一株门多萨假单胞菌MKC‑02菌株及其在废水脱氮中的应用的制作方法

本发明涉及微生物脱氮
技术领域：
，具体地，涉及一株门多萨假单胞菌MKC-02菌株及其在废水脱氮中的应用。
背景技术：
：针对水环境质量的日益恶化，水体富营养化现象日趋严重的现象，高效、快速去除水中氮素是当今水污染防治领域的一个重要课题。传统的生物脱氮技术是将硝化、反硝化两个过程独立开来，导致了脱氮过程的不连续性和效率低下，严重限制了传统生物脱氮技术的应用和发展。研究发现，一些异养硝化菌同时又具有好氧反硝化的能力，使硝化和反硝化同时进行成为可能，这极大提高了它在污水处理方面的应用价值，也为废水生物脱氮的技术研究提供了理论支持。如Alcaligenesfaecalis、Thiosphaerapantotropha和Pseudomonassp.等，它们具有生长速率快、耐高有机负荷、环境适应性强等优点，使得同步硝化反硝化能在同一反应器中进行，对于减小反应器容积，加快整个反应过程，降低运行成本具有明显的优势，因而被广泛受到人们的重视。技术实现要素：本发明为了丰富异养硝化-好氧反硝化菌株资源库，提供一株门多萨假单胞菌MKC-02菌株，该菌株是一株异养硝化-好氧反硝化菌，使硝化和反硝化同时进行成为可能，在污水处理方面具有极大的应用价值。本发明的另一个目的是提供一株门多萨假单胞菌MKC-02菌株在废水脱氮中的应用。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：一株门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)MKC-02菌株，所述菌株于2016年11月14日保藏于广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCCNo：60104，分类命名为Pseudomonasmendocina，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。本发明的门多萨假单胞菌MKC-02菌株是一株异养硝化-好氧反硝化菌，该菌株以柠檬酸钠为碳源，对水体中的氨氮、硝态氮、COD进行好氧降解，且在脱氮的过程中几乎不积累亚硝态氮，避免了二次污染因此，本发明要求保护门多萨假单胞菌MKC-02菌株在废水脱氮中的应用。本发明更进一步保护门多萨假单胞菌MKC-02菌株在同步去除废水中氨氮和COD的应用。一种废水脱氮的方法，包括如下步骤：将门多萨假单胞菌MKC-02菌株按照5～10%的接种量接种到废水中，在25～35℃、100～150r/min的条件下处理废水24～72h；所述门多萨假单胞菌MKC-02菌株于2016年11月14日保藏于广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCCNo：60104，分类命名为Pseudomonasmendocina，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。优选地，将门多萨假单胞菌MKC-02菌株按照10%的接种量接种到废水中。优选地，在30℃、120r/min的条件下处理废水48h。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的门多萨假单胞菌MKC-02菌株可有效去除生活污水中的含氮物质，24h内对氨氮、硝态氮的去除率分别为84.5%、90.8%。该生物脱氮方法属于新型生物脱氮
技术领域：
，不仅能在同一体系中同时去除氨氮、硝态氮，而且去除氨氮过程中没有硝态氮的生成，在实际应用中具有很好的应用前景。附图说明图1为异养硝化和好氧反硝化菌培养生长七天的形态特征。图2为MKC-02菌株的电镜扫描照片。图3为本发明菌株16SrDNA的系统发育树。图4为异养硝化-好氧反硝化菌的异养硝化生长和脱氮效率。图5为异养硝化-好氧反硝化菌的好氧反硝化生长和脱氮效率。图6为异养硝化-好氧反硝化菌的亚硝态氮利用特性。图7为异养硝化-好氧反硝化菌强化反应器脱氮的实验。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例中用到的培养基配方如下：LB培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，水1000mL，pH7.4～7.6。异养硝化培养基：(NH4)2SO41.0g/L，柠檬酸三钠5.20g/L，Na2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4•7H2O0.2g/L，NaCl30g/L，微量元素2mL，pH7.0～7.5。好氧反硝化培养基：KNO33.0g/L，柠檬酸三钠5.52g/L，Na2HPO42.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4•7H2O0.1g/L，微量元素2.00mL，pH7.0～7.3。亚硝态氮培养基：KNO21.0g/L，柠檬酸三钠5.4g/L，微量元素2.00mL，pH7.4～7.6。微量元素溶液：EDTA50g/L，ZnSO42.2g/L;，CaCl25.5g/L，MnCl2•4H2O5.06g/L，FeSO4•7H2O5.0g/L，(NH4)6Mo7O2•4H2O1.1g/L，CuSO4•5H2O1.57g/L，CoCl2•6H2O1.61g/L，pH值6.0。