重组流感疫苗的制作方法

专利名称：：重组流感疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及多价流感病毒疫苗的生产和组装，所述疫苗利用分离的衍生自人和/或禽流感病毒的同佐剂组合的流感抗原蛋白或蛋白片段并包含含有衍生自真核或原核细胞的融合到人和/或禽流感病毒抗原肽上的病毒衣壳蛋白的嵌合病毒样颗粒载体。本发明也涉及衍生自流感蛋白的新抗原肽，和含有该抗原肽的组合物。
背景技术：
：注射疫苗是一种最有力和有效的保护动物和人类免于致病媒介感染的方式。通常，疫苗被设计通过激发针对抗原蛋白、肽或其它疫苗中含有的免疫原结构物的宿主免疫反应，来提供对致病媒介的保护性免疫，从而降低宿主暴露于致病媒介时被感染的可能性。流感病毒是正粘病毒科家族的一员，包括三种亚型，这些亚型通过它们的核心蛋白进行分类并分别命名为流感A、B型流感和C型流感。流感A病毒感染范围为哺乳动物和禽类，而类型B和C主要限于人类感染。流感A病毒主要导致每年的流行和偶尔的大流行，而B型流感病毒引起每2-4年一次的暴发，但通常不伴随大流行。病毒株根据衍生的宿主物种、地理地点、分离年份、序列号进行分类，以及对流感A而言，通过血细胞凝集素和神经氨酶的亚型的血清型特征进行分流感病毒是基本上包含9种蛋白的分段的反义RNA病毒，这9种蛋白分别是基质(Ml);质子-离子通道(M2);血细胞凝集素(HA)，神经氨酶(NA);核蛋白(NP);聚合酶碱性蛋白1(PB1);聚合酶碱性蛋白2(PB2);聚合酶酸性蛋白(PA);和非结构蛋白2(NP2)。HA、NA、M1和M2蛋白是膜相关蛋白，其中HA和NA蛋白分别是负责病毒吸附和进入宿主细胞的糖蛋白。分类为H1-H15的15类血细胞凝集素抗原和分类为Nl-N9的9类神经氨酶抗原已经在流感A病毒中鉴定出来。HA蛋白通过结合到含有唾液酸的宿主细胞表面受体启动病毒到细胞的吸附。人流感病毒的血细胞凝集素优先地结合到含有a2,6-半乳糖键的唾液酸受体上，而禽流感病毒优先地结合到含有a2，3-半乳糖键的细胞上。这些结合偏好与唾液酸a2，6-半乳糖键在人上皮细胞上占优势和a2,3-半乳糖键在禽肠上皮细胞上占优势相关联。参见，例如，RogersGN,PaulsonJC,DanielsRS，SkehelJJ,WilsonIA,WileyDC(1983)"Singleaminoacidsubstitutionsininfluenzahaemagglutininchangereceptorbindingspecificity,"Atowre304:76-78;ConnorRJ，KawaokaY，WebsterRG,PaulsonJC(1994)"Receptorspecificityinhuman,avianandequineH2andH3influenzavirusisolates,"Wra/ogy205:17-23;ItoT，SuzukiY,MitnaulL，VinesA，KidaH，KawaokaY(1997)"ReceptorspecificityofinfluenzaAvirusescorrelatewithagglutinationoferythrocytesfromdifferentanimalspecies,"Wra/ow227:492-99。尽管负责受体结合特异性的分子机制所知甚少，但据认为，禽类衍生的流感血细胞凝集素必须获得人类受体结合特异性来产生能持久地进行人际传播的流感病毒株。参见，例如，StephensonI,KGNicholson,JMWood,MCZambon,andJMKatz(2004)"Confrontingtheavianinfluenzathreat:vaccinedevelopmentforapotentialpandemic,"TheLancetInfectiousDiseases4:499-509。定点突变研究已经显示，该改变仅需要一个或两个氨基酸突变。参见MatrosovichM，TuzikovA,BovinN，etal.(2000)"EarlyalterationsofthereceptorbindingpropertiesoftheHI,H2andH3avianinfluenzavirushemagglutininsaftertheirintroductionintomammals,"JVirol74:8502-12。一旦吸附发生，NA蛋白就起始受体介导的细胞内吞和宿主细胞/病毒膜融合。HA蛋白然后在内涵体酸性环境中经历构象变化，及，同M2蛋白共同介导M1蛋白从核壳体相关的核蛋白(RNPs)上的释放，然后Ml蛋白被定向到细胞核用于病毒RNA的合成。M2蛋白是97个氨基酸的非糖基化跨膜蛋白。LambRA,LaiC-J,ChoppinPW(1981)"SequencesofmRNAsderivedfromgenomeRNAsegment7ofinfluenzavims:collinearandinterruptedmRNAscodeforoverlappingproteins,"PNAS78:4170-4;LambRA,ZebedeeSL,RichardsonCD(1985)"InfluenzavirusM2proteinisanintegralmembraneproteinexpressedontheinfected-cellsurface,"Cell40:627-33。它在病毒颗粒的病毒膜中形成同源四聚体，但是当同HA和NA相比时，它的数目相当低。然而，它在被感染细胞的质膜中高密度的出现。ZebedeeSL，LambRA(1988)"InfluenzaAvimsM2protein:monoclonalantibodyrestrictionofvirusgrowthanddetectionofM2invirions,"JVirol62:2762-72。M2蛋白被认为促进了RNP复合物从融合后的病毒膜上的释放。它显示出了质子转运的活性，该活性降低了病毒跨膜蛋白从ER到质膜流出时转运小囊泡内的pH值，阻止了HA的早发酸诱导构象改变。参见MozdzanowskaKetal(2003)"InductionofinfluenzatypeAvimsspecificresistancebyimmunizationofmicewithasyntheticmultipleantigenicpeptidevaccinethatcontainsectodomainsofmatrixprotein2,"Vaccine21:2616-'2626;SteinhauerDA,WhartonSA,SkehelJJ,WileyDC，HayAJ(1991)"Amantadineselectionofamutantinfluenzaviruscontaininganacid-stablehemagglutininglycoprotein:evidenceforvirus-specificregulationofthepHofglycoproteintransportvesicles,"ProcNatlAcadSci88:11525-9;PintoLH，HolsingerLJ,LambRA(1992)"InfluenzavirusM2proteinhasionchannelactivity,"Cell69:517-28;ZhimovOP(1990)"SolubilizationofmatrixproteinMl/MfromvirionsoccursatdifferentpHfororthomyxo-andparamyxoviruses,"Virology176:274-9。M2蛋白包含在能感染人类的A型流感病毒中高度保守的23个氨基酸长度的外功能区(M2e)。