专利名称：：流感疫苗组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种试剂盒形式的疫苗组合物，该试剂盒包括含有包括流感病毒抗原的抗原性制剂的第一容器和含有粘膜佐剂的第二容器。本发明还涉及一种通过给患者施用所述组合物来使患者对流感具有免疫力的方法，以及一种通过与所述佐剂共用施用、特别是鼻内施用时来增强流感病毒抗原的免疫原性的方法。目前的流感疫苗包括灭活完整病毒即破坏的病毒(脱落疫苗)或是膜糖蛋白的纯化制剂即血胶精(HA)和神经氨酸苷酶(NA)亚单位疫苗。血胶精和神经氨酸苷酶是保护性抗体应答所针对的抗原，而血胶精是主要的保护性抗原。对这些肠胃外施用的疫苗效力的估价有很大差异。据信，这类疫苗主要是通过激发能渗入下呼吸道的循环抗血胶精IgG抗体来起作用的。以前，M.L.Clements等(J.ClinicalMicrobiology24,157-160，1986)报道说，分泌性IgA和血清IgG二者都参与对流感病毒的免疫力。此外，一些发表的研究已证明，小鼠中呼吸性IgA对抗流感感染的保护性的重要性。还发现，刺激对流感的局部IgA应答的一个优势在于，这通常是具有比血清应答更广的特异性，因此可提供对抗具有不同于疫苗中存在的血胶精分子的病毒的交叉保护性。所以，能激发局部分泌性和血清抗血胶精应答二者的流感疫苗应该提供优于现有疫苗的免疫力。然而，如果没有先前的粘膜暴露(例如感染)，肠胃外接种疫苗(肌内、皮下等)就是无效的。为刺激粘膜免疫系统，必须把疫苗表面涂敷到粘膜表面上。粘膜施用流感疫苗会比常规的肠胃外免疫接种方案具有一些优点。其中最重要的是更有效地刺激呼吸道的局部粘膜免疫系统以及由于消除了与注射有关的恐惧和不适而提高疫苗摄入率的可能性。因此，为开发粘膜流感疫苗已做出一些努力。不过，一个缺陷是，通过粘膜给予时灭活疫苗的免疫原性往往较差。例如，Kuno-sakai等(Vaccine121303-1310，(1994))已表明，给人施用灭活疫苗得到强的粘膜和血清抗体应答，也可有效预防活疫苗病毒引起的感染。然而，为达到这些效果，Kuno-sakai等施用了3次商购剂量，该方法不能视为商业上可行的。为克服这一问题，改善口服或鼻内施用流感疫苗的免疫原性的不同方法已经包括把霍乱毒素的B亚单位(CTB)用作佐剂(参见S.Tamura等，Vaccine，6，409(1988))，把疫苗胶囊化在各种中心球体中(见Z.Moldoveanu等，J.Inf，Dis.167，85-90(1993))，以及使用活减毒菌(见H.F.Maassab等，vaccines，PlotkinS.A.andMortimerF.AJr(eds)W.B.Saundersphiladelphiap435(1993))。不过，迄今为止尚未开发出增强粘膜施用流感疫苗的免疫原性的实用手段。本申请人现已发现，通过与特定的脱乙酰壳多糖衍生物一起施用流感抗原如血胶精和神经氨酸苷酶抗原，可能获得良好的IgG和良好的IgA应答。更具体地说，本申请人现已发现，如果把脱乙酰壳多糖与流感抗原如神经氨酸苷酶和血胶精共同鼻内施用，或者在施用流感抗原之前使宿主预先服用脱乙酰壳多糖，就会产生良好的系统的或局部的免疫应答。脱乙酰壳多糖是壳多糖或多-N-乙酰-D-葡糖胺的衍生物，其中大部分N-乙酰基已被水解除去。先前已经把脱乙酰壳多糖用于药物制剂，在EP-A-0460020中公开了将其用作粘膜吸收增强剂。不过，EP-A-0460020既未公开也未暗示脱乙酰壳多糖在疫苗组合物中施用时能够提供辅助效果。因此，本发明的第一个方面提供了一种试剂盒形式的疫苗组合物，它包括含有包括流感抗原的抗原性制剂的第一容器以及含有有效辅助量的脱乙酰壳多糖的第二容器。所述流感抗原可以是例如灭活的完整流感病毒，或者纯化的或部分纯化的抗原。在另一实施方案中，流感抗原可存在于载体分子中，例如作为融合蛋白的一部分。抗原性制剂优选含有血胶精和神经氨酸苷酶流感病毒抗原。更具体地说，抗原性制剂优选是灭活完整流感病毒(WIV)或含有纯化的血胶精和神经氨酸苷酶流感病毒抗原的组合物。当使用纯化的血胶精和神经氨酸苷酶组合物时，纯化的血胶精和神经氨酸苷酶抗原优选以玫瑰花结形式存在。