专利名称：皮内流感疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物领域，尤其是传染性疾病领域。更具体地，本发明涉及包括病毒体
的疫苗用于制备预防性治疗流感感染的药物。
背景技术：
流感病毒(正粘病毒科家族的成员)是每年流行性急性呼吸道疾病的病原体。流 感流行和大范围流行仍然在剥夺人类生命并影响全球经济。仅在美国每年就有5000万美 国人患上流感。据估算全世界每年死亡人数(1972-1992)是60，000(CDC统计值)。除了季 节性流行外，在上世纪存在三次主要的流感大范围爆发。严重的流感大流行的典型例子是 1918-1919年的"西班牙流感"，据估算其在全球范围内杀死4000-5000万人。其他的大流行 发生在1957年(亚洲流感，据估算100万人死亡)和1968年(香港流感，据估算700， 000 人死亡)。现在已经发现(致命)禽流感病毒可以进入人群，很清楚在某些情况下这种禽类 病毒或其致命组分的人与人之间的传播实际上是可能的。 流感病毒的感染与许多疾病和并发症有关，所述疾病和并发症导致实质上世界范 围的发病和死亡，尤其是在老年人和慢性病患者中。抗流感的疫苗接种能够最有效的预防 与该感染有关的通常致死性的并发症，在流感疫苗的开发方面已经做出了许多努力。
目前使用三种类型的灭活流感疫苗全病毒，裂解产物和表面抗原或亚单位疫苗。 季节性疫苗都包含流感病毒株的表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，所述流感病 毒株被预期来年在人群中传播。所述递送掺入疫苗的HA和NA蛋白的毒株在含胚鸡蛋中生 长，随后纯化病毒颗粒，然后进一步处理。 每年都需要调整流感疫苗，这归因于称为"抗原性漂移"和"抗原性转变"的过程 引起的抗原变异由于病毒HA或NA蛋白中一系列导致氨基酸取代的点突变的积聚发生抗 原性漂移。这些取代阻止了先前感染诱导的中和抗体的结合，新的变体从而能够感染宿主。 抗原性转变是通过动物(通常是禽类)和人甲型流感病毒之间的基因重排出现的新亚型。 1957年(H2N2)和1968年(H3N2)的大流行毒株是重排病毒的实例，通过所述病毒禽类HA 和/或NA编码基因被引入循环人类病毒，随后可以在人群间传播。 基于世界范围内上百个国家流感中心的流行病学调查，世界卫生组织(WHO)每年 推荐流感疫苗的成分，通常针对北半球的是在二月，针对南半球的是在九月。这一措施将疫 苗生产和标准化时间窗限制到最多9个月。 在紧急需要许多剂量的疫苗的情况下，例如当一种新的甲型流感病毒亚型通过抗 原性转变和抗原性漂移出现，并且疫苗的供给增加是必需的时候，鸡蛋的有限可用性可能 阻碍疫苗的快速生产。该生产系统的其他缺点在于缺乏灵活性，毒素存在的风险和外来病 毒的风险(尤其是逆转录病毒)和无菌度的担心。一些毒株在鸡蛋中比其他毒株生长更快， 这可能阻碍这类疫苗最终被递送的速度。总之，这些缺点是当今利用这类含胚鸡蛋生产流 感疫苗所面临的严重问题。因此使用细胞培养系统用于针对流行及大流行病的流感疫苗生 产是有吸引力和可靠的生产替代方法。WO 01/38362公开了使用腺病毒E1转化和永生化细
3胞系进行流感病毒生产。 每年流感疫苗通常包含来自2种甲型流感病毒株和1种乙型流感株的抗原。通过 单辐射免疫扩散分析，标准的0. 5ml可注射剂量通常含15i！ g来自每种毒株的血凝素(HA) 抗原组分，加起来总共大约45 ii gHA。 由于世界人口增加，经济增长和繁荣，国际旅游加强，每年流感流行病的传播加 快，世界范围流感大流行病的威胁以及全世界可用生产设施的局限性，希望使用性能比目 前所用标准品提高的疫苗在人类中实现保护性免疫应答；还希望使用更低剂量的疫苗(为 了节约剂量)同时获得类似水平的保护性免疫。但是，当考虑更低剂量时，可以考虑免疫剌 激剂如基于铝的佐剂。但是，由于不良副作用如注射部位的疼痛，在流感疫苗中通常不使用 铝。
附图简述
图1显示18到60岁的接种者中肌内递送(IM)或皮内递送(ID)后，对于A/New Caladenia株(左侧条)，A/广岛株(中间条)和B/马来西亚株(右侧条)的(A)血清转 变(SC)率(％ ) ， (B)GMT倍数增长标准(> 2. 5倍)，和(C)血清保护(SP)率(> 70% )。
图2显示大于60岁的接种者中肌内递送(IM)后，对于A/NewCaladenia株(左侧 条)，A/广岛株(中间条)和B/马来西亚株(右侧条)的(A)血清转变(SC)率(％ ) ， (B) GMT倍数增长标准(> 2. 5倍)，和(C)血清保护(SP)率(> 70% )。
图3显示符合EMEA标准中的大多数，其中+(加号)表示符合标准，-(减号)表 示不符合标准。 图4显示涉及以单次皮内剂量施用3、4. 5和6iig 3种流感毒株HA抗原的研究 中的血清转变和血清保护率，与肌内施用的高剂量(每种毒株15yg HA)相比以及与利用 NanoPass装置(通称为Micronjet装置)皮内施用的低剂量(每种毒株3 y g HA)相比。 该研究是包括每个研究组56位患者和施用2007/2008流感季节的Inflexal②流感疫苗的II