实际上，9个N末端氨基酸在该病毒感染性人类毒株中是完全保守的，并且在前15个N末端氨基酸中仅有较小程度的结构差异。ZebedeeSL,LambRA(1988)"InfluenzaAvimsM2protein:monoclonalantibodyrestrictionofvirusgrowthanddetectionofM2invirions,"JVirol62:2762-72;ItoT,GormanOT,KawaokaY,BeanWJ,WebsterRG(1991)"EvolutionaryanalysisoftheinfluenzaAvirusMgenewithcomparisonoftheMlandM2proteins,"J.Virol.65:5481-8。一般的，禽流感病毒不能在人类中有效的复制。BeareAS,WebsterRG(1991)"Replicationofavianinfluenzavirusesinhumans,"ArchVirol119:37-42。然而，已知禽流感病毒的某些亚型能在人类呼吸道内复制。已经有大量确证的禽流感病毒传播到人的病例。参见StephensonI,KGNicholson,JMWood,MCZambon,andJMKatz(2004)"Confrontingtheavianinfluenzathreat:vaccinedevelopmentforapotentialpandemic,"TheLancetInfectiousDiseases4:499-509;WHOdiseasealert(2004)"ConfirmedhumancasesofavianinfluenzaH5N1,"http:〃www.who.int/csr/disease/avian—influenza/en/;HienTT,LiemNT,DungNT,etal(2004)"Avianinfluenza(H5N1)in10patientsinVietnam,"7V五"g/JA^d350:1179-88。某些型的禽流感病毒感染人类的能力增加了能提供禽类/人类重配株病毒出现环境的物种库。总体上，存在两类流感疫苗，灭活全流感病毒疫苗和灭活亚病毒粒子病毒疫苗。全病毒疫苗含有完整的灭活病毒粒，而亚病毒粒子疫苗含有大部分病毒结构蛋白和某些病毒外膜蛋白。这些病毒疫苗每年都被组成预计将在给定流感季的人类群体中流通的A型流感和流感类型B毒株的三价混合物。WHO每半年检査一次疫扭的组成并根据流行亚型的情况更新抗原内容物以提供抗原良好匹配的疫苗。例如，对于2004-2005流感季，三价组合物包括A/NewCaledonia/20/99(H1N1);A/Wyoming/03/2003(H3N2)，它是A/Fujian/411/2002-样病毒；和B/Shanghai/361/2002-样病毒(即B/Jiangsu/10/2003或B/Jilin/20/2003)。该类疫苗的例子包括Fluzone(Connaught)、弗威灵(Chiron)和Flu-shield(Wyeth-Lederle)。近来，Medlmmune研制了用于鼻内给药的减活流感疫苗FluMist，该疫苗已经得到了FDA批准允许其在美国商业使用。这些疫苗通常产生病毒株特异的体液免疫，具有降低的抵抗抗原漂移病毒的功效，并且不能有效抵抗不相关毒株。参见StephensonI,NicholsonKG,WoodJM,ZambonMC，andKatzJM(2004)"Confrontingtheavianinfluenzathreat:vaccinedevelopmentforapotentialpandemic,"TheLancet:InfectiousDiseases4:499-509。在上面描述的免疫接种利用的灭活和减毒病毒在鸡胚尿囊腔中生产。这种生产方法是耗时的，需要花费多达6个月的时间来生产并且高度易受污染的影响。2004年，Chiron公司流感病毒生产中的污染导致了流感疫苗高度周知和引起争论的短处。该污染在2004年8月发现，对制造商而言，这个时间太晚了以至于不能为那个流感流行季生产新批次的疫苗。另外，当前的生产方法需要预测最可能在流感季期间出现的一个或多个特定毒株。这样一个必要条件连同当前的生产方法限制了修改流感疫苗的生产以针对未预测到的病毒株的能力。因此，存在对能快速生产并能被容易修改以允许抵抗新出现病毒的免疫接种改良疫苗的需求。
发明内容本发明提供了用作抵抗病毒特别是流感病毒的疫苗的组合物，该组合物包含i)至少一条衍生自流感病毒并融合到至少一条衍生自植物病毒的衣壳蛋白且形成重组衣壳融合肽的肽，其中的重组衣壳融合肽能进行组装来形成病毒或病毒样颗粒，和ii)至少一条衍生自人或禽流感病毒的分离抗原蛋白或蛋白片段。这样的策略利用了同抗原蛋白或蛋白片段组合的病毒或病毒样颗粒的免疫原方面来生产可能会提供更广泛的抵抗人和/或禽流感病毒的保护性免疫的疫苗。在本发明的一个方面，衍生自流感病毒并融合到植物衣壳蛋白的肽是保守的流感病毒表位。在一个实施方案中，该保守表位是保守的人流感病毒表位。通过利用保守的流感表位作为病毒或病毒样颗粒的抗原插入物，组合物的核心成分在每年的基础上不需要重新工程化。相反的，当有新流感病毒株出现时仅有分离抗原蛋白或蛋白片段需要改变。因为抗原蛋白或蛋白片段能被重组生产，因此用作激发人或动物抵抗新出现流感病毒株的免疫反应的疫苗的组合物能被快速生成。在一个具体的实施方案中，保守的流感肽衍生自M2蛋白。在一个实施方案中，M2衍生的肽从包含SEQIDNos:1-5和22-24的组中选择。本发明的实施方案提供了从包含SEQIDNos:3、22、23和24的组中选择的M2流感蛋白衍生的肽序列。此外，提供了SEQIDNos:3、22、23或24的片段、衍生物和同系物。在其他实施方案中，保守表位衍生自NP蛋白。在一个实施方案中，NP肽从包含SEQIDNos:8-10的组中选择。在另一个实施方案中，保守表位衍生自HA蛋白。在一个实施方案中，HA肽从包含SEQIDNos:6和7的组中选择。在其他实施方案中，任何衍生自流感病毒并从包含M2、NP或HA的组中选择的保守流感肽的组合均能被融合到衣壳蛋白。在一个实施方案中，衣壳融合肽包含M2、NP和HA肽。在另一个实施方案中，衣壳融合肽包含M2和NP保守肽。在另一个实施方案中，衣壳融合肽包含M2和HA肽。在另一个实施方案中，衣壳融合肽包含HA和NP保守肽。本发明利用衍生自植物病毒的衣壳蛋白来构建衣壳融合肽。带有融合流感肽的衣壳蛋白能在体内或体外自我组装来形成病毒或病毒样颗粒。在一个实施方案中，病毒或病毒样颗粒不包括宿主细胞质膜蛋白或宿主细胞壁蛋白。在一个实施方案中，植物病毒将从是二十面体(包括正的、等角的、半等角的和成对的或"一胎双生的"二十面体)、多面体(包括球状的、卵形的和柠檬形的)、杆状的(包括杆或子弹形的，和纺锤形或雪茄烟形的)和螺旋状的(包括棒状、圆筒状和丝状的)的病毒中选择。在某些实施方案中，植物病毒能是二十面体植物病毒毒种。在一个实施方案中，病毒衣壳蛋白能衍生自豇豆褪绿斑点病毒(CCMV)或豇豆花叶病毒(CPMV)。在另外的实施方案中，植物病毒从CCMV或CPMV中选择，并且衣壳包括至少一个从包含SEQIDNos:3，22，23和24的组中选择的插入物。在本发明的一个方面，同病毒或病毒样颗粒组合的分离抗原蛋白或蛋白片段是衍生自新出现的包括人或禽类流感病毒的流感病毒株的流感蛋白。在一个实施方案中，该蛋白或蛋白片段衍生自禽流感病毒。在本发明的一个实施方案中，抗原蛋白或蛋白片段衍生自从包含基质(Ml)、质子-离子通道(M2)、血细胞凝集素(HA)、神经氨酶(NA)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)和非结构蛋白2(NP2)的组中选择的流感病毒蛋白。在本发明的一个实施方案中，蛋白或蛋白片段衍生自禽流感HA或NA。