基于感病植株代谢组分析的植物炭疽病诊断方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于感病植株代谢组的气相色谱?质谱联用(GC?MS)分析和偏最小二乘判别分析(PLS?DA)进行植物炭疽病诊断的方法。本发明提供的炭疽病诊断方法包括样品的收集、液氮灭活、低温保存、代谢组提取、干燥、硅烷化衍生、GC?MS检测和PLS?DA模型的建立和检测等步骤。采用本发明的提取及检测方法能得到重现性较好的病原侵染植物代谢组结果，建立的PLS?DA模型可实现未显症炭疽感病样本的准确识别。本发明灵敏准确，可为移栽苗及定植后植物炭疽病的早期诊断提供有效方法，有利于实现田间炭疽病的早期防治。
【专利说明】
基于感病植株代谢组分析的植物炭疽病诊断方法
技术领域
[0001 ]本发明提供了 一种分析感病植株代谢组诊断植物炭疽病的方法，涉及代谢组学、 植物学、植物病理学仪器分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 草莓各个生长发育阶段都能被草莓炭疽菌侵染，草莓炭疽菌侵染叶片形成典型叶 部黑斑，侵染叶柄和匍匐茎产生典型的梭形病斑，侵染花和果实引起花枯和果实腐烂，侵染 根茎或者刚移栽定植的幼苗，导致根茎变色且腐烂或者芽腐，整个植株萎蔫死亡，尤其在根 上发生严重，导致草莓大量死苗现象，造成极其严重的经济损失。通过草莓种苗地区间频繁 调运而导致该病害迅速蔓延，成为制约草莓生产的重要病害之一。
[0003] 炭疽菌在草莓的潜伏侵染是很普遍的现象，当环境条件适合发病时，就会显症。草 莓生产中一般使用无性种苗繁殖，各地区间种苗的流动性也很频繁。被病原菌侵染的移栽 苗以及移栽苗上的带菌土壤是最主要的初侵染来源，当温度较低时，病原菌在被侵染的根 茎中长期潜伏不会致使植株死亡，当气温超过25°C时，高湿条件下草莓植株根茎腐烂最为 严重。经常是在苗圃时，植株通常受到侵染但不表现任何症状，而移栽到生产田后突然死 亡，引起病原菌的跨地区长距离传播，造成炭疽病区域性暴发。因此，种苗检测从源头上控 制草莓炭疽的传播，可以有效避免该病害的发生与危害，但是由于带菌种苗不显症，田间不 易观察，而且目前发展的一些检测方法对潜伏侵染的病害诊断容易产生假阴性结果，造成 炭疽菌的检测和病害控制的极大困难。
[0004] 近年来组学技术的发展已经证实了代谢组可以预测生长于不同环境中作物的重 要表型，并揭示出一些重要的代谢物的变化可为植物病害的识别提供指示，其中一些代谢 物的变化早于表观症状的产生，而且与病原种类特异相关，为病害诊断尤其是未显症之前 的早期诊断提供了重要的参考。代谢组学结合现代仪器分析技术对小分子化合物检测的高 通量性和高灵敏性与化学计量学的数据信息挖掘功能，为病害诊断中感病与健康植株的判 另IJ，以及不同病害种类的识别提供了有效的方法。目前，有关代谢组学技术在炭疽病诊断中 的应用尚未见报道，炭疽菌侵染植株的代谢组检测方法以及判别诊断方法均有待于研究确 定。本发明提供了一种分析感病植株代谢组诊断植物炭疽病的方法，可为秧苗炭疽病检测 和田间炭疽病早期诊断提供有效方法，有利于实现炭疽病的早期防治。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种分析感病植株代谢组诊断植物炭疽病的方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物样品的采集、灭活、保存，代谢组的 提取、干燥、衍生化及GC-MS检测的方法。
[0007] 所述生物样品可来源于根、茎、叶、花、果实等。
[0008] 所述采集方法为:酒精消毒剪刀后剪取植物组织2_15g(优选10g)，装在写好标记 的自封袋中；
[0009] 所述灭活处理为:将装有样品的自封袋迅速置于液氮中速冻3-5min(优选5min);