期临床试验。 图5显示接受3、4. 5和6 ii g各株HA的组中接种前后的GMT等级。 图6显示利用单个皮下针头皮内接受3、4. 5和6 g各株HA的组中血清转变、血
清保护和GMT倍数增加。 图7显示肌内接受15 g各株HA和利用单个皮下针头皮内接受3 g各株HA的 组中血清转变、血清保护和GMT倍数增加。 图8显示肌内接受15ii g各株HA和利用NanoPass Micronjet (多个微针)装置 皮内接受3 g各株HA的组中血清转变、血清保护和GMT倍数增加。 图9显示通过单个皮下针头或利用NanoPass Micronjet (多个微针)装置接受 3 g各株HA的组中接种前后的GMT等级。左侧条代表A/所罗门群岛株，中间条代表A/威 斯康星株和右侧条代表B/马来西亚株。 图10显示利用单个皮下针头皮内接受3iig各株HA和利用 NanoPassMicronJet (多个微针)装置皮内接受3 y g各株HA的组中血清转变、血清保护和 GMT倍数增加。
4发明概述 本发明涉及一种用做人类个体皮内流感疫苗的包括流感血凝素(HA)抗原的病毒 体制剂。本领域已经公开了包括流感HA抗原的病毒体制剂在动物(猪)中不提供足够的 血清转变、血清保护和GMT倍数增加水平。本发明的发明人现在表明当给人施用这些疫苗 时满足国际标准。 本发明还涉及包括流感HA抗原的病毒体制剂在制备给人类个体皮内施用的流感
疫苗中的用途，其中优选所述制剂是Inflexafv疫苗组合物。此外优选制备小体积的这类 疫苗，优选单剂量体积为约O. lmL。本发明还涉及一种试剂盒，其包括本发明的制剂和适于 疫苗皮内递送的递送装置，优选多通道皮内递送装置如NanoPass开发的Micronjet装置。
发明详述 通常改进疫苗的一种选择是添加佐剂或免疫增强剂。现在存在各种各样的佐剂。 典型实例是基于铝的佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝。其他实例是油包水乳液，皂苷(其可以采 取ISCOM的形式)和来源于病原体的毒素，如破伤风类毒素。 另一种剌激针对流感抗原的免疫应答的方法是产生重建的流感病毒体但不具有 流感病毒自身的遗传背景，所述重建的流感病毒体实质上是重建的功能性病毒包膜，其含 掺入包膜的血凝素抗原(Gliick 1992 ;Huckriede etal. 2005)。这种流感病毒体已经被批 准用于每年发生的流感流行病的流感接种，并由BernaBiotechAG以商标Inflexa产V出售。
上述含病毒体的流感疫苗通常含15 g各种毒株的HA，所述毒株由WHO推荐用于 每年的接种计划两种甲型流感株和一种乙型流感株。这些疫苗通常是利用注射针头肌内 施用。 除了与提供足够疫苗以满足每年对流感疫苗的需要(节约剂量)有关的问题外， 在施用这些疫苗时还存在问题，因为它们需要利用长针注射许多个体害怕这种针头，因此 将受益于其他的施用方法。 皮内施用是一种避免使用长针的疫苗施用方式，可以通过可靠并易用的装置施用 疫苗。此外，皮肤是优异的免疫器官，因为存在高密度的朗格汉斯细胞，其是特化的树突细 胞。通常认为疫苗的皮内施用使抗原被更有效的摄取。在本领域有关于流感疫苗皮内施用 的报道(Belshe et al. 2004 ;Kenney et al. 2004)，其显示更低剂量(3到6 ii g单株HA)令 人满意的效果。Belshe等(2004)显示在119名个体中通过6 y g HA的皮内施用达到100% 血清转变，而Kenney等(2004)显示当在50名个体中比较15 y g HA的肌内施用与3iig HA 的施用时，血清转变和血清保护率是类似的。 尽管裂解病毒疫苗或纯化抗原疫苗的皮内施用是适用的，但与肌内施用的疫苗组 合物相比，其体积和抗原剂量通常更低，而且尽管这类研究已经进行并已公开，但当前还没 有皮内流感疫苗是商品化供应的。为了符合标准并可以有效的作为肌内疫苗，希望通过佐 剂剌激这种组合物的免疫应答(当皮内施用时)。但是，基于铝的佐剂通常导致负面的副 作用，使其不适合于皮内施用。 一种剌激免疫应答的其他方式是利用含HA抗原的免疫剌激 性重建流感病毒体，其中所述抗原通过病毒体膜与细胞膜的融合过程被直接递送到抗原呈 递细胞。这种病毒体组合物是本领域公知的(参见例如Huang et al. 1979 ;Kawasaki et al. 1983 ;Hosaka et al. 1983)，而在W092/19267中它们被描述用于其他类型的疫苗。
流感病毒体已被用于皮内施用，这类方法公开于WO 2004/016281 。W02004/016281