在某些实施方案中，病毒或病毒样颗粒同多于一个的分离抗原蛋白或蛋白片段组合。在某些实施方案中，这些分离抗原肽或肽片段衍生自相同的物种。在其他实施方案中，这些分离抗原肽或肽片段衍生自不同的物种。在某些实施方案中，病毒或病毒样颗粒同至少一种NA蛋白或蛋白片段和至少一种HA蛋白或蛋白片段组合。在某些实施方案中，NA和/或HA片段衍生自禽流感病毒。在某些其他实施方案中，NA和/或HA片段衍生自人流感病毒。在其它实施方案中，病毒样颗粒同至少一个NA蛋白或蛋白片段、至少一个HA蛋白或蛋白片段和任何从包含M1、M2、NP、PB1、PB2、PA和NP2的组中选择的禽流感病毒蛋白或蛋白片段的组合相组合。在某些实施方案中，NA蛋白或蛋白片段衍生自从包含Nl、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的组中选择的流感NA蛋白的组。在另外的实施方案中，HA蛋白或蛋白片段衍生自流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14和H15蛋白。在某些实施方案中，分离抗原肽是和病毒或病毒样颗粒在一起的混合物中但并不共价连接到病毒或病毒样颗粒上。该混合物能包括另外的辅药。在一个实施方案中，至少一条抗原蛋白片段短于全长蛋白。在某些实施方案中，抗原蛋白片段衍生自禽或人流感病毒。在某些实施方案中，该蛋白片段包含至少IO、15、20、25、50、75、100、150、200或更多个氨基酸。'在一个实施方案中，衍生自流感病毒的肽、衍生自植物病毒的衣壳蛋白和衍生自流感病毒的抗原蛋白或蛋白片段能被改变来提供增强的期望的特征。这样的特征包括增强的抗原性、在宿主细胞中增强的重组表达、更有效的组装或提高的共价结合性质。在一个实施方案中，插入到衣壳蛋白的流感肽通过改变它的氨基酸序列进行修改，其中的氨基酸改变不降低该肽的抗原性质。在另一个实施方案中，插入到衣壳蛋白的流感肽通过诸如糖基化、磷酸化或脂修饰等翻译后修饰进行修饰。在另外的实施方案中，分离抗原蛋白或蛋白片段能通过改变它的氨基酸序列进行修改，该氨基酸改变不降低该肽的抗原性。在另一个实施方案中，分离抗原蛋白或蛋白片段通过翻译后进行修饰。在本发明的其他实施方案中，至少一条分离蛋白或蛋白片段能被共价连接到含所述肽的病毒或病毒样颗粒的表面。在另一个实施方案中，至少一条由少于所述蛋白整个氨基酸序列组成的禽或人流感病毒蛋白片段被共价连接到含所述肽的病毒或病毒样颗粒的表面。在一个实施方案中，被共价连接的抗原蛋白片段包括至少10、15、20、25、50、75、100、150、200或更多个氨基酸残基。在本发明的另一个实施方案中，至少一条衍生自流感病毒的M2、NP或HA肽被融合到衍生自植物病毒的衣壳蛋白并形成第一重组衣壳融合肽，然后该重组衣壳融合肽同至少一条衍生自禽和/或人流感病毒并融合到衍生自植物病毒的衣壳蛋白的肽组合来形成第二重组衣壳融合肽。在这个实施方案中，第一重组衣壳融合肽和第二重组衣壳融合肽均能在体内或体外组装来形成病毒或病毒样颗粒。产生的病毒样颗粒然后能同衍生自流感病毒的分离抗原蛋白组合。在一个实施方案中，在第二重组衣壳融合肽中包含的肽衍生自从包含M1、M2、hHA、NA、NP、PB1、PB2、PA和NP2的组中选择的人或禽流感病毒蛋白。在本发明的一个实施方案中，在第二重组衣壳融合肽中含有的肽衍生自流感病毒蛋白HA或NP。在其它实施方案中，包含在第二重组衣壳融合肽中的肽是NP。在其它实施方案中，包含在第二重组衣壳融合肽中的肽是HA。在某些实施方案中，HA肽衍生自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、HB、H14和H15蛋白。在本发明的另一个实施方案中，提供了包含病毒或病毒样颗粒的组合物，其中该病毒或病毒样颗粒包含衍生自植物病毒的衣壳蛋白，该衣壳蛋白融合到i)至少一条衍生自流感病毒的保守肽和ii)至少一条额外的分离流感病毒肽，其中的衣壳融合肽能在体内或体外组装成病毒或病毒样颗粒，和iii)衍生自流感病毒的抗原肽。在另一个实施方案中，本发明提供了包含病毒或病毒样颗粒混合物的组合物，其中的混合物包含i)含有至少一条衍生自流感病毒的肽的第一病毒或病毒样颗粒，和ii)至少一种含有至少一条不同于包含在第一病毒或病毒样颗粒中的流感病毒肽的第二病毒或病毒样颗粒，和iii)衍生自流感病毒的分离抗原肽。在一个实施方案中，所述流感肽被融合到衍生自植物病毒的衣壳蛋白。在本发明的某些方面，所述组合物能被用于疫苗策略来诱导人类或动物的免疫反应。为了激发免疫反应，所述组合物能同佐剂组合并以有效剂量给与到人或动物。在其他实施方案中，所述组合物未与佐剂组合而直接给与到人或动物。在某些实施方案中，所述组合物包括诸如CpG序列的免疫刺激核酸。在某个实施方案中，免疫刺激核酸能被包裹到病毒样颗粒中。本发明的实施方案包括的组合物能以基本纯化的形式，例如基本不含宿主细胞的形式给与到人或动物。在其他实施方案中，所述组合物能以部分纯化的形式，例如以包含可以是植物细胞蛋白的宿主细胞蛋白的形式给与到人或动物。在本发明的另一个方面，提供了生产用在人或动物流感疫苗中的组合物的方法，该方法包含i)提供编码连接到流感病毒肽序列的植物病毒衣壳蛋白序列的第一核酸，并在宿主细胞中表达该第一核酸来生产衣壳融合肽；ii)组装该衣壳融合肽来形成病毒或病毒样颗粒；iii)提供至少一种编码至少一条衍生自流感病毒株的抗原蛋白或蛋白片段的第二核酸，并在宿主细胞中表达该第二核酸来生产该抗原蛋白或蛋白片段；iv)分离并纯化该抗原蛋白或蛋白片段；和v)组合该病毒或病毒样颗粒和该分离抗原蛋白或蛋白片段来形成能给与到人或动物的组合物。在某些实施方案中，该病毒或病毒样颗粒在植物宿主中生产，例如，在完整植物或植物细胞培养物中。在其他实施方案中，该病毒或病毒样颗粒在荧光假单胞菌宿主细胞中生产。在其他实施方案中，衣壳融合肽在诸如植物或荧光假单胞菌细胞中表达并且病毒或病毒样颗粒在体外进行组装。在一个实施方案中，抗原蛋白或蛋白片段能在诸如完整植物或植物细胞培养物的真核细胞中生产。在另外的实施方案中，该抗原蛋白或蛋白片段能在任何原核细胞中生产，例如，在大肠杆菌或荧光假单胞菌中。在某些实施方案中，所述衣壳融合肽和抗原蛋白或蛋白片段在同一种真核细胞中进行共表达，而且该衣壳融合肽在体内组装来形成病毒或病毒样颗粒。在其他实施方案中，该衣壳融合肽和抗原蛋白或蛋白片段在诸如荧光假单胞菌细胞的原核细胞中共表达，并且，该衣壳融合肽在体内组装来形成病毒样颗粒。图1:显示了所述流感疫苗的示意图，该疫苗包含展示共价连接到所述VLP的流感病毒表位和流感病毒蛋白或蛋白片段抗原的病毒或病毒样颗粒。在颗粒中的免疫剌激核酸序列(CpGs)的衣壳化也被显示。图2:显示了流感病毒蛋白或蛋白片段抗原到病毒或病毒样颗粒的共价结合的示意图。图3:显示了VLP组装过程中免疫刺激核酸序列(CpGs)在VLP中衣壳化的示意图。图4:显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同M2e-1流感病毒肽融合的CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。图5:显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同M2e-2流感病毒肽融合的CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。图6:显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同NP55-69流感病毒肽融合的CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。