[0010] 所述保存方法为：将按上述方法采集、灭活的植物样品置于超低温冰箱保存（优 选 _80。〇〇
[0011] 本发明还同时提供了对通过上述方法获得的受病原菌侵染的植物样品进行代谢 组提取、干燥和衍生化的方法。
[0012] 所述提取方法包括以下步骤：
[0013] 1)冷冻研磨破碎:灭活后的植物样品在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎 处理，得样品粉末；
[0014] 2)代谢组提取:准确称取100.0 ± 0.5mg的植物样品粉末，准确加入1.8mL提取溶 剂，祸旋振荡l-3min(优选lmin)后，继续超声提取10-30min(优选15min);
[0015] 3)离心处理：将2)提取获得的代谢组溶液在4000-15000rpm(优选12000rpm)下离 心5-15min(优选15min)，弃沉淀，得代谢组提取液；
[0016] 所述的干燥方法为抽真空离心干燥，特点是准确移取0.6mL上清液至0.6-2mL(优 选0.6mL)离心管中，30-45°C (优选45°C)抽真空离心干燥4-8h，直至质量恒定；
[0017]所述的衍生化方法包括肟化和三甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下：
[0018] 1)吸取100yL衍生化试剂1于已离心干燥好的样品管中，封口，超声10-30min(优选 20min)，涡旋l-3min(优选lmin)溶解，稍微离心后30°C条件下肟化衍生化反应2h;
[0019] 2)吸取100yL的衍生化试剂2于样品管中，封口，超声10-30min(优选20min)，稍微 离心，37°C条件下硅烷化衍生化反应4-10h(优选6h);
[0020] 3)衍生化获得的样品在转速10000-15000r/min(优选12000r/min)下离心15min， 吸取上清液至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的代谢组样品。
[0021 ]所述提取方法步骤2)所述提取溶剂为：甲醇与超纯水混合溶液，甲醇与超纯水混 合体积比为9.5:0.5-5:5(优选8:2);
[0022] 所述的衍生化方法步骤1)所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得 的溶液，浓度为10_40mg/mL(优选20mg/mL);
[0023] 所述的衍生化方法步骤2)所述衍生化试剂2为:三甲基氯硅烷、N，0-双三甲硅基乙 酰胺、三甲基咪唑、N，0-双三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二 硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基乙酰胺中的任意一种。
[0024]此外，本发明还同时提供了一种对上述前处理方法获得的健康植物和感病植物组 织代谢组进行检测的方法，其特征是：
[0025] 选用HP-5MS毛细管柱（30m X 0.25mm X 0.25μπι);进样体积lyL;流速lmL/min;程序 升温;离子源和传输线温度分别为230°C和280°C ;氦气为载气，恒压模式;质谱EI电离源电 子能量70eV，全扫描扫描范围20-650m/z，频率0.2s/scan;溶剂延迟时间5.5min。
[0026] 此外，本发明还同时提供了一种对上述方法获得的健康植株和感病植株代谢组数 据进行定性定量数据的导出、判别分析模型的建立和检测，从而进行植物感炭疽病诊断的 方法，其特征是：