所述玫瑰花结优选是半径在10-25纳米范围内的颗粒。玫瑰花结优选是大体上不含脂质，纯化的血胶精和神经氨酸苷酶抗原制剂总体上优选是大体上不含脂质。适用于本发明组合物的血胶精/神经氨酸苷酶制剂的一个实例是“Fluvirin”产品，它由EvansMedicalLimitedofSpeke，Merseyside，UnitedKingdom生产和销售，还可参见S.Renfrey和A.Watts，Vaceine，1994，Vol.12，No.8，pp747-752。完整流感病毒疫苗可按已知方式由杀死的流感病毒株制备。正如将注意到的那样，这类灭活完整病毒制剂是前述纯化制剂的前体。本发明的疫苗组合物优选适合于递送给粘膜表面，最优选适合于经口递送或鼻内递送。本发明组合物中所用的脱乙酰壳多糖优选是水溶性的。脱乙酰壳多糖有利地是脱乙酰化的壳多糖，它被至少75％、优选至少80％脱乙酰。更优选的是，脱乙酰壳多糖被至少85％脱乙酰，特别优选88％～90％脱乙酰。一种具体的脱乙酰化的脱乙酰壳多糖是可从PronovaBiopolymerofDrammen，Norway得到的“SeaCureG210”脱乙酰壳多糖(多D-葡糖胺氢化谷氨酸酯)。这种谷氨酸酯衍生物形式的脱乙酰壳多糖具有＞80％的脱乙酰化度。另一方面，本发明提供了一种使宿主对流感感染具有免疫力的方法，该方法包括给宿主施用(i)得自第一容器的包括前面定义的流感病毒抗原的抗原性制剂，和(ii)得自第二容器的有效辅助量的前面定义的脱乙酰壳多糖。第一和第二容器的内容物可大体上同时施用，即同时或彼此间隔几分钟施用，或者可以彼此留出一定间隔地施用。例如，可以给宿主预先施用脱乙酰壳多糖，再施用抗原性制剂。第一和第二容器可以是完全分开的，或者可以由同一涂药装置的分开的小室构成。例如，在容器是分开的情况中，它们可以试剂盒形式提供，该试剂盒包括第一和第二气雾剂配药器或第一和第二注射器。当第一和第二容器形成同一涂药器的部分时，它们可以被例如多筒注射器的两个筒所限定。在一个小室中含有流感抗原性制剂而在另一个小室中含有脱乙酰壳多糖组合物的这类涂药器构成本发明又一个方面。另一方面，本发明提供了一种通过给患者施用下列物质来诱导一种保护性粘膜免疫应答和一种系统性免疫应答的方法(i)得自第一容器的包括前面定义的流感病毒抗原的抗原性制剂，和(ii)得自第二容器的有效辅助量的前面定义的脱乙酰壳多糖。再一方面，本发明提供了一种通过给患者施用下列物质来诱导一种保护性IgA粘膜免疫应答和一种IgG系统性免疫应答的方法(i)得自第一容器的包括流感病毒抗原的抗原性制剂，和(ii)得自第二容器的有效辅助量的脱乙酰壳多糖，其中，抗原性制剂和脱乙酰壳多糖如前述定义。又一方面，本发明提供了一种通过与得自分开的容器的前面定义的脱乙酰壳多糖共同施用来增强流感病毒抗原的免疫应答的方法。本发明的组合物可通过许多途径施用，优选粘膜施用，特别是鼻内施用。鼻内组合物可以配制成例如液体或干粉，作为气雾剂或滴剂施用。作为滴鼻剂施用的组合物可以含有这类组合物中通常包括的类型的一种或多种赋形剂，例如防腐剂、粘度调节剂、渗透调节剂(tonicityadjustingagent)、缓冲剂等。本发明还考虑了提供用于分配流感病毒抗原和脱乙酰壳多糖的鼻内制剂的装置。例如，配药装置可以采取气雾剂递送系统的形式，并且可以设置成只分配单一剂量，或多个剂量。因此，第一和第二容器可以适用于气雾剂配药装置。将给患者施用一定量的抗原性制剂，该用量足以刺激患者的保护性免疫应答。例如，可以给患者施用一个或多个剂量的抗原性制剂，每个剂量含有1-250微克、更优选1-50微克的由每一病毒株制备的蛋白质。例如，当血胶精和神经氨酸苷酶制剂是从三个病毒株(例如，两个A型流感病毒株和一个B型流感病毒株)制备时，施用的病毒蛋白的总剂量范围是3-150微克。现参照附图和下列实施例来阐述本发明而不是限定它。图1表示用灭活完整流感A/Texas(WIV)免疫的小鼠的血清IgG抗血胶精应答。每个线条表示5只小鼠的对数几何平均效价。误差线表示几何平均的1个标准误差。图2表示用WIV免疫的小鼠中鼻IgA抗流感A/Texas/WIV应答。象图1那样，每个线条表示4只小鼠的几何平均效价，误差线表示几何平均的1个标准误差。