一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，本发明对固相萃取条件进行了优化，使得固相萃取的时间缩短、效率变高，而高效液相色谱方法分析洛美沙星对映体的浓度精度高，速度快，操作简单、成本较低；检测方法对目标化合物的线性关系好，回收率高，相对偏差小，使用的试剂低毒，使用量少，对环境友好。
【专利说明】
一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种快速高效检测水产品中洛美沙星对映体的方法。【背景技术】
[0002]洛美沙星为喹诺酮类抗菌药。对肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、志贺菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属等具有高度的抗菌活性;流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等对该品亦呈现高度敏感;对不动杆菌、铜绿假单胞菌等假单胞菌属、葡萄球菌属和肺炎球菌、溶血性链球菌等亦有一定的抗菌作用。该品通过作用于细菌细胞DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA的合成和复制而起杀菌作用。目前已在水产养殖中使用。
[0003]目前手性药物对映体的常用分离方法有结晶法、动力学方法、酶拆分法和色谱法等，这些方法应用广泛，促进了手性药物的研究和发展。然而，这些方法也存在一些不足之处，如结晶法操作繁琐、分离时间长、适用性窄，酶拆分法对酶的专一性有较高要求，分离成本较高，而色谱拆分法是目前应用最广泛的一种方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于为了解决现有结晶法检测洛美沙星对映体成本高、分离时间长，适用性窄，操作复杂，精度不高的缺陷而提供一种快速、精度高，操作简单、成本较低的检测水产品中洛美沙星对映体的方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将洛美沙星溶解并稀释配置成40-50iig/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤；2)取匀浆后的水产品置于离心管中，加入步骤1)配置的洛美沙星溶液，料液比为lg: 120-150mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，8000-12000rpm离心处理l〇-15min，取上清液，残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液备用；3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积2-3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层， 将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分2-5次洗脱，洗脱后的溶液在氮吹仪内于30_35°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCEL 0D-H手性柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-对甲氧基苯甲酸甲酯。在本技术方案中， 本发明所用的萃取方法效果好，时间短，降低了试剂的消耗量。
[0006]作为优选，步骤3)中，依次用甲醇、二对甲苯甲酰-1-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱。
[0007]作为优选，水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5-6.5%，柠檬酸铁铵的质量分数为0.4-0.7%。
[0008]作为优选，步骤3)洗脱液为含体积分数15%的甲醇溶液，过柱的流速为6-9mL/min，洗脱液流速为1.2-1.5mL/min。
[0009]作为优选，纤维素-对甲氧基苯甲酸甲酯的制备方法为:将纤维素纤维放入45-55 °C的质量分数为25-30%的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，55-85kw的功率下超声处理20-30min，然后升温至150°C，加入纤维素纤维质量10倍的对甲氧基苯甲酸甲酯，反应2-4h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。
[0010]作为优选，纤维素纤维为粘胶纤维或棉纤维。
[0011]作为优选，无水硫酸铜的加入量为水产品的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为lg水产品加入20mL。[〇〇12]作为优选，高效液相色谱的条件为:色谱柱:CHIRALCEL 0D-H;流动相:正己烷-乙醇(20:80，v/v，乙醇中含有体积比为0.4 %的冰乙酸和0.5 %的三乙胺)；流速:0.7mL/min; 检测波长:294nm;进样量:20yL;柱温:25 °C 〇
[0013]本发明的有益效果是本发明对固相萃取条件进行了优化，使得固相萃取的时间缩短、效率变高，而高效液相色谱方法分析洛美沙星对映体的浓度精度高，速度快，操作简单、 成本较低;检测方法对目标化合物的线性关系好，回收率高，相对偏差小，使用的试剂低毒， 使用量少，对环境友好。【附图说明】
[0014]图1为实施例1的色谱图。
[0015]图中，1为左洛美沙星;2为右洛美沙星。【具体实施方式】
[0016]下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步的描述。
[0017]在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
[0018]高效液相色谱仪Agilent 1200购自安捷伦(中国)科技有限公司；水浴氮吹仪WD-12购自河南天驰仪器设备有限公司；固相萃取仪HSE-12B购自天津市恒奥科技发展有限公司；固相萃取柱Waters Oasis HLB购自杭州伽钛科学仪器有限公司；冰乙酸(分析纯)、三乙胺(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;洛美沙星购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司。[〇〇19] 高效液相色谱的条件为:色谱柱:CHIRALCEL 0D-H;流动相:正己烷-乙醇(20:80， v/v，乙醇中含有体积比为0.4%的冰乙酸和0.5%的三乙胺)；流速:0.7mL/min;检测波长: 294nm;进样量:20yL;柱温:25 °C 〇
[0020] 实施例1一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将洛美沙星溶解并稀释配置成50yg/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤；2)取匀浆后的水产品置于离心管中，加入步骤1)配置的洛美沙星溶液，料液比为lg: 150mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，12000rpm离心处理15min，取上清液，残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液备用;无水硫酸铜的加入量为水产品的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为lg水产品加入20mL;3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分5次洗脱，洗脱液为含体积分数15%的甲醇溶液，洗脱液流速为1.5mL/min，洗脱后的溶液在氮吹仪内于35°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；依次用甲醇、二对甲苯甲酰-L-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为 6.5%，柠檬酸铁铵的质量分数为0.7% ;过柱的流速为9mL/min;4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-对甲氧基苯甲酸甲酯。