[0027]代谢组定性定量数据的导出方法为:采用GC-MS分析软件对检测结果进行代谢组 定性和定量数据的导出，在典型样品的总离子流色谱图（TIC)中，检索NIST谱库，获得色谱 峰的定性，根据硅烷化反应规律分析色谱峰的代谢物归属。对每个色谱峰选取1个目标离 子、2个参考离子，创建定量数据库，设置积分参数，从样品检测数据中导出各目标离子峰面 积，对代谢组成分进行相对定量；
[0028] 判别分析模型建立和检测为:模型建立采用SAS、The Uttscrambler?X或SPSS等软 件的PLS-DA模块，感炭疽病病样本与健康样本中，分别随机选取部分数据作为培训集，将代 谢组数据与分类变量进行PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模型。模型检测 选取未参与建模的样本数据作为检测集未知样本，计算分类变量预测值，分别分析感炭疽 病样本和健康样本检出的准确率。
[0029]判别分析模型的建立为：
[0030] 1)随机选取2/3样本的代谢组数据作为培训集，建立培训集的分类变量，1代表炭 疽感病样本，〇代表健康样本；
[0031] 2)分类变量与代谢组数据的PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模 型，模型验证采用留一法交叉验证；
[0032]所述判别分析模型的检测为：
[0033] 1)选取未参与建模的1/3样本的代谢组数据作为检测集；
[0034] 2)根据培训集建立的分类变量与代谢组数据间的PLS模型，计算检测集未知样本 的分类变量的预测值(Y^d)，具体判别方法是：
[0035] 样本的Ypred>0.5且偏差小于0.5，则判定样本为感炭疽病样本；
[0036]样本的Ypred〈0.5且偏差小于0.5，则判定样本为健康样本；
[0037]样本的偏差大于0.5，则判别不稳定。
[0038]本发明的优点是：
[0039] 1、GC_MS对代谢组检测灵敏、稳定、分析通量大。样品处理步骤简单，操作方便，处 理速度快，适用于大规模样本的处理和检测。
[0040] 2、所建立的PLS-DA判别方法对未知样本判别准确率高，可实现对未显症炭疽感病 植株与健康植株的判别区分，方法准确可靠，为移栽苗炭疽病株检测及田间早期防治提供 可靠方法。
【附图说明】
[0041 ]结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0042]图1草莓健康植株叶片样品代谢组总离子流图 [0043 ]图2感炭疽病草莓叶片样品代谢组总离子流图
[0044]图3草莓炭疽病菌侵染草莓植株与健康草莓植株代谢组PLS得分图（C12为感炭疽 病样本，CK为健康样本）
[0045]图4基于草莓炭疽病菌侵染植株和健康植株代谢组的PLS-DA校正模型样本分类变 量的PLS真实值与预测值回归图
[0046] 图5检测集中未知样本的PLS-DA模型判别结果（1)(C12为感炭疽病样本，CK为健康 样本）
[0047] 图6草莓炭疽病菌侵染草莓植株与灰葡萄孢侵染草莓植株代谢组PLS得分图（TJ为 感炭疽病样本，HM为感灰霉病样本）
[0048]图7基于草莓炭疽病菌侵染植株和灰葡萄孢侵染植株代谢组的PLS-DA校正模型样 本分类变量的PLS真实值与预测值回归图
[0049]图8检测集中未知样本的PLS-DA模型判别结果(2)(C12为感炭疽病样本，52、59为 感灰霉病样本）
【具体实施方式】
[0050] 实施例1基于GC-MS分析草莓植株代谢组对未显症感炭疽病植株和健康植株的判 别分析
[0051 ] 一、基于GC-MS分析草莓植株代谢组样品的获得和前处理
[0052] 1)草莓炭疽病菌的接种
[0053]接种前用清水洗去叶片表面的灰尘，用75%乙醇对叶片表面进行消毒处理。采用 无伤喷雾的接种方式，将25ml孢子悬浮液(浓度为105个/ml左右)均匀喷洒至草莓植株的地 上部位。接种后将种有草莓植株的花盆放入盛水托盘中，用塑料膜封口。将接种炭疽菌的草 莓植株20°C黑暗处理12h，之后放置于正常光照条件下培养。对照处理喷施清水，其它处理 相同；
