一种血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株及其应用的制作方法

本发明涉及一种血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株及其应用，属于副猪嗜血杆菌应用技术领域。

背景技术：

副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎等，发病率一般为10-15％，死亡率可达50％以上，给养猪业带来了巨大的经济损失，引起了人们的日益重视。该病的致病菌副猪嗜血杆菌(Hps)的血清型复杂多样，按Kieleetin.Rapp-Gbarideosn(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将Hps分为15个血清型，另有20％以上的分离株血清型不可定。已有的资料表明，Hps具有明显的地方性特征。

因副猪嗜血杆菌极易产生耐药性，所以控制该病的有效方式是疫苗接种。文献报道商业疫苗或自家苗的使用可以控制副猪嗜血杆菌的感染。但是也有使用灭活菌苗预防失败的实例，这可能是由于致病菌株与疫苗菌株血清型不同因而缺乏交叉保护。虽然交叉保护是对商品灭活疫苗的基本要求，但是菌株特异性灭活菌苗可能因为猪群中存在不止一种菌株或血清型而缺乏效力，也可能因为后来猪群中引入了新的菌株而失去效力。由于副猪嗜血杆菌血清型的多样性以及占很大比例的不能分型菌株，菌株毒力的差异，以及当前对保护性抗原和毒力因子缺乏深刻认识，还不可能有一种灭活菌苗同时对所有的致病菌株产生交叉保护力。研制具有交叉保护的疫苗是预防和控制副猪嗜血杆菌病的必然要求和大势所趋。

疫苗产品的开发除高效的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。减(弱)毒活疫苗因具有免疫效价高(可减少抗原剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗具有交叉保护性)的新技术优势，是当前多数传染病的研究热点。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种血清7型副猪嗜血杆菌HPKP-7(拉丁文学名：Haemophilus parasuis HPKP-7)天然弱毒株，该弱毒株的致病力大大减弱，适合用于制备治疗副猪嗜血杆菌病的药物。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株，其特征在于：所述血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株于2016年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学内；保藏号为CCTCC No:M2016560；该分类命名为副猪嗜血杆菌HPKP-7，拉丁文学名：Haemophilus parasuis HPKP-7。

本发明的第二个目的在于提供一种上述血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株的应用，利用血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株制备治疗副猪嗜血杆菌病的药物。

本发明的第三个目的在于提供一种治疗副猪嗜血杆菌病的药物，为利用血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株制备治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的治疗副猪嗜血杆菌病的药物，所述药物为疫苗。

作为优选，所述疫苗通过以下制备步骤获得：

1)一级种子液制备：取冻干保存的血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株接种于TSA固体平板，在温度为37℃的条件下培养18～24h；然后挑取单菌落于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下振荡培养16～18h，进行纯粹检验合格后，作为一级种子液，置2～8℃保存备用；

2)二级种子液制备：取步骤1)得到的一级种子液接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下振荡培养16～18h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子液，置2～8℃保存备用；

3)原菌液制备：取步骤2)得到的二级种子培养液，接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下振荡培养24～28h后，得到原菌液；

4)制备疫苗：在步骤3)得到的原菌液中取样，按照《中国兽药典》附录进行纯粹检验和活菌计数；然后将原菌液离心取沉淀的菌体，用无菌生理盐水重悬菌体后洗涤，经洗涤的菌体用生理盐水稀释成浓度为3×10⁷～3×10¹⁰CFU/mL的制苗菌液，将制苗菌液与佐剂混合，乳化，得到治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗，2～8℃保存备用。

其中，再优选地，步骤1)～3)中，所述振荡培养的转速均为120～180rpm。

再优选地，所述一级种子液和二级种子液的保存时间均不超过3天。

再优选地，步骤2)中，按种子液与培养基的体积比1:20，将一级种子液接种于TSB培养基中。

再优选地，步骤3)中，按种子液与培养基的体积比1:100，将二级种子液接种于TSB培养基中。

再优选地，步骤4)中，将原菌液在转速为8000～10000rpm的条件下离心10min，取沉淀的菌体。

本发明的疫苗包括但不限于水包油型疫苗、油包水型疫苗、水包油包水型疫苗，可根据需要选择佐剂；作为本发明的优选方式，步骤4)中，所述佐剂为铝胶佐剂，并将制苗菌液和铝胶佐剂以体积比4：1混合，转速5000～8000rpm的条件下乳化10～20min。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明中血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株，该弱毒株的致病力大大减弱，适合用于制备治疗副猪嗜血杆菌病的药物；