图3a和3b表示采用ELISPOT测定用WIV免疫的小鼠中鼻和肺WIV特异性抗体分泌细胞(ASC)。实施例1制备脱乙酰壳多糖制剂通过室温下搅拌48-60小时把脱乙酰壳多糖谷氨酸酯溶于0.5％(w/v)氯化钠中而制备1％的脱乙酰壳多糖谷氨酸酯溶液即一种脱乙酰化度大于80％的中等粘度脱乙酰壳多糖。用0.1MNa2HPO4把所得溶液的pH提高到5.8-6.0。所用脱乙酰壳多糖谷氨酸酯的等级为PronovaBiopolymerofDrammen，Norway以商品名“SeaCure+G210”(产品代码27150210)出售的中等粘度等级。实施例2制备流感抗原性制剂纯化的表面抗原(PSA)2A.将含有流感A/Texas蛋白的流感纯化的表面抗原(PSA)(得自EvansMedicalLimited，Speke，Merseyside，UnitedKingdom)配制于磷酸缓冲盐水(PBS)中，得到大约1mg/ml的蛋白浓度。所述PSA几乎全部由刺突蛋白质(spikeprotein)血胶精(HA)组成，尽管它确实含有一些神经氨酸苷酶。完整流感疫苗(WIV)2B.把A/Texas株的完整流感疫苗(WIV)在PBS中配制成1mg/ml蛋白浓度。实施例3制备脱乙酰壳多糖/流感混合物制备脱乙酰壳多糖谷氨酸酯溶液和PSA或WIV溶液的1∶1混合物，得到含0.5％脱乙酰壳多糖谷氨酸酯和0.5mg/ml流感抗原的鼻内疫苗混合物。还制备了含有相同浓度WIV或PSA但不含脱乙酰壳多糖谷氨酸酯的对照溶液。实施例4小鼠免疫研究按下述给各组5只成年(6-8周)雌性BALB/c小鼠施用如上述实施例制备的组合物组制剂剂量/小鼠(总蛋白)AWIV+脱乙酰壳多糖10μg(分开施用)BWIV+脱乙酰壳多糖10μg(混合物)CPSA+脱乙酰壳多糖10μg(分开施用)DPSA+脱乙酰壳多糖10μg(混合物)EWIV(A/Texas)10μgFPSA(A/Texas)10μg对B、D、E、F组的小鼠给予20μl体积(每个鼻孔10μl)进行鼻内免疫。B和D组小鼠接受前面实施例3所述的制剂，而E和F组对照小鼠分别接受实施例2B和2A的制剂而没有脱乙酰壳多糖。A和C组小鼠首先每个鼻孔接受5μl的实施例1的脱乙酰壳多糖组合物，然后在5分钟恢复期之后每个鼻孔分别给予5μl的实施例2B和2A的流感制剂。所用免疫和抽样方案示于表1。表1免疫和抽样方案在抽样点1和2，对每组的所有小鼠放血采样。抽样点3的抽样通过心脏穿刺进行，其后切除小鼠的头，用1mlPBS+1％牛血清白蛋白灌洗其鼻道。抗体和ELISPOT分析按传统方式采用ELISPOT和ELISA技术分析由上述免疫方案刺激的免疫应答。所以，用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清IgG抗A/Texas应答，结果示于图1和下面表2。还用ELISA技术测定了鼻IgA抗A/Texas应答，该测定结果示于图2和下面表3。在所有测定中，把完整流感疫苗(WIV)用作抗原。把扣除背景对照(无样品)后得到IgG测定的0.3个OD单位和IgA测定的0.1个OD单位的样品稀释率计算为ELISA终点效价。结果表2血清抗WIV血清应答(表2和图1)</tables>*阳性数/试验数+几何平均效价鼻IgA抗WIV应答表3鼻IgA抗A/Texas应答EU/ug总IgA(各个应答-几何平均+sem)鼻和肺粘膜中对WIV具有特异性的抗体分泌细胞(ASC)在第3个抽样点，从5只小鼠的各组的鼻粘膜和肺主质中分离淋巴细胞。汇集各个小鼠的淋巴细胞，用ELISPOT测定分泌IgA、IgG和IgM抗流感抗体的细胞。结果示于图3a和3b。图3a和3b中，用ELISPOT测定法检测的抗体分泌细胞表示为阳性细胞数/107总细胞(淋巴细胞)。图3a表示脱乙酰壳多糖对实施例2A的PSA制剂的鼻和肺免疫原性的影响，而图3b表示脱乙酰壳多糖对实施例2B的WIV制剂的鼻和肺免疫原性的影响。图3a和3b所示结果表明，脱乙酰壳多糖增强对PSA和WIV二者的IgAASC应答，对PSA观察到更大的增强效果。在鼻粘膜中产生最强的ASC应答。而IgAASC是占优势的。肺应答主要是IgG分泌细胞。总体上讲，与首先施用脱乙酰壳多糖时相比，当与脱乙酰壳多糖一起配制时PSA和WIV二者都能诱发更强的ASC应答。