[0054] 2)采集方法为:分别在接种3d、7d、14d后，酒精消毒剪刀后剪取植物组织，装在写 好标记的自封袋中；
[0055] 3)灭活处理为:将装有叶片的自封袋置于液氮中速冻5min;
[0056] 4)保存方法为:将按上述方法接种、采集、灭活的植物叶片样品置于-80°C超低温 冰箱保存。
[0057] 5)冷冻研磨:称取100.0±0.5mg的植物样品粉末于离心管中，加入1.8mL上述甲醇 与超纯水混合洛液进彳丁提取，祸旋振汤lmin后，继续超声提取20min。
[0058] 6)离心干燥:将提取获得的代谢组溶液在12000rpm下进行离心10min，
[0059] 准确移取0.6mL上清液至0.6mL离心管中，45°C抽真空离心干燥4h至质量恒定。
[0060] 7)衍生化
[00611 包括甲氧基胺盐酸盐和N，0_双三甲硅基三氟乙酰胺两步衍生化反应：
[0062] 吸取100此甲氧基胺盐酸盐溶液(溶解于吡啶中，浓度20mg/mL)于已离心干燥好的 样品管中，封口，超声15min，涡旋lmin，稍微离心后30°C衍生化反应2h;
[0063] 吸取lOOyL的N，0-双三甲硅基三氟乙酰胺至样品管中，封口，超声20min，稍微离 心，37°C衍生化反应6h。
[0064] 获得的衍生化样品在离心转速12000r/min下离心15min，吸取160yL至GC样品玻璃 管中，获得用于GC-MS检测的草莓植株代谢组样品。
[0065] 二、基于GC-MS分析草莓植株代谢组样品的检测
[0066]进行GC-MS检测，仪器型号为：气相为7890A，质谱为5975C。具体采用的检测条件 为:HP-5MS毛细管柱（30m X 0.25mm X 0.25μηι);进样体积lyL;流速lmL/min;离子源和传输线 温度分别为230°C和280°C;氦气为载气，恒压模式;质谱EI电离源电压为70eV，全扫描扫描 范围m/z 20-650，频率0·2s/scan;溶剂延迟时间5·5min。
[0067] 升温程序参数见表1:
[0068]表1色谱柱梯度升温程序参数
[0070] 经检测，健康草莓植株和感炭疽病叶片样品代谢组总离子流图如图1和图2所示。 健康植株共检测到189个峰，与NIST谱库比对，并去除重复物质后，发现草莓叶片代谢组匹 配度大于80 %的代谢物有41个，其中有机酸类有18种、糖类有12种、醇类有7种、其它类别有 4种。感病植株共检到202个峰。
[0071] 三、基于GC-MS分析草莓植株代谢组对未显症样品的炭疽病诊断判别分析
[0072] PLS-DA法是基于PLS法建立的样本分类变量与GC-MS数据间的回归模型。因此，首 先对培训集的样品进行赋值:三个采样时间获得的感草莓炭疽病样本赋值为1，健康样本赋 值为0。试验采集了35个样本，培训集与检测集的比例为2:1，使用24个样品做培训集，11个 做检测集。
[0073] 1) PLS-DA判别模型的建立与验证
[0074] 利用PLS法对校正集样本的GC-MS数据与样本的分类变量进行回归分析，建立感草 莓炭疽病植株判别分析PLS模型。如图3所示，模型能够清楚地将草莓感炭疽病组和健康组 分开，48%的X变量可以解释94%的Y变量，模型可靠性高，可以用于判别分析。
[0075] 由图4可知通过PLS回归分析建立的草莓发病情况的判别模型较好。图中两条直线 分别为模型校正结果和验证结果的回归线，两条回归线基本重合。指示变量的校正值和模 型的验证值相关系数均大于0.923;校正直线通过原点，验证直线接近于原点；模型的校正 和验证结果的均方差根（RMSE)分别为0.0335、0.1442均接近于0，偏移（0打86〇分别为 0.0022、0.0866接近于0，斜率(31〇?)分别为0.9955、0.8168接近于1，说明模型的拟合较好。 [0076] 2)PLS_DA模型对检测集样本的判别