的实施例和附图公开了基于病毒体的流感疫苗(Inflexafv)结合不同浓度的ADP核糖基 化毒素(大肠杆菌热不稳定肠毒素LT)满足EMEA设定针对每种疫苗株的标准(至少40% 血清转变率=接种后血清血凝素(HI)滴度增加至少四倍的接种者的百分比)，参见图1到 3。但是，当省略佐剂(ADP核糖基化毒素)和只使用3iig各株HA时得不到阳性结果。在 皮内施用不含LT的病毒体的任意情况下，血清转变率都达不到40 % 。肌内施用的普通方式 导致足够的血清转变。因此，WO 2004/016281的结论是基于病毒体的流感疫苗的皮内施用 不应该用于获得足够的保护。 本发明的发明人现在发现基于病毒体的流感疫苗(如以名称inflexafv出售的那
些流感疫苗)可以皮内施用(代替肌内注射)，并且当用于人时达到当局设定的标准。本发 明的皮内施用以低于通常需要的15 g各株HA的剂量(和体积)进行，同时保持诱导为这 类疫苗设定的一般标准(如EMEA设定的标准)所要求的保护性免疫。降低剂量为全世界 产能问题和流感疫苗需求的增加提供了解决方案。皮内施用还为麻烦的利用针头的肌肉注 射(许多人惧怕)提供了解决方案。此外，通过使用基于病毒体的疫苗，预期不良事件率将 降低，这归因于病毒体佐剂化流感疫苗的高纯度。 显然，考虑到WO 2004/016281，本发明的发明人发现采用病毒体形式并且剂量降 低的疫苗在皮内施用时提供足够保护这一事实非常出乎意料。这种差异可以通过以下事实 解释，WO 2004/016281的实验是在动物中进行的，确切地说是在猪而不是在人类中进行的。 本发明的发明人发现当给人类个体施用低剂量的HA抗原时，基于病毒体的流感疫苗的皮 内施用提供足够的血清转变和血清保护率。 本发明涉及用于人类治疗或预防的包括约3yg来自单一流感病毒株的HA抗原的 组合物，其中所述组合物还可以包括来自多种流感病毒株的HA抗原，优选来自甲型以及乙 型株。应理解所述组合物可以包括来自多种流感株的HA抗原，其中HA抗原的量优选为约 3iig每株。 本文使用的"皮内递送"或"皮内施用"表示将流感疫苗递送到皮肤的真皮区域，尽 管它不是必须仅仅位于真皮内，所述真皮是位于距人类皮肤表面约1. 0到约2. Omm之间的 皮层。在个体之间和身体的不同部分可能存在一定量的变化。通常，从皮肤表面向下大约 1.5mm到达真皮，分别位于表面的角质层及表皮与下面的皮下层之间。施用后，疫苗可以仅 仅位于真皮内或它也可能存在于表皮。 用于皮内疫苗的合适装置包括施用器，如NanoPass Technologies Ltd.出售 的那些及描述于以下的那些US 4886499， US 5190521， US 5328483， US 5527288， US 4270537， US 5015235， US 5141496， US 5417662， W099/34850, EP 1092444， US 5480381， US 5599302， US 5334144， US 5993412， US 5649912， US 5569189， US 5704911， US 5383851， US 5893397， US5466220, US 5339163， US 5312335， US 5503627， US 5064413， US 5520639， US 4596556， US 4790824， US 4941880， US 4940460， US 6494865， US6569123, US 6569143， US 6689118， US 6776776， US 6808506， US 6843781， US 6986760， US 7083592， US 7083599， WO 2004/069302， WO 2004/098676， WO 2004/110535， WO 2005/018703， WO 2005/018704， WO 2005/018705， WO 2005/086773， WO 2005/115360， WO 02/02178， WO 02/02179，W002/083205,WO 02/083232，WO 03/066126，WO 03/094995，WO 2004/032990，WO
62004/069301，WO 97/37705和WO 97/13537。 技术人员发现的适于递送流感疫苗的任意皮内递送装置均可用于本发明，并且可 以是本发明试剂盒的一部分。优选的是如NanoPass开发的那些装置，通常称为Micronjet 装置，包括多种递送通道，还称为微针或MicroPyramids。内部使用的Micronjet装置(在 下文实施例2中)包括4个分离的针头，但Micronjet装置可以含其他数目的分离微针，如 至少2个和直至仍然允许组合物(需要递送到人类皮肤)流动的数目。
使用国际性标准来检测流感疫苗的效果。有效抗流感疫苗的EMEA标准是血清转 变率> 40% (18到60岁)> 30% ( > 60岁)转化系数> 2. 5(18至lj 60岁)> 2. 0 ( > 60岁)保护率> 70% (18到60岁)> 60% ( > 60岁) 血清转变被定义为接种后针对每种疫苗株的血清血凝素抑制(HI)滴度增加至少 四倍的接种者的百分比。转化系数被定义为接种后针对每种疫苗株的血清HI几何平均滴 度(GMT)的倍数增加。保护率被定义为接种后血清HI滴度等于或大于1 : 40(针对每种 疫苗株)的疫苗的百分比，通常被视为指示保护。 理论上，为了满足欧洲要求，对于疫苗包括的所有流感株，流感疫苗只需符合上面
