具有减少量的角鲨烯的流感疫苗的制作方法
【专利说明】
[0001 ]本专利申请要求2009年2月10日提交的美国临时专利申请61/207385作为优先权， 其全部内容以引入的方式纳入本文。
技术领域
[0002] 本发明属于保护不受流感病毒感染的疫苗领域，尤其是所含角鲨烯含量相对于市 售疫苗减少的疫苗领域。
【背景技术】
[0003] 除PREPANDRIX?产品（格兰素史克公司（GlaxoSmithKline))和FLUAD?产品（诺华 疫苗公司）外，流感疫苗通常不含有佐剂。
[0004] 大流行前季节性单价PREPANDRIX?疫苗中的佐剂是一种水包油乳液。其抗原和乳 液佐剂提供于分开的10剂小瓶中，在使用时以1:1的体积比混合。该产品的数据表显示每一 剂的体积为0.5mL，含有3.75yg HA以及10.68mg角鲨烯和4.85mg聚山梨醇酯80。
[0005] 三价季节性FLUAD?疫苗中的佐剂是一种水包油乳液。其抗原和乳液佐剂以预混合 的形式提供于预填充的注射器中。该产品的数据表显示每剂的体积为〇.5mL，含有15yg血凝 素(HA)/每株，以及9.75mg角鲨烯和1.175mg聚山梨醇酯80。如参考文献1所揭示，通过混合 体积比为1:1的2X乳液和2X抗原溶液、以获得乳液和抗原都为IX浓度的最终溶液而制备该 疫苗。该1:1混合比例在参考文献75的第10章中有进一步的解释。参考文献2揭示了这种混 合的改动形式。
[0006] 与FLUAD?产品相比，参考文献3公开了具有较低量的HA (3 X 5yg HA/剂）和较低量 的角鲨烯(5.35mg/剂)的三价流感疫苗。该疫苗含有硫柳汞防腐剂，并以0.5mL剂量给予人。
[0007] 本发明的一个目的是提供进一步改进的佐剂化的流感疫苗制剂，尤其是季节性流 感疫苗。
【发明内容】
[0008] 在一个实施方式中，本发明提供一种流感病毒疫苗，含有：（i)获自至少一种甲型 流感病毒株和至少一种乙型流感病毒株的血凝素，其中，所述血凝素的浓度为每株2 12yg/ ml;和（ii)具有亚微米油滴的水包油乳液佐剂，其含有角鲨烯，其中，角鲨烯浓度为<19mg/ ml〇
[0009] 在另一实施方式中，本发明提供一种无汞的流感病毒疫苗，含有：（i)获自至少一 种甲型流感病毒株和至少一种乙型流感病毒株的血凝素;和（ii)具有亚微米油滴的水包油 乳液佐剂，其含有角鲨烯，其中，角鲨烯浓度为< 19mg/ml。
[0010] 在另一实施方式中，本发明提供一种流感病毒疫苗，该疫苗具有0.2-0.3mL的单位 剂量体积，该疫苗含有（i)获自至少一种甲型流感病毒株和至少一种乙型流感病毒株的血 凝素；和（ii)具有亚微米油滴的水包油乳液佐剂，其含有角鲨烯，其中，角鲨烯浓度为< 19mg/ml〇
[0011 ]在另一实施方式中，本发明提供一种流感病毒疫苗，该疫苗含有：（i)获自至少一 种甲型流感病毒株和至少一种乙型流感病毒株的血凝素;和（ii)具有亚微米油滴的水包油 乳液佐剂，其含有角鲨烯，其中，角鲨烯浓度为9.75mg/ml或4.88mg/ml。
[0012] 在另一实施方式中，本发明提供一种流感病毒疫苗，该疫苗具有0.2-0.3mL的单位 剂量体积，该疫苗含有（i)获自至少一种甲型流感病毒株和至少一种乙型流感病毒株的血 凝素；和（ii)具有亚微米油滴的水包油乳液佐剂，其含有角鲨烯，其中，角鲨烯浓度为 19·5mg/ml、9·75mg/ml或4·88mg/ml〇
[0013] 在另一实施方式中，本发明提供一种流感病毒疫苗，含有：（i)获自至少两种甲型 流感病毒株和至少两种乙型流感病毒株的血凝素;和（ii)具有亚微米油滴的水包油乳液佐 剂，其含有角鲨烯，其中，角鲨烯浓度为<19mg/ml。
[0014] 疫苗制备
[0015] 目前可获得各种形式的流感病毒，疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活病毒可 以基于完整的病毒、裂解的病毒粒子或纯化的表面抗原。流感抗原还可以病毒体的形式提 供。本发明可使用任何这些类型的疫苗，但通常使用灭活疫苗。
[0016] 在使用灭活病毒时，疫苗可含有完整的病毒粒子，裂解的病毒粒子，或纯化的表面 抗原(包括血凝素，通常还包括神经氨酸酶）。灭活病毒的化学方法包括用有效量的一种或 多种以下试剂处理:去污剂、甲醛、丙内酯、亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元 乙胺(binary ethylamine)、乙酰基乙亚胺或它们的组合。灭活病毒的非化学方法是本领域 已知的，例如UV光或γ照射。