2、本发明将血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株应用于药物制备方面，制备药物时无需灭活，无需进行灭活检验，条件简单，药物的生产效率更高。

附图说明

图1为实施例1菌落的在平板上的生长形态图；

图2为实施例1显微镜下的菌落形态图；

图3为实施例1PCR扩增的凝胶电泳图；

所述提供一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒株，于2016年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学内；保藏号为CCTCC No:M2016560；该分类命名为副猪嗜血杆菌HPKP-7，拉丁文学名：Haemophilus parasuis HPKP-7。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株，所述血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株于2016年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M2016560。

将以上血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株制备治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗。

疫苗的制备方法包括以下步骤：

1)一级种子液制备：取冻干保存的血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株接种于TSA固体平板，在温度为37℃的条件下培养18～24h；然后挑取单菌落于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120～180rpm振荡培养16～18h，进行纯粹检验合格后，作为一级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天；

2)二级种子液制备：取步骤1)得到的一级种子液，按种子液与培养基的体积比1:20接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120～180rpm振荡培养16～18h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天；

3)原菌液制备：取步骤2)得到的二级种子培养液，按种子液与培养基的体积比1:100接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120～180rpm振荡培养24～28h后，得到原菌液；

4)制备疫苗：在步骤3)得到的原菌液中取样，按照《中国兽药典》附录进行纯粹检验和活菌计数；将原菌液在转速为8000～10000rpm的条件下离心10min取沉淀的菌体，用无菌生理盐水重悬菌体后洗涤，经洗涤的菌体用生理盐水稀释成浓度为3×10⁷～3×10¹⁰CFU/mL的制苗菌液，将制苗菌液与铝胶佐剂混合，转速5000～8000rpm的条件下乳化10～20min，得到治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗，2～8℃保存备用。

实施例1

副猪嗜血杆菌弱毒株的分离鉴定：

2016年从广东开平地区屠宰场采集猪扁桃体，无菌操作下，用酒精棉球擦拭整个扁桃体组织，剪一小块，用切面先接种于含体积百分比10％犊牛血清和0.1％NAD的TSA平板，37℃培养过夜。

菌落的在平板上的生长形态如图1所示，挑取在平板上生长良好，菌落形态较小，灰白色、半透明、边缘整齐、稍黏菌落，经革兰氏染色，显微镜下观察，显微镜下的菌落形态如图2所示，为呈淡红色，呈长链或短链的菌落，对可疑菌落扩大培养后进行16S rRNA的鉴定。使用的引物序列为：

上述菌株16S rRNA PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与GenBank中已知序列进行Blast比对，比对结果显示PCR获得的基因片段为822bp，基因片段的序列如序列表SEQ ID No.1所示，与已知副猪嗜血杆菌的同源性在98.4～100％，确定分离到的菌株为副猪嗜血杆菌。

将上述鉴定的副猪嗜血杆菌进行血清型PCR鉴定，引物序列：

如图3所示，经PCR扩增获得大小约为600bp的目的片段，扩增产物经测序，测序结果如序列表SEQ ID No.2所示，比对与副猪嗜血杆菌血清7型的funQ基因的同源性为100％，因此确定所分离的菌株为血清7型，最终将该菌株命名为HPKP-7。

实施例2

将实施例1得到的血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株HPKP-7进行致病力检测：

1)对豚鼠的致病力检测

以豚鼠为模式动物对分离获得的HPKP-7进行毒力检测。

豚鼠购入后观察三天，无异常情况后，随机分成十二组，每组5只，十二组隔离饲养，保持相同实验条件。

试验过程中以实施例1得到的HPKP-7通过腹腔注射进行人工感染5组豚鼠，另外6组豚鼠以副猪嗜血杆菌参考强毒株血清5型Nagasaki为对照菌株进行感染，1组豚鼠作为阴性对照，注射生理盐水，连续观察10天，观察记录豚鼠发病和死亡情况，如表1所示。

表1豚鼠的攻毒结果

试验结果显示，强毒对照组Nagasaki株接种量为1.5×10⁸、1.5×10⁹、1.5×10¹⁰、1.5×10¹¹、1.5×10¹²CFU时，均能引起试验组全部豚鼠死亡，而分离的毒株HPKP-7，在接种剂量为1.5×10⁸、1.5×10⁹、1.5×10¹⁰、1.5×10¹¹CFU时，豚鼠均未表现任何临床症状，生长状态良好，接种剂量为1.5×10¹²CFU时，有2/5的豚鼠至试验结束时解剖可见腹腔内有纤维素性渗出，但未引起死亡。