所列标准中的一种。但实际上，对于所有毒株来说至少两种需要被满足才可能是足够的。一
些毒株比其他的免疫原性更高，即使当肌内施用时也可能达不到标准。通常，当针对18到
60岁之间健康个体的标准被满足时，老年人(> 60岁)的标准可能不会被满足。 本发明涉及基于病毒体的流感疫苗制剂在制备给人皮内施用的流感疫苗中的用
途。此外，当皮内递送疫苗时施用更少的体积。 在某些实施方案中，本发明组合物中的抗原量是单疫苗剂量中1到lOi! g各流感 株HA，例如2到10 ii g，例如单疫苗剂量中约3、4、5、6、7、8或9 y g各流感株HA。本发明组 合物中的抗原量优选是单疫苗剂量中约3. Oi! g各流感株HA ;这只需要施用典型肌内剂量 的20% (0. lmL而不是0. 5mL)。 本发明涉及用做人类个体皮内流感疫苗的包括流感血凝素(HA)抗原的病毒体制 剂。优选地，所述制剂不包括除了流感病毒以外的病毒的抗原。包括HA抗原的病毒体已经 制备了数十年，生产这种病毒体的方法是本领域技术人员公知的。包括流感病毒HA抗原
的病毒体制剂还被用于其他预防性治疗，如用于制备甲肝疫苗(Epaxa^;)。但是，在优选的
实施方案中，当接种被治疗的人类个体以预防流感感染时，该制剂不包括来自其他病原体
(如病毒样甲肝病毒)的抗原。当发生大流行病时，可以使用包括流感病毒HA抗原的病毒 体制剂。在那种情况下，来自单个流感株的HA抗原被用作病毒体制剂的一部分。但是，当 正生产季节性疫苗时，这类疫苗通常是三价的，即HA来自3种不同的流感株，通常是2种甲 型株和l种乙型株。为了在季节性流感活动期间治疗人类个体，优选本发明制剂包括来自 两种或更多种流感病毒株的HA抗原，优选来自3种毒株，更优选来自2种甲型株和l种乙 型株。本发明的制剂优选用于人的预防性治疗，因此优选还包括药学上可接受的赋形剂和/ 或溶剂。药学上可接受的赋形剂是本领域公知的，例如可以选自卵磷脂，Na2HP04， KH^04和 NaCl。合适的溶剂是水。 在优选的实施方案中，本发明涉及一种本发明的制剂，其中各流感株HA抗原的浓 度是约3. OP g每流感株。通常，利用约15ii g HA每流感病毒株进行病毒体制剂的肌内施用 以应对季节性流感活动。如本文所述，用于肌内施用的这种制剂的1/5(20% )现在可经皮内施用并获得适当水平的血清转变、血清保护和GMT倍数增加。因此，对于皮内施用来说，优选的每流感株HA浓度为约1/5 :约3. 0 g。 包括基于流感病毒的病毒体并包括HA抗原作为免疫原决定簇的制剂是商品化供应的。因为生产容易，取样这种制剂的1/5用于皮内使用是优选的。在优选的实施方案中，本发明涉及一种本发明的制剂，其中所述制剂是由Berna Biotech AG， Switzerland出售的
Inflexafv疫苗组合物。该疫苗每年通常具有来自不同流感株的HA内容物，这取决于WHO
的推荐。优选地，本发明的制剂不含来自流感株A/新喀里多尼亚/20/99、A/莫斯科/10/99和B/香港/330/2001的HA抗原的三价组合。尽管如此，像所述毒株的任何毒株或病毒的其他组合仍是可能的，并包括在本发明的制剂中。 本发明还涉及包括流感HA抗原的病毒体制剂在制备用于给人类个体皮内施用的流感疫苗中的用途。优选地，本发明用途中的制剂不包括除了流感病毒以外的病毒的抗原。对于季节性施用，优选所述制剂包括来自两种或更多种流感病毒株的HA抗原。对于大流行病，优选在本发明使用的制剂中用其HA抗原代表引起大流行病的单个流感株。在优选的用途中，即使制剂中只存在一种流感株，来自各流感株的HA抗原浓度是约3. 0 g每流感株。优选地，Inflexa严V疫苗组合物用于本发明药物的制备，其中优选所述制剂不含来自流感株A/新喀里多尼亚/20/99、 A/莫斯科/10/99和B/香港/330/2001的HA抗原的三价组合。 皮内递送允许更少的体积。当原有的肌内疫苗具有0. 5mL的体积(如单剂量的Inflexal V)时，优选在皮内施用时使用该体积的20%。因此，优选将疫苗制备为约0. lmL的单剂量体积。 病毒体可能具有佐剂化活性，因此可以被认为是佐剂。本文显示，当本发明的病毒体制剂用于人抗流感的皮内接种时，不需要其他佐剂(即除了病毒体之外)。因此，在优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物不包括额外佐剂。这类额外佐剂可能产生副作用，因此根据本发明避免使用。此外，本发明不需要制备和检测这些额外佐剂组分，因此避免了与额外佐剂有关的额外费用和复杂情况。 本发明还涉及本发明制剂的组合及用于皮内递送的递送装置。因此，本发明还涉及包括本发明制剂的试剂盒及适于疫苗皮内递送的递送装置。更优选的是其中制剂已存在于递送装置内的试剂盒，所述试剂盒使得卫生工作者能够容易的将疫苗给人类个体施用。用于本发明试剂盒的优选递送装置是NanoPass⑧以名称MicronJet出售的那些装置。可