[0077]采用建立的模型对11个未知样品进行判别，图5和表2为检测集样本中草莓感炭疽 病组与健康组的预测结果。由表2可知所有样品的预测偏差均较低，接近于0.1。1-6号样本 的Ypred都大于0.5,接近于1，判别为草莓感炭疽病样本。7-11号样本的Y pred均小于0.5,接近 于〇,被判别为健康样本。所有11个样本均获得了正确的判别，表明PLS-DA模型能很好地将 得感草莓炭疽病的样本和健康样本判别出来，样本的识别准确率达到了 1 〇〇 %。
[0078]表2PLS-DA模型对检测集中炭疽感病和健康样品判别
[0080] 实施例2基于GC-MS分析草莓植株代谢组对未显症感炭疽病和感灰霉病植株的判 别分析
[0081 ] -、基于GC-MS分析草莓植株代谢组样品的获得和前处理
[0082] 1)草莓炭疽病菌和灰葡萄孢菌的接种和采集
[0083]灰葡萄孢菌的接种:接种前用清水洗去叶片表面的灰尘，用75%乙醇对叶片表面 进行消毒处理。采用无伤喷雾的接种方式，将25ml孢子悬浮液(浓度为105个/ml左右)均匀 喷洒至草莓植株的地上部位。接种后将花盆放入盛水托盘中，用塑料膜封口。将接种灰葡萄 孢菌的草莓植株20°C黑暗处理12h，之后放置于正常光照条件下培养。对照处理喷施清水， 其他处理相同。
[0084] 2)收集方法为:分别在接种2d、5d、7d后，酒精消毒剪刀后剪取植物组织，装在写好 标记的自封袋中。
[0085]样品的灭活处理、保存、提取、离心干燥、衍生化方法同实施例1。
[0086] 草莓炭疽病菌接种方法和样品采集同实施例1。
[0087] 二、基于GC-MS分析草莓植株代谢组样品的检测
[0088]样品的检测方法同实施例1。经检测，感炭疽病植株共检到202个峰，感灰霉病植株 共检到249个峰。
[0089]三、基于GC-MS分析草莓植株代谢组对感炭疽病和灰霉病样本的判别分析 [0090] PLS-DA法是基于PLS法建立的样本分类变量与GC-MS数据间的回归模型。因此，首 先对培训集的样品进行赋值:三个采样时间获得的感草莓灰霉病样本赋值为1，三个采样时 间获得的感草莓灰霉病样本赋值为0。试验采集了 54个样本，培训集与检测集的比例为2:1， 使用36个样品做培训集，18个做检测集。
[0091] 1 )PLS-DA判别模型的建立与验证
[0092]利用PLS法对校正集样本的GC-MS数据与样本的分类变量进行回归分析，建立感草 莓炭疽病植株与感草莓灰霉病植株判别分析PLS模型。如图6所示，模型能够清楚地将接种 草莓感炭疽病植株与草莓感灰霉病植株区分开，45 %的X变量可以解释98 %的Y变量，模型 可靠性高，可以用于判别分析。
[0093]由图7可知通过PLS回归分析建立的草莓发病情况和指示变量的相关性较好。图中 两条直线分别为模型校正结果和验证的回归线，两条回归线基本重合。指示变量的校正值 和模型的验证值相关系数均大于0.953;校正直线通过原点，验证直线接近于原点；模型的 校正和验证结果的均方差根(RMSE)分别为0.0478、0.0835均接近于0，偏移(0打86〇分别为 0.0069、0.0256接近于0，斜率(31〇?)分别为0.9897、0.9703接近于1，说明模型的拟和较好。 [0094] 2)PLS_DA模型对检测集样本的判别
[0095]采用建立的模型对18个检测集样品进行判别分析，图8和表3为检测集样本中接种 草莓炭疽菌植株与接种灰葡萄孢植株的预测结果。由表3可知所有样本的预测偏差均较低， 接近于0.1。1-12号样本的Ypred都大于0.5，接近于1，判别为感灰霉病植株。13-18号样本的 Ypred均小于0.5,接近于0,被判别为感草莓炭疽病植株。所有18个样本均获得了正确的判 另IJ，表明PLS-DA模型能很好区别草莓炭疽菌病和灰霉病感病植株，样本的识别准确率达到 了 100%〇
