肺癌代谢标志物在肺癌诊断和治疗中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学诊断学技术领域，具体涉及肿瘤的诊断领域。
【背景技术】
[0002] 癌症仍然是对人类健康的最致命威胁之一。实体瘤对大多数上述死亡负有责任。 虽然某些癌症的医学治疗中已经取得了重大进步，但是所有癌症的总体5年存活率在最近 20年里只改进了约10%。癌症（或称作恶性肿瘤）以不受控制的方式快速生长和转移，使 得及时检测和治疗极端困难。近30年来，随着大气污染和吸烟等外部因素的影响，我国肺 癌发病率也日趋增_，在上海、北点和天津等的确，占各种恶性肿瘤的首位。而治疗的如提 又基于对诊断的明确，肺癌的早期诊断是一项艰巨而重大的任务。
[0003] 目前对肺癌的诊断方法可以分为两类，一种为无创诊断，主要包括影像学检查和 痰液细胞学检查，另一类是有创诊断，主要为气管镜检查和外科诊断方法。其中影像学检查 主要为X射线、CT、MRI等。而外科诊断方法包括支气管活检（TBLB)、经皮穿刺（NB)、纵膈 镜检查、电视胸腔镜以及淋巴结活检等。虽然，最近有研究发现超氧化歧化酶、单胺氧化酶 联合酶检测对肺癌诊断有一定意义，肺癌患者血清S0D活性明显低于肺良性病变及正常健 康人，但是由于其评价指标单一，准确性低，需要结合其他指标进行诊断。肺癌作为严重危 害人类健康和生命的恶性肿瘤，筛选出具有肺癌早期诊断和预后判断价值的新型肿瘤代谢 标志物，用于肺癌患者的早期诊断和治疗，从而提高肺癌患者的生存率是肺癌诊断和治疗 过程中亟待解决的。
【发明内容】
[0004] 本申请的目的在于提供一种肺癌早期诊断以及术后愈后效果评价的的血液检测 方法。
[0005] 本申请研究方案：
[0006] (1)肺癌数据库建立、样品采集处理与检测
[0007] ①建立和整理肺癌病人以及健康对照人群的血样标本库；
[0008] ②建立肺癌术后随访系统和随访数据库，收集和整理病人的病理档案、术后治疗 方案及效果、术后生存情况等数据；
[0009] ③样品采集及与处理：收集健康正常体检者和肺癌患者手术前及术后7天空腹 血标本各5ml于无菌促凝BD真空采血管中，2500r/min，4°C离心5min，取上层血清，保存 于-80°C冰箱中待用。
[0010] ④LC-Q-T0F/MS检测
[0011] ⑤GC/MS检测
[0012] ⑵研究肺癌病人血清代谢标志物与肺癌诊断及疗效监测的关系
[0013]①运用主成分分析（PCA)、最小二乘判别分析（PLS-DA)和正交最小二乘分析 (0PLS)等多变量统计方法对数据进行分析；
[0014] ②差异性代谢产物的挖掘及鉴定；
[0015] ③血清代谢标志物与肺癌诊断及疗效监测的关系。
【附图说明】
[0016]图1 :正常对照组（a)、肺癌术前组（b)和肺癌术后组（c)高效液相色谱-四级 杆-飞行时间质谱分析（LC-Q-T0F/MS)总尚子流图
[0017] 图2 :正常对照组（a)、肺癌术前组（b)和肺癌术后组（c)气相色谱-质谱分析 (GC/MS)总离子流图
[0018] 图3 :基于高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（LC-Q-T0F/MS)的正常对照组 (A)、肺癌术前组（B)和肺癌术后组（C)主成分分析（PCA)得分图
[0019] 图4 :基于高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（LC-Q-T0F/MS)的正常对照组 (A)、肺癌术前组（B)和肺癌术后组（C)最小二乘判别分析（PLS-DA)得分图
[0020] 图5 :基于高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（LC-Q-T0F/MS)的正常对照组 (A)、肺癌术前组（B)和肺癌术后组（C)正交最小二乘分析（0PLS)得分图
[0021]图6 :基于气相色谱-质谱（GC/MS)的正常对照组（A)、肺癌术前组⑶和肺癌术 后组（C)主成分分析（PCA)得分图
[0022] 图7 :基于气相色谱-质谱（GC/MS)的正常对照组（A)、肺癌术前组⑶和肺癌术 后组（C)最小二乘判别分析（PLS-DA)得分图
[0023] 图8 :基于气相色谱-质谱（GC/MS)的正常对照组（A)、肺癌术前组⑶和肺癌术 后组（C)正交最小二乘分析（0PLS)得分图
[0024] 图9 :基于高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（LC-Q-T0F/MS)的正常对照组 (A)、肺癌术前组（B)和肺癌术后组（C)的差异最大代谢标志物箱式图
[0025]图10 :基于气相色谱-质谱（GC/MS)的正常对照组（A)、肺癌术前组⑶和肺癌术 后组（C)的差异最大代谢标志物箱式图