图7:显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同NP147-158流感病毒肽融合的CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。图8:显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同HA91-108流感病毒肽融合的CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。图9:显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同M2e-1流感病毒肽融合的CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达和纯化。图10:显示了通过使用抗CCMV和抗M2抗体14B的WesternBlotting检测到的同M2e-1流感病毒肽融合的CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。M2e肽被抗M2抗体所识别。图11:显示了通过SDS-PAGE和使用抗CPMV和抗M2抗体14B的WesternBlotting检测到的同M2e-1流感病毒肽融合的CPMV在植物中的表达。M2e肽被抗M2抗体所识别。图12:显示了来源于H5N1分离毒株的包含信号肽、HA1和HA2、跨膜区和标明胞质尾区的HA蛋白的序列。图13:显示了H5N1HA单体的结构。图14:显示了用于在植物中表达流感蛋白或蛋白片段的基于PVX的病毒载体的示意图。，图15:显示了用于在植物中生产流感病毒蛋白的基于植物病毒载体的系统的示意图。被工程化来表达流感病毒蛋白或蛋白片段的植物病毒载体能像质粒DNA、病毒RNA—样通过机械传播或通过农杆菌介导的传递被传递到植物。具体实施方式I、衣壳融合肽本发明利用至少一条衍生自流感病毒并融合到衍生自植物病毒的衣壳蛋白并形成重组衣壳融合肽的肽。该重组衣壳融合肽能组装形成不含宿主细胞质膜的病毒或病毒样颗粒。该重组衣壳融合肽能含有流感病毒衍生肽。在本发明的实施方案中，该重组衣壳融合肽含有衍生自流感病毒蛋白的肽。在另外的实施方案中，该肽衍生自保守肽和它的衍生肽或异型同源肽。该保守肽能衍生自M2、HA或NP蛋白。在某些实施方案中，衍生自M2、HA或NP的保守肽或它的衍生物或同系物的一条、多条或组合能被融合到衣壳蛋白。衍生物或同系物通常被认为是同参考序列具有至少75、80、85、90、95、98或99%同一性的氨基酸序列。g、义,/或建郝龄,在本发明的一个实施方案中，衍生自人或禽流感病毒的肽同衍生自植物病毒的衣壳蛋白遗传融合。人和禽流感病毒蛋白序列在本领域中是人所共知的。例如，美国国家生物技术信息中心维护了含有从分离的人和禽流感病毒毒株而来的编码蛋白的核酸序列和氨基酸序列的流感资源数据库。该数据库的网址为http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html。选来插入植物病毒衣壳蛋白的肽能衍生自全长流感病毒蛋白的氨基酸序列。在其他实施方案中，选来插入的肽在长度上包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个氨基酸残基。被选择的肽可以具有抗原肽的至少75、80、85、90、95、98或99%同源性，上述抗原肽包含从它衍生的流感蛋白内的至少4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个氨基酸残基。优选地，选来插入的流感肽包含能在人或动物体内激发免疫反应的表位。表位的确定在本领域内是人所共知的。例如，通过给与选定的肽到诸如小鼠、兔、山羊或猴子的动物，然后检验该动物的血清中针对该肽的抗体的存在，选来插入植物病毒衣壳蛋白的肽能被进行实验来测定其能否激发免疫反应。在其他实施方案中，流感衍生的抗原肽能被改变来提高插入物的特性，诸如但不限定于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性和提高的共价结合性质。Z)、魔參2嚴流感M2蛋白是97个氨基酸的膜蛋白。该蛋白在N末端有24个暴露于胞外的氨基酸残基、19个跨过脂双层的氨基酸残基和54个位于质膜胞质侧的氨基酸残基。在一个实施方案中，本发明利用的M2肽衍生自能感染人或鸟类的流感病毒的97个氨基酸的序列。该衍生肽能包含整条97个氨基酸的序列，或能是它的包含从所述97个氨基酸序列中选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或97个氨基酸残基的亚型。所选择的该肽能具有同所述的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或97个氨基酸残基的M2抗原肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。本发明另外的实施方案包括的本发明利用的M2肽衍生自所述的氨基酸胞外区域。本发明的实施方案包括的本发明利用的M2肽衍生自普遍保守的M2序列的23个氨基酸残基的胞外区域序列M2e-1(SEQIDNo:l，表l)。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽包含所述M2e-1肽的氨基酸序列亚型，该亚型包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个从所述M2e-1肽中选择的氨基酸残基。选择的该肽能具有同所述的包含SEQIDNo:l的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基的M2e-l肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他实施方案中，本发明利用的M2肽衍生自23个氨基酸残基的胞外区域序列M2e-2(SEQIDNo:2，表l)。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽包含所述M2e-2肽的氨基酸序列亚型，该亚型包含从所述M2e-2肽选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基。选择的该肽能具有同所述的包含SEQIDNo:2的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基的M2e-2肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽衍生自22个氨基酸残基的胞外区域序列M2e-3(SEQIDNo:3，表l)。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽包含所述M2e-3肽的氨基酸序列亚型，该亚型包含从所述M2e-3肽选择的至少4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基。选择的该肽能具有同所述的包含SEQIDNo:3的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的M2e-3肽序列至少75、80、85、卯、95、98或99%的同源性。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)的23个氨基酸残基的胞外区域序列(SEQIDNo:4，表l)。