[0017] 可通过各种方法从含病毒的液体中收集病毒粒子。例如，纯化方法可包括利用线 性蔗糖梯度溶液的区带离心，所述蔗糖溶液含有去污剂以使病毒粒子破裂。任选稀释后，可 通过渗滤纯化抗原。
[0018] 用去污剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三-Ν-丁酯、曲通Χ-100、曲 通Ν101、溴化十六烷基三甲铵、Tergitol ΝΡ9，等等)处理纯化的病毒粒子，包括"吐温-醚" 裂解方法来产生亚病毒粒子制品，从而获得了裂解的病毒粒子。本领域熟知裂解流感病毒 的方法，例如参见参考文献4-9等。通常利用破裂浓度(disrupting concentration)的裂解 剂(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎来进行病毒的裂解。破 裂造成病毒蛋白质完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子和离子性 (例如，阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、烷基硫代糖苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚 氧乙稀烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、海克麦格(Hecameg)、烷基苯氧基-聚 乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠（sarc 〇Syl)、CTAB(溴化十六烷基三甲铵）、磷 酸三-N-丁酯、塞太弗伦(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基铵盐、脂转染试剂（lipofectin)、脂转 染胺（1 ipofectamine)、和D0T-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性剂，如 曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯（吐温表面活性剂）、聚氧乙烯醚、聚氧乙 烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，裂解可发生在最初的病 毒粒子纯化期间（例如，在蔗糖密度梯度溶液中）。因此裂解方法可包括使含病毒粒子的物 质澄清（以除去非病毒粒子物质），浓缩收集的病毒粒子（例如，采用吸附法，如CaHP0 4吸 附），分尚完整病毒粒子与非病毒粒子物质，在密度梯度尚心步骤中利用裂解剂裂解病毒粒 子(例如，利用含有裂解剂(如脱氧胆酸钠)的蔗糖梯度），然后过滤(例如，超滤）以除去不需 要的物质。可将裂解的病毒粒子有用地重悬在磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。 PREPANDRIXTM、BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONE TM和FLUSHIELDTM产品是裂解疫苗。
[0019] 纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常还包含神经氨酸酶。本领域 熟知制备纯化形式的这些蛋白质的方法。FLUVIRIN?、FLUAD?、AGRIPPAL?和INFLUVAC?产品 是这些疫苗的例子。
[0020] 灭活的流感抗原的另一种形式是病毒体[10](不含核酸的病毒样脂质体颗粒），如 INFLEXAL V?和INVAVAC?产品中的形式。可使用去污剂溶解流感病毒、接着除去核壳体和 重构含有病毒糖蛋白的膜而制备病毒体。制备病毒体的另一种方法涉及将病毒的膜糖蛋白 加到过量的磷脂中，以产生其膜中具有病毒蛋白的脂质体。
[0021] 毒株选择
[0022] 本发明的疫苗包括获自至少一种甲型流感病毒株和至少一种乙型流感病毒株的 血凝素。通常使不同株分开生长，然后在收集病毒和制备抗原后混合。因此，本发明的方法 可包括混合来自一种以上流感株的抗原的步骤。