以用于本发明试剂盒的这些和其他递送装置是公开于下列专利和专利申请中任一个的那些装置US 4886499， US 5190521， US 5328483， US 5527288， US 4270537， US5015235, US5141496， US 5417662， WO 99/34850， EP 1092444， US 5480381， US 5599302， US 5334144，US 5993412，US 5649912，US 5569189，US5704911, US 5383851，US 5893397，US 5466220，US 5339163，US 5312335，US 5503627，US 5064413，US 5520639，US 4596556，US 4790824，US4941880，US 4940460，US 6494865，US 6569123，US 6569143，US 6689118，US 6776776，US 6808506， US 6843781， US 6986760， US 7083592， US7083599, WO 2004/069302， WO2004/098676， WO 2004/110535， W02005/018703, WO 2005/018704， WO 2005/018705， WO2005/086773，W02005/115360，WO 02/02178，WO 02/02179， WO 02/083205，WO 02/083232，WO 03/066126， WO 03/094995， WO 2004/032990， WO 2004/069301， W097/37705和WO97/13537。 本发明还涉及一种对人类个体进行抗流感感染接种的方法，所述方法包括给人类个体皮内施用不含额外佐剂的包括流感血凝素(HA)的病毒体制剂。本发明还提供一种对哺乳动物个体进行抗流感感染接种的方法，所述方法包括以下步骤制备包括流感株HA抗原的基于病毒体的流感疫苗，和皮内施用所述疫苗。优选地，所述哺乳动物是人。在大流行病威胁的情况下，疫苗优选只包括来自感兴趣的并造成大流行病威胁的毒株的HA抗原。但是，在一般季节性疫苗体系、方案和活动期间，优选根据本发明皮内施用的疫苗是三价疫苗，包括来自3种不同流感株的HA，更优选来自2种甲型株和l种乙型株。
在另一优选的实施方案中，疫苗包括l-10ii g来自单个毒株(或就三价疫苗来说，来自3种流感株的每一种)的HA抗原，例如约3.0iig。在更优选的实施方案中，基于病毒体的流感疫苗是Berna Biotech AG以商标Inflexaf V疫苗商品化的疫苗。优选地，本发明涉及一种本发明的方法，其中疫苗不含来自流感株A/新喀里多尼亚/20/99、 A/莫斯科/10/99和B/香港/330/2001的HA抗原的三价组合。如本文所示，优选利用适于疫苗皮内递送的递送装置进行施用。适于皮内递送的装置可以是单个皮下针头。发现某些装置被制备为使其针头无法越过皮层，这将导致次最优皮内递送。换言之，某些装置包含的针头比较短使得大部分(如果不是全部)疫苗制剂被皮内递送。优选的用于本发明方法的装置是含两个或更多个分离递送通道的递送装置，如微针或MicroPyramids。更优选地，这类递送装
置含4个或更多个分离的递送通道。极其优选的是NanoPass⑧递送装置，如Micronjet装置。实施例实施例l.基于病毒体的流感疫苗在人类个体中的临床试验(3iig各株HA)
在巢式研究组(nested study group)中利用Inflexaf V对A^个体进行临床试验以评价皮内施用疫苗的安全性和体液应答。该研究是开放式和非随机的。使用的疫苗是三价病毒体佐剂化流感疫苗inflexaf V疫苗，其是针对2006-2007流感季节开发和研究的。这种肌内疫苗的一个剂量含(最初)15i!g下列三种流感株中每一种的血凝素于O. 5mL溶剂中与病毒体偶联的A/新喀里多尼亚/20/99(HlNl ;IVR-116)， A/广岛/52/2005 (H3N2 ;IVR-142 ;A/威斯康星/67/2005样病毒)和B/马来西亚/2506/2004。皮内施用是利用该疫苗的20%部分进行0. lmL的单剂量含3iig各流感株HA，利用有针头的普通注射器。皮内研究包括23位健康志愿者，他们均在18到60岁之间(年龄范围19. 2到59. 6)。使用的标准由EMEA设定。将该研究与肌内施用进行比较，所述肌内施用利用0. 5mL疫苗的单剂量(正常M剂量)在18到60岁之间(年龄范围21. 1到59. 8)的56位成年人和60岁以上(年龄范围60. 4到83. 3)的58位成年人中进行。在接种后20到24天进行取样。