实施例1异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选，具体步骤如下：1.驯化和富集：实验污泥来自广州大坦沙污水处理厂好氧段活性污泥，取充分混合的活性污泥10g分别置于装有200mL硝化培养液和反硝化培养液的500mL锥形瓶中，放置于摇床中，设置温度为30℃，转速为120r/min，驯化以32d为一周期。每周期结束后将瓶中培养液静置片刻，倒掉上清液，再重新加入新鲜培养液各250mL进行驯化。期间检测氨氮和硝态氮的去除情况。2.分离纯化：用无菌水将1mL的驯化液梯度稀释至10-1、10-3、10-510-7，然后分别涂布在异养硝化和好氧反硝化平板培养基上，置于生化培养箱中30℃培养3d，从中挑选形态各异的单菌落，用平板划线法分别在异养硝化和好氧反硝化固体培养基上划线，然后在同一条件下培养3d。然后再挑选单菌落进行重复划线，直到获得纯菌株。3.菌株筛选：将纯化后的菌株接种至灭菌后的LB培养基中，置于摇床中在30℃、120r/min的条件下培养24h，在4000r/min条件下离心2min，收集菌体，用无菌水重悬菌体并定容至1g/L。然后按10%的接种量分别接种于装有适量异养硝化和好氧反硝化培养液的锥形瓶中，置于30℃、120r/min摇床培养，实验设3个平行，同时设置未接菌的对照组，分别于12h、24h、36h、48h、60h和72h测定培养液中NH4+-N和NO3--N的含量。从中分别选出具有硝化和反硝化功能的菌株。4.同时硝化反硝化能力的测定：将分别具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株接种至灭菌后的LB培养基中，在30℃、120r/min条件下摇床培养24h后，于4000r/min离心2min收集菌体，用无菌水重悬菌体并定容至1g/L，按10%的接种量分别接种至装有适量好氧反硝化和异养硝化培养液的锥形瓶中，置于30℃、120r/min下摇床培养，实验设3个平行，每隔12h取上清液测NO3--N和NH4+-N的含量。经过上述筛选分离后得到一株异养硝化-好氧反硝化菌株MKC-02，该菌株经生理生化测试为革兰氏阴性，不产芽孢，氧化酶试验阳性、接触酶试验阳性。SEM扫描发现，MKC-02菌体为细杆状，大小为0.6um×1.2um（见图2）。MKC-02菌株的16SrDNA序列有效长度约为1329bp，核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。将该序列输入Genbank，经Blast比对分析，结果表明该菌与PseudomonasmendocinaATCC49188的16SrDNA序列相似性较高，为99%（见图3）。经上述16SrDNA测序及生理生化实验确定MKC-02菌株为门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)MKC-02菌株，所述菌株于2016年11月14日保藏于广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCCNo：60104，分类命名为Pseudomonasmendocina，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。实施例2实施例1所述门多萨假单胞菌MKC-02菌株的生长和脱氮特性：1.将MKC-02菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体（定容至1g/L），然后按10%的接种量接种于含100mL上述异养硝化培养基的250mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养72h，分别定期取样测定上清液中NH4+-N、NH2OH、NO3--N、NO2--N、COD、TN和OD600值，NO3--N、NO2--N、NH2OH、TN、COD和OD600值和NO2--N、NO3--N、NH2OH、TN、COD和OD600值。结果见图4，根据图4的结果显示，菌株以氨氮为唯一氮源时，MKC-02菌株在经过12h的生长后进入对数期，经过很短暂的稳定期菌株进入衰亡期。在菌株生长的同时，NH4+-N下降，NH4+-N在24h时去除率最大，整个培养过程中有少量NO2--N的积累，并在培养结束时几乎全部去除。实验组和对照组相比产生了同等少量的硝态氮，可能是由于空气中菌进入培养基中将氨氮氧化成了硝态氮，基本可以推断在菌株硝化过程中没有硝态氮的产生。2.将MKC-02菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体（定容至1g/L），然后按10%的接种量接种于含100mL上述好氧反硝化培养基的250mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养72h，分别定期取样测定上清液中NO3--N、NO2--N、NH2OH、TN、COD和OD600值。结果见图5，根据图5结果显示，菌株以硝态氮为唯一氮源时，培养至24h时硝态氮降解68%。由OD600和NO3--N去除的关系可知，由于对数期菌株生长最快且细胞合成和代谢主要在这一阶段，所以好氧反硝化主要发生在对数期。在整个反硝化过程中，硝态氮的去除较快，且产生的亚硝态氮转化为羟胺的速率也较快，期间亚硝态的积累较小。3.