【具体实施方式】
[0026] 实验例：
[0027] 1、一般资料：2012年1月至2013年1月在湖州市中心医院经病理学或细胞学确 诊的肺癌患者30例，年龄43-76岁，平均63. 9岁；其中男21例，女9例；腺癌15例，鳞癌 12例，大细胞肺癌3例。对照组30例，均为湖州市内健康正常体检者，年龄39-78岁，平均 60.4岁；其中男19例，女11例。本研究经湖州市中心医院伦理委员会批准，所有受检者均 知情同意参加此项研究。
[0028] 2、标本采集：收集健康正常体检者和肺癌患者手术前空腹血标本各5ml于无菌促 凝BD真空采血管中，2500r/min，4°C离心5min，取上层血清，保存于-80°C冰箱中待用。
[0029] 3、LC-Q-T0F/MS血清样本预处理：将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取 100yL的样本加入300yL甲醇，涡漩震荡30s，4°C静置20min;所有样本进行冷冻离心 (12000r/min，4°C，15min)，取200iiL上清液，转入进样小瓶，进行LC-Q-T0F/MS检测分析。
[0030]4、GC/MS血清样本预处理：将低温保存的血清样本置室温下解冻，取100i!L的样 本加入300iiL冷HPLC级乙醇，涡漩震荡30s，4°C静置20min，冷冻离心。加入80iiL冰冷 HPLC级甲醇，涡漩震荡30s。取出后，冷冻离心（12000rpm，4°C，15min)，取150iiL上清液， 转入玻璃衍生小瓶，加入10UL的内标溶液（二氯苯丙氨酸，浓度为0. 02mg/mL)，置4°C温 和氮气下吹干；向玻璃衍生小瓶中加入30yL的20mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，强烈震荡 30s，于37°C肟化反应90min;取出后加入30iiL的BSTFA(含1 %TMCS)的衍生试剂，于70°C 反应60min。取出样本，室温放置30min，进行GC/MS代谢组学分析。
[0031 ] 5、液相/质谱（LC-MS)分析条件：采用高效液相-四级杆-飞行时间质谱 (Agilent, 1290InfinityLC，6530UHDandAccurate-MassQ-T0F/MS)技术分析肺癌患者和 健康正常体检者血清代谢图谱。
[0032] (1)色谱条件：AgilentC1S 色谱柱（lOOmmX2. 1mm，1. 8iim),流速 0? 4ml/min,柱 温为40°C，流动相A:0. 1 %甲酸-水，B:0. 1 %甲酸-乙腈，进样量为4yl，自动进样器温度 4°C。梯度洗脱程序见表1。
[0033] 表1色谱梯度洗脱程序
[0034]
[0035] (2)质谱条件：ESI离子源，采用正离子扫描模式，以氮气作为雾化、锥孔气。毛细 管电压4kV、锥孔电压35kV、离子源温度KKTC;脱溶剂气温度350°C、反向锥孔气流50L/h、 脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4V。离子扫描时间0. 03s，扫描时间间隔0. 02s，数据采集范围： 50-1000m/z〇
[0036] 6、气相/质谱（GC/MS)分析条件：采用气相色谱-质谱（Agilent7890A/5975CGC/ MS)技术分析肺癌患者和健康正常体检者血清代谢图谱。毛细管色谱柱为AgilentJ&W Scientific公司的HP-5ms(30mX0. 25mmX0. 25urn)。仪器参数设定为：进样 口温度 280°C， EI离子源温度230°C，四极杆温度150°C，高纯氦气（纯度大于99. 999% )作为载气，不分流 进样，进样量1. 〇PL。升温程序为：初始温度80°C，维持2min，10°C/min的速度升至320°C， 并维持6min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50-550 (m/z)。
[0037] 7、LC-Q-TOF/MS数据处理：米用AgilentMassHunter工作站（Qualitative AnalysisVB03. 01，Agilent,USA)记录每个血清样本的总离子流色谱图（TIC)进行可视化 检查。在R软件平台下采用自写的程序代码提取原始数据信号（峰识别和积分），然后进 行保留时间校正、峰对齐和反卷积分析（质谱碎片归属），最后在Excel软件中进行后期编 辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括变量（保留时间Rt，质荷比m/z)、观察量（样本）和 积分面积。差异性代谢物的定性方法为：搜索代谢物二级质谱数据库（METLIN)，比较质谱 的质荷比m/z或者精确分子质量mass。