一种检测猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌的二重pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种多重PCR检测方法，具体涉及一种能同时检 测猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌的二重PCR方法。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌广泛存在于养殖业发达的国家。该菌不但能引起猪急性出血性败血症、 心内膜炎、脑膜炎、关节炎、淋巴结炎、仔猪下痢、支气管炎和孕猪流产等症状，也能引起人 化脓性关节炎、中毒性休克综合症、脑膜炎、永久性耳聋后遗症[2]等，严重时导致死亡。根 据荚膜抗原的不同，可将猪链球菌分为35个血清型，其中1型、1/2型、2型、7型、9型和14 型为猪链球菌的主要血清型，我国流行的主要为2型猪链球菌。副猪嗜血杆菌为一种多形 态、非溶血性、不运动、革兰氏阴性菌，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，广泛存在于普通饲养猪 群上呼吸道，可引发猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。
[0003] 随着我国养猪模式不断向着集约化发展，猪关节肿大已经成为常见的疾病症状病 症。与散养情况不同，集约化养猪场关节肿大多与传染性疾病有关，常见的有副猪嗜血杆菌 病、关节炎型链球菌病等疾病。副嗜血杆菌在养猪场引起猪多发性浆膜炎和关节炎，主要感 染青年猪，严重的病猪四肢关节肿大，跛行，疼痛尖叫，颤抖，共济失调。关节炎也是致病性 链球菌病的主要特征之一，病猪在一肢或几处关节肿胀、疼痛、跛行，不能站立，病程2?3 周，猪关节肿大多是慢性型猪链球菌病的表现。
[0004] 目前，由猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌感染引起的猪关节病已经成为影响我国乃 至全球养猪业的一种疾病，造成巨大经济损失。我国是养猪大国，研宄副猪嗜血杆菌及猪链 球菌等导致猪关节病的混合感染病原的快速准确的检测方法对于养猪业健康发展具有重 要意义。传统的细菌分离鉴定等检测方法耗时耗力，尤其是副猪嗜血杆菌对于营养要求比 较苛刻，在实验中较难培养，同时在采样过程中分离率也较低，采用传统病原学诊断方法具 有较大难度，并且传统的血清型诊断方法有操作繁琐复杂，耗时耗力，特异性和灵敏性低等 多种不足。随着分子生物学的发展，PCR检测方法能够快速、高效的检测出病原菌。由于细 菌16SrRNA序列保守性极高，是细菌分类鉴定较为理想的靶序列，所以可用16SrRNA对副 猪嗜血杆菌进行检测；而2型猪链球菌主要的毒力因子包括：溶菌酶释放蛋白基因mrp，溶 血素sly，毒力相关基因orf2和荚膜多糖（cps2J)等，其中cps2J基因为对猪链球菌判定分 型的指标。
[0005] 多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体 系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的 PCR技术。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。所以建立检测猪链 球菌2型及副猪嗜血杆菌的二重PCR方法对于猪关节病的防治具有重要意义，可以为其防 治提供有力的技术手段。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种直接从样品中检测猪链球菌2 型和副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法。与传统PCR不同，本发明建立的二重PCR方法，既 可以准确检测病原体，还可以对病原体混合感染情况进行分析，从而掌握其发展趋势，起到 一箭双雕的效果。
[0007] 本发明从已发表的文献中分别筛选出具有副猪嗜血杆菌病原体基因型特点的保 守性基因片段16SrRNA，以及猪链球菌2型特异性基因一荚膜多糖基因cps2J，作为PCR检 测的两个基因靶点，将扩增这2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系，通过各项参 数调整优化，建立直接从样品中检测猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌的二重PCR方法。本发 明是通过以下的技术方案实现的。
[0008] 一种检测猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌的二重PCR方法，具体步骤如下：
[0009] (1)以猪链球菌2型荚膜多糖基因cps2J和副猪嗜血杆菌保守性基因片段 16SrRNA作为PCR检测靶点，合成扩增这些靶点基因的引物；
[0010] ⑵将2对引物置于一个PCR反应体系中，扩增猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌的基 因片断；
[0011] (3)通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中：
[0012] 扩增猪链球菌2型的上游引物的序列如SEQIDNO:1所示；下游引物的序列如SEQ IDNO:2所示（见表1);
[0013] 表1引物序列及PCR产物
[0014]
【主权项】
1. 一种检测猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌的二重PCR方法，其特征在于，具体步骤如 下： (1) W猪链球菌2型英膜多糖基因cps2J和副猪嗜血杆菌保守性基因片段leSrRNA作 为二重PCR检测祀点，合成扩增该些祀点基因的引物； 似将2对引物置于一个PCR反应体系中，扩增猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌的基因片 断； (3)通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中： 扩增猪链球菌2型的上游引物的序列如SEQ ID NO ;1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO ;2所示； 扩增副猪嗜血杆菌的上游引物的序列如SEQ ID NO ;3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO ;4所示。
2. 如权利要求1所述的二重PCR方法，其特征在于，步骤（2)中，PCR反应体系如下： cDNA模板lyl，2对上、下游引物各0. 5yl，PCR Mix 12. 5yl，超纯水补充至25yl ;PCR反 应条件；95°C预变性5min，进入95°C 60s，59°C Imin和72°C Imin的循环，循环35次，最后 72°C 延伸 5min。
3. 如权利要求1所述的二重PCR方法，其特征在于，对实际样品进行待测前处理时，将 具有呼吸道症状和/或关节肿大的病猪肺组织和关节液直接接种于TSB培养基中，1化后取 菌液作为提取猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌DM样品，然后进行二重PCR检测。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体为一种检测猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌的二重PCR方法。其首先从发表的文献中分别筛选出副猪嗜血杆菌保守性基因片段16SrRNA和猪链球菌2型荚膜多糖基因cps2J，作为PCR检测的两个基因靶点。然后将扩增该2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系，通过对退火温度、特异性等各项参数调整优化，建立直接从样品中一次检测猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法。该方法体系既可以准确检测病原体，还可以对病原体混合感染情况进行分析，从而掌握其发展趋势，起到一箭双雕的效果。
【IPC分类】C12Q1-04, C12R1-465, C12R1-21, C12Q1-14, C12Q1-68
【公开号】CN104531871
【申请号】CN201410833477
【发明人】朱建国, 韩少鹏, 李成之
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月23日