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽包含所述的衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)的M2肽的氨基酸序列亚型，该亚型包含从所述的衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)的M2肽选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基。选择的该肽能具有同所述的包含SEQIDNo:4的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基的衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)的M2肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一个实:&但方案中，本发明利用的M2肽衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)的23个氨基酸残基的胞外区域(SEQIDNo:5，表l)。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽包含所述的衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)的M2肽的氨基酸序列亚型，该亚型包含从所述的衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)的M2肽选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基。选择的该肽能具有同所述的包含SEQIDNo:5的至少4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基的衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)的M2肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽衍生自22个氨基酸残基的序列M2e-2(W-)(SEQIDNo:22，表l)。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽包含所述的M2e-2(W-)肽的氨基酸序列亚型，该亚型包含从所述的M2e-2(W-)肽选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基。选择的该肽能具有同所述的包含SEQIDNo:22的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或22个氨基酸残基的M2e-2(W-)肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)(W-)的22个氨基酸残基序列(SEQIDNo:23，表1)。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽包含所述的M2-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽的氨基酸序列亚型，该亚型包含从所述的A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基。选择的该肽能具有同所述的包含SEQIDNo:23的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个氣基酸残基的A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)的22个氨基酸残基序列(SEQIDNo:24，表l)。在另一个实施方案中，本发明利用的M2肽包含所述的M2-A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)肽的氨基酸序列亚型，该亚型包含从所述的M2-A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)肽选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基。选择的该肽能具有同所述的包含SEQIDNo:24的至少4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的M2-A/FortMonmouth/1/47(HlNl)(W-)肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他的实施方案中，插入到植物病毒衣壳蛋白的M2肽能是从包含SEQIDNos:1-5和22-24的组中选择的整条氨基酸序列，或它的含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个氨基酸残基的亚型。选来插入的该肽能具有同所述的包含从由SEQIDNos:1-5和22-24组成的组中选择的肽的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个氨基酸残基的肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他实施方案中，任何从包含SEQIDNos:1-5和22-24的组或它的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个氨基酸残基的亚型中选择的M2肽的组合均能被插入植物病毒衣壳蛋白中。选择的肽组合能具有同所述的包含从由SEQIDNo:1-5和22-24组成的组中选择的肽的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个氨基酸残基的肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另外的实施方案中，M2流感衍生的抗原肽能被改变来提高插入物的特征，诸如但不限于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性和提高的共价结合性质。本发明的实施方案包括，在序列SEQIDNo:1、2、4或5中的色氨酸被移除或被非色氨酸的任何氨基酸取代。表1M2肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>SLLTEVETPTKNEECRCNDSSDM2e-A/FortMonmouth/1/47(H1N1)(W-)SEQIDNo:24本发明也提供了新的M2衍生的肽。在一个实施方案中，提供了含有SEQIDNo:3的新M2肽M2e-3。在一个实施方案中，提供了同SEQIDNo:3的同源性至少为70、75、80、90、95、98或99%的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了衍生自SEQIDNo:3的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的肽。M2e-3肽衍生自M2e-1肽，其中的色氨酸被移除。色氨酸的移除提供了所述衣壳融合肽增加的组装而没有负面影响该肽的免疫原性。在一个实施方案中，所述M2e-3肽被插入到植物病毒的衣壳蛋白。本发明的实施方案包括的M2e-3肽被插入衍生自CCMV或CPMV的衣壳蛋白。在一个实施方案中，提供了包含SEQIDNo:22的新M2肽M2e-2(W-)。