[0096] 表3PLS-DA模型对检测集中灰霉和炭疽病样的判别
【主权项】
1. 基于感病植株代谢组分析的植物炭痘病诊断方法，包括W下步骤并依次进行:植物 样品的采集、灭活、保存，代谢组的提取、干燥、衍生化及GC-MS检测； 所述植物样品的采集方法为:酒精消毒剪刀后剪取植物组织2-15g，装在写好标记的自 封袋中； 所述灭活方法为:将装有样品的自封袋迅速置于液氮中速冻3-5min; 所述保存方法为:将按上述方法采集、灭活的植物样品置于超低溫冰箱保存； 所述代谢组提取方法包括W下步骤： 1) 冷冻研磨破碎:灭活后的植物样品在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理， 得样品粉末； 2) 代谢组提取:称取100.0 ±0.5mg的植物样品粉末，准确加入l-2mL提取溶剂，采用满 旋振荡l-3min后，继续超声提取10-30min; 3) 离屯、处理:将2)提取获得的代谢组溶液在4000-15000rpm下离屯、5-15min，弃去沉淀， 得代谢组提取液； 所述的干燥方法为:准确移取0.6血上清液至0.6-2血离屯、管中，30°C-45 °C抽真空离屯、 干燥4-化，直至质量恒定； 所述的衍生化方法包括目亏化和Ξ甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下： 1) 吸取1(Κ)化衍生化试剂1加入已离屯、干燥好的样品管中，封口，超声10-30min，满旋1- 3min，稍微离屯、后30°C条件下目亏化衍生反应化； 2) 吸取1(Κ)化的衍生化试剂2至于样品管中，封口，超声10-30min，满旋l-3min，稍微离 屯、后37°C条件下硅烷化衍生化反应4-lOh; 3) 衍生化获得的样品在转速10000-1500化/min下离屯、15min，吸取上清液至GC样品玻 璃管中，获得用于GC-MS检测的代谢组样品； 所述提取溶剂为：甲醇与超纯水混合溶液，甲醇与超纯水混合体积比为9.5:0.5-5:5; 所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于化晚获得的溶液，浓度为10-40mg/mL; 所述的衍生化试剂2为:Ξ甲基氯硅烷、N，0-双Ξ甲娃基乙酷胺、Ξ甲基咪挫、N，0-双Ξ 甲娃基Ξ氣乙酷胺、N-甲基-Ν-Ξ甲娃基Ξ氣乙酷胺、六甲基二娃胺烧、N-甲基-Ν-Ξ甲娃基 乙酷胺中的任意一种； 所述的GC-MS检测方法为：选用HP-5MS毛细管柱，程序升溫，离子源和传输线溫度分别 为230°C和280°C，采用EI电离源，全扫描范围m/z为20~650。2. 如权利要求1所述分析感病植株代谢组诊断植物炭痘病的方法，其特征在于:其中植 物样品的采集、灭活、保存方法的条件是： 所述植物样品的采集方法为:酒精消毒剪刀后剪取植物组织lOg，装在写好标记的自封 袋中； 所述灭活方法为:将装有样品的自封袋迅速置于液氮中速冻5min; 所述保存方法为:将按上述方法收集、灭活的植物样品置于-80°C冰箱保存。3. 如权利要求1所述分析感病植株代谢组诊断植物炭痘病的方法，其特征在于:其中代 谢组的提取、干燥和衍生化方法的条件是： 所述代谢组提取方法包括W下步骤： 1)冷冻研磨破碎:灭活后的植物样品在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理 Imin，得样品粉末； 2) 代谢组提取:称取100.0±0.5mg的植物样品粉末，准确加入1.8mL提取溶剂，采用满 旋振荡Imin后，继续超声提取15min; 3) 离屯、处理:将2)提取获得的代谢组溶液在120(K)rpm下离屯、15min，弃去沉淀，得代谢 组提取液； 所述的干燥方法为：准确移取0.6mL上清液至0.6mL离屯、管中，45°C抽真空离屯、干燥4- 