将MKC-02菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体（定容至1g/L），然后按10%的接种量接种于含100mL的亚硝态氮培养基的250mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养72h，分别定期取样测定上清液中NO2--N、NO3--N、NH2OH、TN、COD和OD600值。结果见图6，根据图6结果显示，菌株以亚硝态氮为唯一氮源时，培养至24h时硝态氮的降解率92%，这一阶段是该菌株的对数生长期，菌株生长最快且细胞合成和代谢主要在这一阶段；此时的COD降解率为65%。培养至36h时，硝态氮和COD的降解率分别为93%、90%，此后它们的降解率基本稳定。实施例3实施例1所述的FX02菌株强化脱氮的应用实验进水水质指标见下表2。水质指标NH4+-NNO3--NCODpH范围100～120mg/L60～80mg/L1000～1200mg/L7.2～7.5实验运行条件：采用SBR反应器，上流进水模式，周期设定12h，进水时间2h，进水时同时曝气，反应时间9.25h，沉淀时间为0.5h，出水时间为0.25h，进水流量为1L/d，进气量为4.0L/min，温度为30℃左右。根据图7结果显示，反应器体系稳定后加入目标菌株MKC-02后，反应器运行至15d时基本达到稳定，稳定阶段COD的去除率为81%，氨和TN的去除率达到了85%以上，硝态氮去除率达到了90%。可见将目标菌运用的实际的废水处理中，能获得较好的污水处理效果，说明菌株MKC-02具有较好的应用前景。SEQUENCELISTING<110>暨南大学<120>一株门多萨假单胞菌MKC-02菌株及其在废水脱氮中的应用<130><160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1329<212>DNA<213>16SrDNA<400>1cagtcgagcggatgaagggagcttgctccctgatttagcggcggacgggtgagtaatgcc60taggaatctgcctggtagtgggggataacgttccgaaaggaacgctaataccgcgtacgt120cctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggat180tagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggat240gatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaa300tattggacaatgggcgaatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcacttt360aagttgggaggaagggctgctggttaataccctgcagttttgacgttaccaacagaataa420gcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcgga480attactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaagccccgggct540caacctgggaactgcatccaaaactggcgagctagagtacggtagagggtggtggaattt600cctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacc660tggactgatactgacacggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaa720acgatgtcaactagccgttggaatccttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagt780tgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgca840caagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgac900atgctgagaactttccagagatggattggtgccttcgggagctcagacacaggtgctgca960tggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaaccct1020tgtccttagttaccagcacctcgggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccgg1080aggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgct1140acaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgat1200cgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtg1260aatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatg1320ggagtgggt1329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