在一个实施方案中，提供了同SEQIDNo:22至少70、75、80、90、95、98或99%同源性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了包含衍生自SEQIDNo:22的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的肽。M2e-2(W-)肽衍生自M2e-2肽，其中的色氨酸已经被移除。在一个实施方案中，M2e-2(W-)肽被插入到衍生自植物病毒的衣壳蛋白。本发明的实施方案包括的M2e-2(W-)肽被插入到衍生自CCMV或CPMV的衣壳蛋白。在一个实施方案中，提供了包含SEQIDNo:23的新M2肽M2e-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽。在一个实施方案中，提供了同SEQIDNos:23至少70、75、80、90、95、98或99%同源性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了包含衍生自SEQIDNo:23的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的肽。M2e-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽衍生自M2e-A/PR/8/34(HlNl)肽，其中的色氨酸己经被移除。在一个实施方案中，M2e-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽被插入到衍生自植物病毒的衣壳蛋白。本发明的实施方案包括的M2e-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽被插入到衍生自CCMV或CPMV的衣壳蛋白。在一个实施方案中，提供了包含SEQIDNo:24的新M2肽M2e-A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)肽。在一个实施方案中，提供了同SEQIDNo:24至少70、75、80、90、95、98或99%同源性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了包含衍生自SEQIDNo:24的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的肽。该肽衍生自M2e-A/FortMonmouth/1/47(H1N1)肽，其中的色氨酸已经被移除。在一个实施方案中，M2e-A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)肽被插入到衍生自植物病毒的衣壳蛋白。本发明的实施方案包括的M2e-A/FortMonmouth/1/47(HlNl)(W-)肽被插入到衍生自CCMV或CPMV的衣壳蛋白。也提供了包含衣壳融合肽的新组合物，所述衣壳融合肽包含衍生自包括植物病毒的病毒的衣壳蛋白，该衣壳蛋白被融合到从包含SEQIDNos:3、22、23和24的组中选择的肽上。6、别歪^流感病毒血凝素(HA)是以带有多个折叠域的同源三体形式出现在流感病毒颗粒上的I型跨膜糖蛋白。其单体具有六个链内二硫键和七个在N末端外功能区内的N联聚糖、跨膜结构域和细胞溶质尾。Wilsonetal.(1981)"Structureofthehaemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirusat3A°resolution,"Nature289:366-373;WileyD.C.andJJ.Skehel(1987)"Thestructureandfbnctionofhemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirus,"Annu.Rev.Biochem.56:365-394。蛋白水解活化三体的外功能区晶体结构揭示了135AG长的三聚突起蛋白，在该突起蛋白中，每一个亚基具有两个主要的结构域球状NH;r末端顶部结构域和形成该突起蛋白颈部的COOH-末端结构域。该颈部结构域含有已知涉及该蛋白膜融合活性的融合肽。Wilsonetal.(1981)"Structureofthehaemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavimsat3A°resolution,"Nature289:366-373;WileyD.C.andJJ.Skehel(1987)"Thestructureandflmctionofhemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirus,"Annu.Rev.Biochem.56:365-394。在一个实施方案中，本发明利用的HA肽衍生自包含在流感病毒的从包含15类血凝素抗原H1-H15的组中选择的HA蛋白。该衍生肽能包含整条HA氨基酸序列，或它的包含从所述HA氨基酸序列中选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多个氨基酸残基的亚型。选择的该肽能具有同所述的包含从由HA氨基酸序列选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、]70、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多个氨基酸残基的流感蛋白HA抗原肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。'本发明另外的实施方案包括的本发明利用的HA肽衍生自能感染人或鸟类的流感病毒。本发明的实施方案包括的本发明利用的插入到植物病毒衣壳蛋白的HA肽衍生自H3亚型。在其他实施方案中，所述HA肽能衍生自流感病毒株A/Texas/1/77(H3N2)的333个氨基酸长的HA肽(SEQIDNo:6，表2)。CBSmithetal.(2002)"MolecularepidemiologyofinfluenzaA(H3N2)vimsre-infections,"J.Infect.Dis.185(7):980-985。在另一个实施方案中，用来插入植物衣壳蛋白的HA肽能包含SEQIDNo:6的整条HA氨基酸序列，或它的包含从SEQIDNo:6的HA氨基酸序列中选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多个氨基酸残基的亚型。选择的该肽能具有同所述的包含SEQIDNo:6的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多个氨基酸残基的HA抗原肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。本发明另外的实施方案包括的本发明利用的HA肽衍生自18个氨基酸长的序列HA91-108-A/Texas/l/77(H3N2)(SEQIDNo:7，表2)或它的衍生自流感病毒株A/Texas/1〃7(H3N2)的HA氨基酸91-108的具有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸残基的亚型。