图1A显示肌内递送(M)和皮内递送(ID)后接种者的血清转变率(％ )，并显示在两种递送法中对于所有三种毒株来说，设定的标准(> 40%血清转变)均被满足。图1B显示对于所有三种毒株来说，GMT倍数增加标准(> 2. 5倍)也被满足。图1C显示对于两种甲型株来说血清保护是足够的(> 70% )，而皮内递送后对乙型株的血清保护率未被满足。但是，当与老年人(>60岁)得到的结果相比时，如图2C所示，肌内递送也没有产生超过60%的保护率(该年龄组的标准)。该结果最有可能归因于该乙型流感株HA抗原的免疫原性。图2A和2B显示> 60岁组中肌内施用后的结果，提示水平已达到符合EMEA标准的足够水平。图3提供结果概述，其中+(加号)表示符合标准，-(减号)表示不符合标准。
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这些研究显示当按照浓度为各株(两种甲型株和一种乙型株)3i！ g给人皮内施用基于病毒体的流感疫苗时，对于所有三种毒株来说血清转变和GMT标准都被满足，而至少两种甲型株的血清保护率得到满足。这与W02004/016281公开的内容相比非常出乎意料并形成鲜明对比，W02004/016281中显示这类接种方式不符合当局为其中所用三种毒株中任一设定的标准。实施例2.人类个体中用基于病毒体的流感疫苗的剂量增加(和肌内对皮内)研究 进行第二个涉及人类个体的临床研究以评价皮内施用的季节性病毒体佐剂化流感疫苗的体液免疫应答。这包括单中心、随机化的剂量增加研究，其中皮内施用体积0. lmL的针对2007/2008流感季节的三价Inflexaf V流感疫苗，其中剂量包括3、4. 5或6 ii g各株(A/所罗门群岛/3/2006[H1N1] ;A/威斯康星/67/2005[H3N2] ;B/马来西亚/2506/2004)HA。肌内递送的疫苗被作为阳性对照(0.5mL剂量中含3X15yg HA每株)。此外，检测了由NanoPass开发的微针装置(本文通称为Micronjet装置)是否也能用于皮内递送抗原，以及是否能够获得有益结果。 Micronjet装置通常利用具有稳定和确定注射深度的多个注射"针头"或通道，这与只有一个通道并且注射深度变化更大(主要取决于施用疫苗的人)的单个皮下针头大不相同。Micronjet装置通常是设计用于药物和疫苗的无痛皮内递送的针替代品。依靠标准注射器而不是常规针头，实际上MicronJet可用于注射任何物质，允许受控的皮内递送。它非常适合于药物、蛋白和疫苗的皮内施用，对完成者专长的要求很低。该装置的头部含一系列小针头、微针，也称为""MicroPyramids"，每个均短于0. 5毫米。因为微针这么短，它们达不到皮肤的游离神经末梢(其负责痛觉)，所以不存在痛苦的"针剌"，大部分物质完全可以无痛施用。微针是这么小(肉眼几乎无法看见)，使得MicronJet装置比常规针头的恐怖性要低得多，非常适于儿童和恐针患者。 与剂量增加研究中的最低剂量一致，Micronjet装置研究组还接受3. 0 y g各株HA。整个研究总共包括5组。每组含56例个体，其中三组利用单个皮下针头接受皮内施用(组Al、 A2、 A3)， 一组接受肌内注射(组B ;15 ii g剂量)，和一组利用微针装置接受皮内注射(组C ;3. 0 ii g剂量)。组Al接受3 ii g各株HA，组A2接受4. 5 y g各株HA，和组A3接受6iig各株HA。 第一天，接种前，采集接种前样品，和接种后22天，从各个个体获取另一样品。表I提供研究的详细内容，指示各组内的平均年龄，每个研究组人员的性别，和对于不同毒株的GMT预检滴度。与先前的实施例一样确定参数、GMT倍数增加、血清保护和血清转变。
图4显示对于所有三种毒株和所有组来说，与免疫后22天的样品(右栏)相比，免疫前样品的血清保护率(左栏)。它清楚地显示接种前，通常没有组含足够的抗任一毒株的保护性滴度，而接受疫苗后，各组都达到平均血清保护水平，在几乎所有案例中都超过70%阈值。 图5中，描述了通过皮下针头接受3、4. 5和6iig HA每株的皮内组A1、A2和A3的GMT水平。它清楚地显示GMT的显著增加。GMT倍数增加显示于图6(右栏)，其指示达到增加(虚线)的阈值(>2.5倍)，乙型病毒中也是这样。甚至用3yg HA抗原的最低剂量也达到该水平。图6，左栏和中间栏还显示通过皮下针头接受所述三种低剂量的组的血清转变和血清保护率。除了 3ii g乙型株HA剂量外，所有疫苗都提供高于本文所述阈值(40%血清
10转变和70%血清保护)的足够比率。因此证实了疫苗针对每种毒株的免疫原性。 还将基础15 ii g HA剂量(组B)的肌内施用与通过皮下针头施用的3 y gHA剂量
(组A1)进行了比较。图7显示(左栏)获得足够的血清转变率，而(中间栏)与图6(中
间栏，左面3条)所示一致，只获得针对甲型株的血清保护，乙型株的血清保护水平刚刚低
