7 IOh时，KT4PPK比KT2440生长要快(p < O. 05)。该结果表明聚磷对于基因工程菌的生长没有造成负担，相反在稳定期，对于菌株的生长具有促进作用。
权利要求
1.一种聚磷转基因恶臭假单胞工程菌，其特征在于它是DNA整合串联表达聚磷激酶 ppk基因的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
2.权利要求I所述的聚磷转基因恶臭假单胞工程菌的构建方法，其特征在于它包括如下步骤(1)ppk基因的获取(Ia)提取 E. coli DH5 α 总 DNA ；(Ib)根据大肠杆菌的基因序列设计含有限制性内切酶位点的引物，以总DNA为模板， PCR扩增ppk基因，使目的片段的两端含有相应的限制性内切酶位点；(Ic)将扩增片段依次用不同的限制性内切酶进行双酶切；(Id)用Τ4 DNA连接酶将上述双酶切的产物连接。得到4段ppk基因首尾相连的DNA 片段；(2)载体的构建(2a)将步骤(Id)得到的酶连产物连入质粒pBBRlMCS-2中，获得重组质粒 pBBRlMCS-2-4ppk ；(2b)将步骤(2a)得到的重组质粒pBBRlMCS-2-4ppk转化E. coli DH5 α进行复制；(2c)提取重组质粒pBBRlMCS-2-4ppk，作为模板，设计引物，PCR扩增含有多克隆位点上游多重启动子序列和多克隆位点下游终止子序列的片段；(2d)将步骤(2c)得到的PCR产物插入到自杀质粒pUTmini-Tn5中，得到重组质粒 pUTmini-Tn5_4ppk ；(3)三亲接合(3a)将步骤(2d)得到的重组质粒pUTmini-Tn5_4ppk经电击转化到供体菌E. coli SMlO(Apir)；(3b)将受体菌Pseudomonas putida KT2440、步骤(3a)得到的含重组质粒的供体菌 E.coli SMlO Upir)/pUTmini-Tn5-ppk、辅助菌 Ε· coli DH5 a (pRK600)，分别在 LB 培养基中培养过夜，在受体菌培养基中加入终浓度为25μ g/mL的氯霉素，在供体菌培养基中加入终浓度为10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素,在辅助菌培养基中加入终浓度为 10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素；(3c)将步骤(3b)培养后的受体菌、供体菌和辅助菌按照1:2:2的体积比三亲接合，获得聚磷转基因恶臭假单胞工程菌KT4PPK。
3.权利要求I所述的聚磷转基因恶臭假单胞工程菌在废水除磷中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种聚磷转基因恶臭假单胞工程菌，它是DNA整合串联表达聚磷激酶ppk基因的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。本发明还公开了上述聚磷转基因恶臭假单胞工程菌的构建方法及其在废水除磷中的应用。本发明工艺简单，所得基因工程菌具有高效去磷能力。
文档编号C02F101/10GK102586163SQ20121003334
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者刘露, 杜宏伟, 杨柳燕, 武俊, 肖 琳 申请人:南京大学