[0021]纤维素-对甲氧基苯甲酸甲酯的制备方法为:将粘胶纤维或棉纤维放入55°C的质量分数为30%的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，85kw的功率下超声处理30min，然后升温至 150°C，加入纤维素纤维质量10倍的对甲氧基苯甲酸甲酯，反应4h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇22] 实施例2一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将洛美沙星溶解并稀释配置成40yg/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤；2)取匀浆后的水产品置于离心管中，加入步骤1)配置的洛美沙星溶液，料液比为lg: 120mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，8000rpm离心处理lOmin，取上清液，残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液备用;无水硫酸铜的加入量为水产品的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为lg水产品加入20mL;3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积2倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分2次洗脱，洗脱液为含体积分数15%的甲醇溶液，洗脱液流速为1.2mL/min，洗脱后的溶液在氮吹仪内于30°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；依次用甲醇、二对甲苯甲酰-L-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为 5%，柠檬酸铁铵的质量分数为0.4% ;过柱的流速为6mL/min;4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-对甲氧基苯甲酸甲酯。[〇〇23]纤维素_对甲氧基苯甲酸甲酯的制备方法为:将粘胶纤维或棉纤维放入45°C的质量分数为25%的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，55kw的功率下超声处理20min，然后升温至 150°C，加入纤维素纤维质量10倍的对甲氧基苯甲酸甲酯，反应2h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇24] 实施例3一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将洛美沙星溶解并稀释配置成45iig/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤；2)取匀浆后的水产品置于离心管中，加入步骤1)配置的洛美沙星溶液，料液比为lg: 130mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，9000rpm离心处理12min，取上清液，残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液备用;无水硫酸铜的加入量为水产品的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为lg水产品加入20mL;3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分3次洗脱，洗脱液为含体积分数15%的甲醇溶液，洗脱液流速为1.3mL/min，洗脱后的溶液在氮吹仪内于33°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；依次用甲醇、二对甲苯甲酰-L-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为 5.4%，柠檬酸铁铵的质量分数为0.5% ;过柱的流速为7mL/min;4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-对甲氧基苯甲酸甲酯。[〇〇25]纤维素_对甲氧基苯甲酸甲酯的制备方法为:将粘胶纤维或棉纤维放入50°C的质量分数为28%的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，65kw的功率下超声处理24min，然后升温至 150°C，加入纤维素纤维质量10倍的对甲氧基苯甲酸甲酯，反应3h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇26]分别称取lmg左洛美沙星、右洛美沙星，置于100mL容量瓶中，用空白海水定容，超声摇匀后，实施例1的步骤经高效液相色谱仪检测后，所得色谱图示于图1。[〇〇27]洛美沙星对映体浓度在0.04mg/L-10mg/L范围内与其响应值呈良好的线性关系。 以X表示浓度，Y表示洛美沙星对映体峰面积，左洛美沙星和右洛美沙星的回归方程及相关系数分别为7=113.93叉-7.2217、1?2 = 0.9994及7 = 117.71叉-9.9342、1?2 = 0.9998。在空白海水中添加0.lmg/L、5mg/L和15mg/L这3个浓度的洛美沙星标准溶液，按本方法进行回收率实验。每个添加浓度平行操作3次，计算回收率和精密度，左洛美沙星及右洛美沙星的样品平均回收率分别为88.53 %和89.26%，日间精密度分别为分别为5.71 %和4.25%，定量限均为0?04mg/L。
【主权项】
1.一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，其特征在于，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将洛美沙星溶解并稀释 配置成40-50iig/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤；2)取匀浆后的水产品置于离心管中，加入步骤1)配置的洛美沙星溶液，料液比为lg: 120-150mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，8000-12000rpm离心处理l〇-15min，取上清 液，残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液备用；3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积2-3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层， 将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分2-5次洗脱，洗脱后的溶液 在氮吹仪内于30_35°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCEL OD-H手 性柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-对甲氧基苯甲酸甲酯。2.根据权利要求1所述的一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，其特征在于，步骤 3)中，依次用甲醇、二对甲苯甲酰-1-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃 取柱。3.根据权利要求2所述的一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，其特征在于，水杨 酸水溶液中水杨酸的质量分数为5-6.5%，柠檬酸铁铵的质量分数为0.4-0.7%。4.根据权利要求1或2所述的一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，其特征在于， 步骤3)洗脱液为含体积分数15 %的甲醇溶液，过柱的流速为6-9mL/min，洗脱液流速为1.2-1?5mL/min〇5.根据权利要求1或2或3所述的一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，其特征在 于，纤维素-对甲氧基苯甲酸甲酯的制备方法为:将纤维素纤维放入45-55°C的质量分数为 25-30%的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤 维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，55-85kw的功率下超声处理20-30min，然后升温至 150°C，加入纤维素纤维质量10倍的对甲氧基苯甲酸甲酯，反应2-4h，冷却后水洗，用醋酸中 和至中性。6.根据权利要求5所述的一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，其特征在于，纤维 素纤维为粘胶纤维或棉纤维。7.根据权利要求1或2或3所述的一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，其特征在 于，无水硫酸铜的加入量为水产品的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为1 g水产品加入20mL。8.根据权利要求1或2或3所述的一种检测水产品中洛美沙星对映体的方法，其特征在 于，高效液相色谱的条件为:色谱柱:CHIRALCEL OD-H;流动相:正己烷-乙醇(20:80，v/v，乙 醇中含有体积比为〇.4%的冰乙酸和0.5%的三乙胺)；流速:0.7mL/min;检测波长:294nm; 进样量:20yL;柱温:25°C。
【文档编号】G01N30/06GK106093236SQ201610395557
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月5日 公开号201610395557.9, CN 106093236 A, CN 106093236A, CN 201610395557, CN-A-106093236, CN106093236 A, CN106093236A, CN201610395557, CN201610395557.9
【发明人】杨立业, 欧阳小琨, 王阳光, 金如娜, 王艳飞, 卢娇
【申请人】浙江海洋大学