于70%阈值。在分别通过肌内和皮内途径的高和低剂量施用中GMT倍数增加(右栏)是足够的。 还将15iig HA每株的肌内递送(组B)与利用NanoPass (MicronJet)装置施用3iigHA每株的皮内递送(组C)进行比较。与肌内高剂量递送相比，来自低剂量的血清转变率达到高于可接受的水平，并且重要地是，血清保护率(包括乙型病毒的血清保护率)也达到阈值水平(图8，左栏和中间栏)。因此，与利用单个皮下针头的皮内递送不同，多个针头MicronJet装置做出另外的贡献，因为乙型病毒诱导的血清保护率甚至进一步增加。因为NanaoPass递送装置使用数个非常小的针头(或MicroPyramids)，可以总结出在皮肤非常小的部分使用多个注射部位扩大了疫苗递送的面积。这使得接种效果被进一步增加。因此，当应用皮内递送时优选具有多个同时注入部位。在本文中同时表示在相同时间，通过单装置中的多个分离通道将疫苗剂量递送给宿主，优选在单次注射中。优选地，在这种单个递送装置中使用超过一个的通道(小针头，微针，或MicroPyramid):优选使用至少2个，3或4个通道，甚至更优选地，使用超过4个通道。最优选地，使用以下装置，在所述装置中使用较高数目的通道，其仍允许疫苗组合物的流动并允许通过多个通道分离而无堵塞，允许疫苗组合物的递送，所述疫苗组合物产生具有足够(达到阈值)效力的接种；即达到可接受的血清转变、血清保护和GMT增加水平。 图8，右栏，显示在利用常规针头的肌内递送与利用NanoPass装置的皮内递送之间，当比较接种前滴度和接种后滴度时GMT滴度的增加。令人惊讶的是，与肌内途径和更高剂量相比，当通过皮内途径施用5X更低剂暈的HA抗原时，检测到针对3种毒种中每一种更高的GMT滴度增加。因此可以总结出，当基于病毒体的流感疫苗结合皮内递送途径时，优选使用本文公开的NanoPass装置，获得针对甲型和乙型流感株的可接受和足够的GMT滴度，可以使用至少5X更低剂量(在这种情况下从15yg HA剂量[每株]到3yg HA剂量[每株])。这表明利用本发明的试剂盒，其中基于病毒体的流感疫苗结合皮内递送装置，优选由NanoPass开发的多通道装置，可以实现显著的剂量节约，导致为全世界人口提供显著更多的剂量，特别是在如大流行病威胁的情况下。 图9显示类似的结果，当利用皮下针头(每栏的左侧三条)的皮内递送与Micronjet装置(每栏的右侧三条)进行比较时注射部位的扩大(同时使用多通道)导致GMT滴度的更高增加。左侧条代表A/所罗门群岛株，中间条代表A/威斯康星株，和右侧条代表B/马来西亚株。当比较利用单个皮下针头施用或利用MicronJet装置施用的低剂量3yg HA每株时，显示当利用单个针头时乙型病毒的血清保护率一直低于70X阈值水平，当通过MicronJet NanoPass装置的多个针头施用基于病毒体的流感疫苗时达到高于70%的水平。这清楚提示在单次注射中使用多个注射部位的有益免疫原性作用和增加的价值。
在HAI滴度测定和统计分析后，看起来3. 0 ii g剂量组(利用单个皮下针头的皮内和利用Micronjet装置的皮内)就B/马来西亚病毒而言的差异是显著的，因为Micronjet组对该乙型病毒来说具有统计上显著更高的HAI滴度(p = 0. 001)。从同一分析来看，就A/
11威斯康星株而言，15y g剂量组(肌内)和3.0iig Micronjet组的差异也是显著不同的，表现在通过Micronjet装置接受疫苗的组与通过肌内递送接受5倍更高剂量的组相比具有统计上显著更高的HAI滴度(P = 0. 008)。 总而言之，可以总结出，流感疫苗的皮内递送产生足够的血清保护和血清转变率。此外，可以总结出即使施用比通常用于流感疫苗活动和体系(每株15yg HA)低得多的剂量(3、4.5和6yg HA每株)时也可以实现所述比率。此外，可以总结出优选使用多通道递送装置和/或至少一种具有稳定和标准注射深度的装置以实现"真正的"皮内递送(不越过真皮)。因为在例如对于低于4. 5 ii g或6. 0 ii g剂量进行的3. 0 ii g HA剂量的研究中未
能检测到剂量相关增加，很可能当使用基于病毒体的流感疫苗如本文公开的Inflexa产疫苗进行皮内递送时，剂量可以进一步降低。换言之，可以总结出当利用3.0i!g每株HA时已经达到平台期(至少当皮内施用时)。是否可以使用低于3.0yg HA每株的剂量还有待研究。
表i.用lnflexal②流感疫苗的皮内递送的2ndll期临床研究的基线特征
IMIDID
G吗MicronJet
数目n5656565656
女性n3031243034
年龄平均[y]36.139.538.439.634.1
GMT预测滴度
A/所罗门群岛20.927.425.416.422.9
A/威斯康星40.952.945.334.038.3
B/马拉西亚8.510.59.08.16.4