她，直至质量恒定； 所述的衍生化方法包括目亏化和Ξ甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下： 1) 吸取1(Κ)化衍生化试剂1加入已离屯、干燥好的样品管中，封口，超声20min，满旋Imin， 稍微离屯、后30°C条件下朽化衍生化反应化； 2) 吸取1(Κ)化的衍生化试剂2至于样品管中，封口，超声20min，满旋l-3min，稍微离屯、后 37°C条件下硅烷化衍生反应化； 3) 衍生化获得的样品在转速120(K)r/min下离屯、15min，吸取上清液至GC样品玻璃管中， 获得用于GC-MS检测的代谢组样品。4. 如权利要求1述的分析感病植株代谢组诊断植物炭痘病的方法，其特征在于:其中代 谢组的提取和衍生化所用的提取溶剂和衍生化反应所用的试剂组合是： 所述提取溶剂为：甲醇与超纯水混合溶液，甲醇与超纯水混合体积比为8:2; 所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于化晚获得的溶液，浓度为20mg/mL; 所述的衍生化试剂2为:Ξ甲基氯硅烷、N，0-双Ξ甲娃基乙酷胺。5. 利用如权利要求1-4任一项所述方法获得的GC-MS检测结果进行的植物感炭痘病判 别分析方法，包括W下步骤并依次进行:代谢组定性定量数据的导出、判别分析模型的建立 和检验； 所述代谢组定性定量数据的导出方法为:采用GC-MS分析软件对检测结果进行代谢组 定性和定量数据的导出，在典型样品的总离子流色谱图（TIC)中，设置积分参数，检索NIST 谱库，获得色谱峰的定性，根据硅烷化反应规律分析色谱峰的代谢物归属。对每个色谱峰选 取1个目标离子、2个参考离子，创建定量数据库，从样品检测数据中导出各目标离子峰面 积，对代谢组成分进行相对定量； 所述判别分析模型的建立和检测为:模型建立采用SAS、The Unscrambter咳X或SPASS等 软件的化S-DA模块，感炭痘病样本与健康样本中，分别随机选取部分数据作为培训集，将代 谢组数据与分类变量进行化S分析，建立分类变量与代谢组数据的化S回归模型。模型检测 选取未参与建模的样本数据作为检测集样本，计算检测集分类变量预测值，分析感炭痘病 样本检出的准确率。6. 如权利要求5所述的利用如权利要求1-4任一项所述方法获得的GC-MS检测结果进行 的植物感炭痘病判别分析方法，其特征在于:其中判别分析模型的建立和检测方法是： 所述判别分析模型的建立为： 1) 随机选取2Λ样本的代谢组数据作为培训集，建立培训集的分类变量，1代表感炭痘 病样本，0代表健康样本； 2) 分类变量与代谢组数据的化S分析，建立分类变量与代谢组数据的化S回归模型，模 型验证采用留一法交叉验证； 所述判别分析模型的检测为： 1) 选取未参与建模的1/^3样本的代谢组数据作为检测集； 2) 根据培训集建立的分类变量与代谢组数据间的化計莫型，计算检测集未知样本的分 类变量的预测值(Ypred)，具体判别方法是： 样本的Ypred〉0.5且偏差小于0.5，则判定样本为感炭痘病样本； 样本的YprecKO . 5且偏差小于0.5，则判定样本为健康样本； 样本的偏差大于0.5，则判别不稳定。
【文档编号】G01N30/02GK106093237SQ201610395890
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日 公开号201610395890.X, CN 106093237 A, CN 106093237A, CN 201610395890, CN-A-106093237, CN106093237 A, CN106093237A, CN201610395890, CN201610395890.X
【发明人】刘鹏飞, 常旭念, 代探, 胡志宏, 陈晨, 刘子淇, 刘西莉
【申请人】中国农业大学