2)对仔猪的致病力检测

25日龄断奶仔猪30头，随机分成6组，每组5头，其中5头作为阴性对照，注射生理盐水，1组腹腔注射副猪嗜血杆菌Nagasaki株，4组注射HPKP-7株，连续观察10天，观察记录试验仔猪发病及死亡情况，结果如表2所示。

表2仔猪攻毒结果

试验结果显示，腹腔注射3×10⁹CFU Nagasaki株后，5头试验仔猪均发病，试验结束时死亡3头，而注射3×10⁹、3×10¹⁰、3×10¹¹CFU HPKP-7株时，仔猪均未引起发病，注射3×10¹²CFU时1头仔猪出现轻微的临床症状，未出现仔猪死亡的现象。豚鼠及仔猪攻毒试验结果证实，副猪嗜血杆菌HPKP-7致病力大大减弱。

实施例3

副猪嗜血杆菌弱毒株HPKP-7的免疫效力检测：

通过以下步骤制备疫苗：

1)一级种子液制备：取冻干保存的血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株接种于TSA固体平板，在温度为37℃的条件下培养18h；然后挑取单菌落于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养18h，进行纯粹检验合格后，作为一级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天；

2)二级种子液制备：取步骤1)得到的一级种子液，按种子液与培养基的体积比1:20接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养16h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天；

3)原菌液制备：取步骤2)得到的二级种子培养液，按种子液与培养基的体积比1:100接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养24h后，得到原菌液；

4)制备疫苗：在步骤3)得到的原菌液中取样，按照《中国兽药典》附录进行纯粹检验和活菌计数；将原菌液在转速为8000rpm的条件下离心10min取沉淀的菌体，用无菌生理盐水重悬菌体后洗涤，经洗涤的菌体用生理盐水稀释成浓度为3×10¹⁰CFU/mL的制苗菌液，将制苗菌液与铝胶佐剂以体积比4：1混合，转速8000rpm的条件下乳化20min，得到治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗，2～8℃保存备用。

将得到的治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗进行免疫保护试验：

A.对豚鼠的免疫保护试验

取豚鼠15只，随机分成3组，每组5只，试验组用上述制备的副猪嗜血杆菌疫苗肌肉注射豚鼠，2mL/只，14天后二免，2mL/只，二免14天后，攻毒对照和空白对照免疫生理盐水，对免疫组和攻毒对照组豚鼠用血清5型强毒株Nagasaki株进行攻毒，腹腔注射，1.5×10⁹CFU/只，连续观察10天，观察记录豚鼠发病和死亡情况，计算每组保护率，如表3所示。

表3疫苗免疫保护试验结果

试验结果显示，疫苗免疫组攻毒后未出现发病和死亡，而对照组5只豚鼠均发病，4只死亡，证实疫苗对强毒株具有一定的保护效率。

B.对不同血清型的交叉保护试验

因我国临床中主要流行血清4、5、12、13型副猪嗜血杆菌，所以我们对疫苗对这4个血清型的交叉保护试验进行了验证。取40只豚鼠，随机分成8组，其中4组肌肉注射副猪嗜血杆菌弱毒疫苗，2mL/只，14天后二免，2mL/只，攻毒对照组注射生理盐水，二免14天后分别用血清4、5、12、13型副猪嗜血杆菌进行攻毒，2×10⁹CFU/只，连续观察10天，观察记录豚鼠发病和死亡情况，计算每组保护率，如表4所示。

表4对不同血清型菌株攻毒的免疫保护结果

试验结果显示，制备的副猪嗜血杆菌弱毒疫苗对不同血清型均能够提供较好的交叉保护。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学 广东海大畜牧兽医研究院有限公司

<120> 一种血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株及其应用

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 822

<212> DNA

<213> 副猪嗜血杆菌HPKP-7

<400> 1

tgaccagcca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 60

atattgcrca atggggggaa ccctgatgca gccatgccgc gtgaatgaag aaggccttcg 120

ggttgtaaag ttctttcggt gangaggaag ggtggtgttt taatagaaca ctacattgac 180

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gcgagcgtta atcggaatga ctgggcgtaa agggcacgca ggcggtgact taagtgagat 300

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