就IgAASC应答而言，含有PSA和脱乙酰壳多糖二者的制剂产生比首先施用脱乙酰壳多糖时获得的应答更强的应答。不过，在含有WIV和脱乙酰壳多糖二者的制剂诱发的IgAASC应答和先脱乙酰壳多糖再WIV诱发的IgAASC应答之间没有显著差异。上述结果表明，经由粘膜途径分开施用流感抗原和脱乙酰壳多糖可以获得良好的免疫应答。这就提供了一个优点，即可以避免与注射给药相关的潜在问题。上述实施例仅是本发明实例，而不是以任何方式限定本发明的范围。本发明的范围只由所附权利要求书限定。权利要求1.一种试剂盒形式的疫苗组合物，该试剂盒包括含有包括流感抗原的抗原性制剂的第一容器；以及含有有效辅助量的脱乙酰壳多糖的第二容器。2.根据权利要求1的疫苗组合物，其中第一容器中的抗原性制剂包括血胶精和神经氨酸苷酶流感抗原。3.根据权利要求2的疫苗组合物，其中第一容器中的抗原性制剂是完整流感病毒制剂。4.根据权利要求2的疫苗组合物，其中第一容器中的抗原性制剂包括纯化的血胶精和神经氨酸苷酶流感抗原。5.根据权利要求3或4的疫苗组合物，其中纯化的血胶精和神经氨酸苷酶流感抗原以半径在10～25纳米范围内的玫瑰花结形式存在。6.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物，它适合于粘膜施用。7.根据权利要求6的疫苗组合物，它适合于鼻内施用。8.根据权利要求6的疫苗组合物，它适合于口服。9.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中的脱乙酰壳多糖是至少被80％脱乙酰的脱乙酰壳多糖。10.根据权利要求8的疫苗组合物，其中脱乙酰壳多糖至少被85％脱乙酰。11.根据权利要求10的疫苗组合物，其中脱乙酰壳多糖被88％～90％脱乙酰。12.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中脱乙酰壳多糖是水溶性的。13.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中第二容器中脱乙酰壳多糖存在于pH在5.5～6.5范围内的溶液中。14.根据权利要求13的疫苗组合物，其中脱乙酰壳多糖溶液的pH约为5.8～6。15.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中第一和第二容器适合于与鼻内施用所含内容物用的配药器相配合。16.根据前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中第一和第二容器由同一配药装置中分开的小室构成。17.根据权利要求16的疫苗组合物，其中第一和第二容器由一个多筒注射器的两个筒构成。18.一种药品，它包括适合于鼻内递送组合物的配药装置，以及前述权利要求中任一项定义的疫苗组合物。19.根据权利要求18的药品，其中配药装置是气雾剂递送系统。20.一种使宿主对流感感染具有免疫力的方法，该方法包括给宿主分开地施用下列物质(i)得自第一容器的包括前述定义的流感病毒抗原的抗原性制剂，以及(ii)得自第二容器的有效辅助量的脱乙酰壳多糖，其中抗原性制剂和脱乙酰壳多糖如权利要求1-17中任一项所定义。21.一种通过给患者施用下列物质来增强保护性IgA粘膜免疫应答和IgG系统性免疫应答的方法(i)得自第一容器的包括流感病毒抗原的抗原性制剂，和(ii)得自第二容器的有效辅助量的脱乙酰壳多糖，其中抗原性制剂和脱乙酰壳多糖如权利要求1～21中任一项所定义。22.一种当鼻内施用时通过与得自分开的容器的权利要求1-17中任一项定义的脱乙酰壳多糖共同施用来增强流感病毒抗原的免疫应答的方法。全文摘要本发明提供了一种试剂盒形式的疫苗组合物,该试剂盒包括:含有包括流感抗原的抗原性制剂的第一容器;以及含有有效辅助量的脱乙酰壳多糖的第二容器。第一容器中的抗原性制剂优选包括血胶精和神经氨酸苷酶流感抗原。文档编号A61K39/39GK1201396SQ9619804公开日1998年12月9日申请日期1996年11月1日优先权日1995年11月1日发明者S·N·查特菲尔德申请人:麦迪瓦赫丁公司