[0023]本发明使用的毒株可具有野生型病毒中发现的天然HA，或改性HA。例如，已知可改 变HA，以除去使病毒对禽类高度致病的决定簇(如HA1/HA2裂解位点附近的超碱性区域）。用 于本发明的乙型流感病毒的血凝素优选在氨基酸197具有Asn，以提供糖基化位点[11]。
[0024]本发明使用的流感病毒可以是重配毒株，并可通过反向遗传学技术获得。反向遗 传学技术[例如，12-16]能利用质粒或其它人工载体在体外制备含所需基因组区段的流感 病毒。该技术通常涉及表达(a)例如能从poll启动子或噬菌体RNA聚合酶启动子编码所需病 毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能从pol II启动子编码病毒蛋白质的DNA分子，从而使得在 细胞中表达两种类型的DNA能装配完整的感染性病毒粒子。DNA优选能提供所有病毒RNA和 蛋白质，但也可利用辅助病毒提供所述RNA和蛋白质中的一些。可使用利用单独的质粒制备 各病毒RNA的基于质粒的方法[17-19]，且这些方法也将涉及使用质粒来表达所有或一些 (如仅仅PB1、PB2、PA和NP蛋白）病毒蛋白，一些方法利用高达12种质粒。为减少所需的质粒 数，一种方法[20]在同一质粒上组合了多个RNA聚合酶I转录盒（用于病毒RNA合成）（例如， 编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感vRNA区段的序列），在另一质粒上组合了含RNA聚合 酶II启动子的多个蛋白质编码区（例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感1111?^转录 物的序列）。参考文献20所述方法的优选方面包括：（a)-个质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编 码区；和(b)-个质粒上的所有8个vRNA编码区段。在一个质粒上包含NA和HA区段和在另一 质粒上包含6个其它区段也是有利的。
[0025]作为使用poll启动子编码病毒RNA区段的替代方式，还可能用细菌噬菌体聚合酶 启动子[21 ]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。由于po 11启动子的种属特异 性，噬菌体聚合酶启动子对于许多细胞类型(例如，MDCK)更方便，虽然还必须用编码外源性 聚合酶的质粒转染细胞。
[0026]在其它技术中，可米用双重poll和polll启动子来同时编码来自一个模板的病毒 RNA和可表达的mRNA[ 22，23]。
[0027]因此，甲型流感病毒可包含来自A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(通常是A/ PR/8/34的6个区段，其中HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2重配株）。还可包含4/13~/33病毒 或用于生产疫苗制备用重配病毒的任何其它病毒毒株的一个或多个RNA区段。甲型流感病 毒可包括少于6个（即0、1、2、3、4或5个)来自AA/6/60流感病毒的病毒区段(A/Ann Arbor/6/ 60)。乙型流感病毒可包括少于6个（8卩0、1、2、3、4或5个)来自44/1/66流感病毒的病毒区段 (B/Ann Arbor/1/66)。通常，本发明抵御能人向人传播的毒株，因此该毒株的基因组一般包 含源自哺乳动物(例如人)流感病毒的至少一个RNA区段。其可包含源自禽流感病毒的NS区 段。
[0028] 其抗原可包含在组合物中的毒株可对抗病毒治疗具有耐受性(如耐奥司他韦[24] 和/或耐扎那米韦），包括耐药性流行性毒株[25]。
[0029] 特别有用的毒株是那些从分离自患者开始到在细胞培养系统中复制这一过程中 的任何阶段(包括分离和在细胞培养系统中复制)都未通过鸡蛋传代的毒株。可在分离到病 毒复制过程中的所有步骤中都只用MDCK细胞。
[0030] 在一些实施方式中，本发明使用的毒株的血凝素相对于具有Sia(a2,3)Gal末端二 糖的寡糖而言对具有Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖具有结合偏好。人流感病毒结合具有 Sia(a2，6)Gal (唾液酸以α2，6方式连接于半乳糖)末端二糖的受体寡糖，而鸡蛋和Ve