选择的该肽能具有同包含所述18个氨基酸长的序列HA91-108-A/Texas/1/77(H3N2)的HA抗原肽序列(SEQIDNo:7，表2)或它的衍生自流感病毒株A/Texas/1/77(H3N2)的HA氨基酸91-108的具有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸残基的亚型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另外的实施方案中，插入到植物病毒衣壳蛋白的HA肽能是从包含SEQIDNos:6和7的组中选择的整条氨基酸序列或它的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多个氨基酸残基的亚型。在其他实施方案中，从包含SEQIDNos:6和7的组中选择的HA肽或它的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、l卯、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多个氨基酸残基的亚型的任何组合物均能被插入到植物病毒衣壳蛋白。选择的该肽能具有同从衍生自包含SEQIDNos:6-7的组中选择的肽的HA抗原肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另外的实施方案中，流感衍生的HA抗原肽能被改变来提高插入物的特征，例如但不限于，在宿主中提高的表达，增强的免疫原性和提高的共价结合性质。表2HA肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>c,NP蛋白流感病毒核蛋白(NP)是同病毒单链RNA基因组紧密相关的螺旋状核蛋白。流感NP蛋白富含精氨酸、甘氨酸和丝氨酸残基并且在中性pH环境中具有净正电荷。A型流感NP蛋白通常包含长度为498个氮基酸的多肽，而B型流感和C型流感病毒中的同源NP多肽的长度通常分别为560个和565个氨基酸残基。参见Londoetal.(1983)"CompletenucleotidesequenceofthenucleoproteingeneofinfluenzaBvirus,"JournalofVirology47:642-648;S.Nakadaetal.(1984)"CompletenucleotidesequenceoftheinfluenzaC/California/78virusnucleoproteingene,"VimsResearch1:433-441。预测的三种流感病毒类型的NP基因氨基酸序列的比对揭示了这三种蛋白间显著的相似性，其中A型和B型的NPs显示了最高程度的保守性。参见PortelaandDigard(2002)"Theinfluenzavirusnucleoprotein:amultiflmctionalRNA-bindingproteinpivotaltovimsreplication2002，"JGV83:723-734。对从不同宿主分离来的病毒株的系统进化分析揭示，NP基因相对好地保守，其最大氨基酸差异低于11%。参见Shuetal.(1993)"AnalysisoftheevolutionandvariationofthehumaninfluenzaAvirusnucleoproteingenefrom1933to1990，"JournalofVirology67:2723-2729。在一个实施方案中，本发明利用的NP肽衍生自包含在A型流感、B或C病毒中的NP蛋白。该衍生肽能包含整条的NP氨基酸序列，或能是它的包含从所述NP氨基酸序列中选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多个氨基酸残基的亚型。选择的该肽能具有同包含从所述NP氨基酸序列选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、350、360、375、380、390、400、410'、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多个氨基酸残基的流感蛋白NP抗原肽序列至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。本发明另外的实施方案包括的本发明利用的NP肽衍生自能感染人或鸟类的流感病毒。本发明的实施方案包括的插入到本发明利用的植物病毒衣壳蛋白中的NP肽衍生自衍生自一种A型流感病毒的NP蛋白。该NP蛋白衍生自流感病毒株A/Texas/1/77(H3N2)的长498个氨基酸的NP蛋白(SEQIDNo:8，表3)或能是它的包含从SEQIDNo:8的NP氨基酸序列中选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多个氨基酸残基的亚型。选择的该肽能具有同包含从SEQIDNo:8的NP氨基酸序列中选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、320、325、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、446或更多个氨基酸残基的流感蛋白NP抗原肽序列至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。本发明的另外的实施方案包括的本发明利用的NP肽衍生自15个氨基酸长度的序列NP55-69-A/Texas/l/77(H3N2)(SEQIDNo:9，表3)或它的衍生自流感A/Texas/1/77(H3N2)病毒株NP氨基酸55-69的长度至少为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基的亚型。选择的该肽能具有同NP抗原肽序列或它的衍生自流感A/Texas/1/77(H3N2)病毒株NP氨基酸55-69的含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基的亚型至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他实施方案中，本发明利用的NP肽衍生自12个氨基酸长度的序列NP147-158-A/Texas/1/77(H3N2)(SEQIDNO:10，表3)或它的衍生自流感A/Texas/1/77(H3N2)病毒株的NP氨基酸147-158的长度至少为4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基的亚型。选择的该肽能具有同所述NP抗原肽序列或它的衍生自流感A/Texas/1/77(H3N2)病毒株的NP氨基酸147-158的具有至少4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基的亚型至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另外的实施方案中，插入到植物病毒衣壳蛋白的NP肽能是从包含SEQIDNos:8-10的组中选择的整条氨基酸序列或它的长度为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、320、325、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、4卯、495、498或更多个氨基酸残基的亚型。选择的该肽能具有同包含从含有SEQIDNos:8-10的组中选择的NP氨基酸序列中选择的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、320、325、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多个氨基酸残基的流感蛋白NP抗原肽序列至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他实施方案中，从包含SEQIDNOs:8-10的组中选择的NP肽或它的同含有长度至少为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多个氨基酸残基的流感蛋白NP抗原肽序列同源性至少为70、75、80、85、90、95、98或99。