参 考 文 献Belshe R.B.et al. (2004).Serum antibody responses afterintradermalvaccination against influenza. New Engl. J. Med. 351 :2286-2294.Gliick R. (1992). Immunopotentiating reconstituted influenza virosomes (IRIVs)and other adjuvants for improved presentation of small antigens. Vaccine 10:915-920Hosaka Y. et al. (1983). Hemolysis by liposomes containing influenzavirushemagglutinins. J. Virol. 46 :1014-1017. Huang R. T. et al. (1979).Association ofthe envelope glycoproteins ofinfluenza virus with liposomes__a model studyon viral envelope assembly. Virology 97 :212-217. Huckriede A. et al. (2005). Thevirosome concept for influenza vaccines. Vaccine 23 Suppl. 1 :S26_38.KawasakiK.et al. (1983). Membrane fusion activity of reconstitutedvesicles of influenzavirus hemagglutinin glycoproteins. Biochim. Biophys. Acta.733 :286—290. KenneyR. T.et al. (2004). Dose sparing with intradermal injection ofinfluenza vaccine.New Engl. J. Med. 351 :2295—2301.
1权利要求
一种包含流感血凝素(HA)抗原的病毒体制剂，用作人类个体的皮内流感疫苗。
2. 如权利要求1所述的制剂，包含来自两种或更多种流感病毒株的HA抗原。
3. 如权利要求1-2中任一项所述的制剂，其中每种流感株的HA抗原浓度为1到10 g 每流感株，优选为约3. 0 g每流感株。
4. 如权利要求l-3中任一项所述的制剂，其中所述制剂不含来自流感株A/新喀里多尼 亚/20/99、 A/莫斯科/10/99和B/香港/330/2001的HA抗原的三价组合。
5. 包含流感HA抗原的病毒体制剂在制备用于给人类个体皮内施用的流感疫苗中的用途。
6. 如权利要求5所述的用途，其中所述制剂包含来自两种或更多种流感病毒株的HA抗原。
7. 如权利要求5-6中任一项所述的用途，其中每种流感株的HA抗原浓度为1到10 g 每流感株，优选为约3. 0 g每流感株。
8. 如权利要求5-7中任一项所述的用途，其中所述疫苗被制备为约0. lmL的单剂量体积。
9. 一种试剂盒，包括a) 用于对人类个体进行接种的包含流感血凝素(HA)抗原的病毒体制剂，其中所述制 剂不包含额外佐剂；禾口b) 适于疫苗皮内递送的递送装置。
10. 如权利要求9所述的试剂盒，其中所述递送装置含两个或更多个分离的递送通道， 如微针或MicroPyramids，优选所述递送装置含4个或更多个分离的递送通道。
11. 如权利要求9或10所述的试剂盒，其中所述病毒体制剂包含来自两种或更多种流 感病毒株的HA抗原。
12. 如权利要求9-11中任一项所述的试剂盒，其中每种流感株的HA抗原浓度为1到 10 y g每流感株，优选为约3. 0 ii g每流感株。
13. 如权利要求9-12中任一项所述的试剂盒，其中所述制剂不含来自流感株A/新喀里 多尼亚/20/99、 A/莫斯科/10/99和B/香港/330/2001的HA抗原的三价组合。
14. 一种对人类个体进行抗流感感染接种的方法，所述方法包括给人类个体皮内施用 不含额外佐剂的包含流感血凝素(HA)的病毒体制剂。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述病毒体制剂包含来自两种或更多种流感病毒 株的HA抗原。
16. 如权利要求14或15所述的方法，其中所述疫苗包含1到10 ii g每种流感株的HA， 优选为约3. 0 g每种流感株的HA抗原。
17. 如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中利用适于疫苗皮内递送的递 送装置进行所述施用，其中所述递送装置含两个或更多个分离的递送通道，如微针或 MicroPyramids，例如4个或更多个分离的递送通道。
18. —种接种哺乳动物个体抗流感感染的方法，所述方法包括以下步骤 制备三价基于病毒体的流感疫苗，其包含来自三种流感株的HA抗原而不含额外佐剂；和皮内施用所述疫苗。
全文摘要
本发明涉及基于病毒体的流感疫苗用于制备给人类皮内施用的药物。本发明提供用于接种体系的以病毒体制剂形式包括低剂量血凝素(HA)抗原的(三价)组合物，其在血清转变率、GMT倍数增加和保护率方面符合免疫应答标准。
文档编号A61K9/127GK101754770SQ200880018549
公开日2010年6月23日 申请日期2008年6月11日 优先权日2007年6月14日
发明者C·赫尔佐克, H·拉扎尔 申请人:克鲁塞尔瑞士股份公司