/。的衍生于含有SEQIDNOs:8-10的组的亚型的任何组合均能被插入到植物病毒衣壳蛋白中。在另外的实施方案中，衍生自流感NP的抗原肽能被改变来提高插入物的特征，例如但不限于，在宿主中提高的表达，最强的免疫原性和提高的共价结合性质。表3:NP氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>d、賴餅本发明利用了衍生自植物病毒的衣壳蛋白来构建衣壳融合肽。使用来自植物病毒的衣壳蛋白的一个潜在优势是降低了当该融合肽给与到人或动物时产生副反应的可能性，同时维持了用来提呈流感表位的病毒颗粒的有利形式。在另外的实施方案中，该衣壳蛋白将衍生自从对至少一种植物宿主特异的分类群的任何一种的成员中选择的植物病毒。病毒分类法认可壳体化颗粒实体的下述分类群:群I病毒，即dsDNA病毒；群n病毒，即ssDNA病毒；群m病毒，即dsRNA病毒；群IV病毒，即无DNA阶段的正链ssRNA病毒；群V病毒，即负链ssRNA病毒；群VI病毒，即RNAretroid病毒，它们是ssRNA反转录病毒；群VII病毒，g卩DNAretroid病毒，它们是dsDNA反转录病毒；Deltavimses;类病毒；和卫星噬菌体和卫星病毒，除卫星核酸和蛋白感染素外。这些分类群的成员对本领域的一个普通技术人员而言是被熟知的并在H.V.VanRegenmorteletal.(eds.),VimsTaxonomy:SeventhReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses(2000)(AcademicPress/Elsevier，BurlingtonMass.,USA);英国来彻斯特大学微生物学&免疫学系的病毒分类学网页http:〃w西micro.msb.le.ac.u固35/Vimsgroups.html;和美国健康与人类服务部国家健康研究院国立医学图书馆国家生物技术信息中心(NCBI)(美国，华盛顿特区)在线分类学浏览器"病毒"和"类病毒"部分http:〃www.ncbi.nhn.nih.gov/Taxonomy/tax.html进《亍了纟宗述。所述衣壳的氨基酸序列能从感染植物的任何这些分类群的任何成员的衣壳中选择。这些分类群成员衣壳的氨基酸序列能从下述来源获得，包括但不限于，例如在网页http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi上NCBI提供的在线Pubmed搜索工具"Nucleotide"(Genbank)、"Protein"禾卩"Structure"部分。病毒能被分类到那些具有螺旋对称或二十面体对称的群中。通常，能被识别的衣壳形态包括二十面体(包括正的、对角的、半对角的，和成对的或"一胎双生的"二十面体)、多面体(包括球状的、卵形的和柠檬形的)、杆状的(包括杆-或子弹-形的，和纺锤形或雪茄烟形的)和螺旋状的(包括棒状、圆筒状和丝状的)；任何具尾的或含有诸如突起或结的表面突出部分的形态。在本发明一个实施方案中，所述衣壳的氨基酸序列从以具有任何形态分类的病毒的衣壳中选择。在一个实施方案中，所述衣壳衍生自杆状植物病毒。本发明另外的实施方案包括的衣壳是衍生自从烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯病毒X(PVX)中选择的组的杆状病毒衣壳。TMV包含被独特外壳蛋白(17.5kDa)衣壳化的单链正义基因组咖A(6.5kb)，该外壳蛋白导致了杆状颗粒(300nm)。烟草花叶病毒广泛的宿主范围允许使用多种植物品种作为生产和传递系统。先前已经显示，插入到这个载体的外源基因能生产高水平的蛋白。Yusibovetal.(1995)"High-a伍nityRNA-bindingdomainsofalfalfamosaicviruscoatproteinarenotrequiredforcoatprotein-mediatedresistance,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.92:8980-8984。马铃薯病毒X是丝状的、非包膜的；具有清楚模态的长515nm宽13nm通常弯曲的病毒。该衣壳结构形成了具有3.4nm螺距的基本螺旋。VarmaA,GibbsAJ,WoodsRD,FinchJT(1968)"Someobservationsonthestructureofthefilamentousparticlesofseveralplantviruses,"JGenVirol.2(1):107-14。在其它实施方式中，该衣壳蛋白衍生自不是TMV的植物病毒。在一个实施方式中，所述衣壳具有二十面体形态。通常的，二十面体病毒的病毒衣壳包含多个以二十面体(立方形的)对称排列的蛋白亚基。例如，用三个亚基形成衣壳的每一个三角形面，产生60个亚基形成完整的衣壳，天然二十面体衣壳能被建立。例如，噬菌体0X174就是这个小的病毒结构的代表。许多二十面体病毒衣壳含有超过60个亚基。二十面体病毒的许多衣壳含有逆平行的、八链的P-折叠桶折叠的基序。该基序具有在一端带有四个P链(命名为BIDG)另一端带有四个3链(命名为CHEF)的楔形区。该基序也具有两个保守a螺旋(命名为A和B)，其中一个处于PC和eD之间，另一个位于PE和PF之间。在一个实施方式中，所述二十面体植物病毒种类将是感染植物的病毒种类，它是或是任何本扬病毒科(伤z^awW^^)、呼肠孤病毒科(i^ov/".(ifle)、弹状病毒禾斗(i/2aMov/W(iag)、大麦黄矮病毒禾斗(丄wteov/厂油e)、7Va腳zW(^、双组分双链認A球状真菌病毒科(尸ar份/v/r油e)、欧防风黄点病毒禾斗(&gw/v/"'t/ae)、53wov/nVibe、(9ww7/"vz>w5、烟草坏死病毒卫星(TobaccoNecrosisVirusSatellite)、花祸P菜花口十病毒禾斗(C"M/z'附oWr/(iag)、耳关体病毒禾斗(G^腿'"/Wn'c/ae)、豇豆花叶病毒禾斗(ComcwWt/ae)、南方菜豆花口十病毒禾斗(5b6e附6)Wn^)、番茄丛矮病毒禾斗(7b附&Msv/n'cfog)，或雀麦花叶病毒禾斗(SrawoWrz.(iae)分类群的一员。在一个实施方式中，所述二十面体植物病毒种类是感染植物的病毒种类，它是或是任何大麦黄矮病毒科、A^zoWrW^、双组分双链RNA球状真菌病毒科、欧防风黄点病毒科、rjwoWnVfoe、<9'av/n、烟草坏死病毒卫星、花椰菜花叶病毒科、联体病毒科、豇豆花叶病毒科、南方菜豆花叶病毒科、番茄丛矮病毒科，或雀麦花叶病毒科分类群的一员。在特定的实施方式中，所述二十面体植物病毒种类是感染植物的病毒种类，它是或是任何花椰菜花叶病毒科、联体病毒科、豇豆花叶病毒科、南方菜豆花叶病毒科、番茄丛矮病毒科，或雀麦花叶病毒科的一员。在其它实施方式中，所述二十面体植物病毒种类将是感染植物的病毒种类，它是或是任何豇豆花叶病毒科、南方菜豆花叶病毒科、番茄丛矮病毒科，或雀麦花叶病毒科的一员。在另外的实施方式中，所述衣壳衍生自等径易变病毒属(//"rvh")或苜蓿花叶病毒属"//flmow>^)。在另外的实施方式中，所述衣壳衍生自烟草线条病毒、苜蓿花叶病毒(AMV)或雀麦花叶病毒(BMV)。在其它实施方式中，所述二十面体植物病毒种类能是感染植物的病毒种类，它是豇豆花叶病毒科或雀麦花叶病毒科家族的一员。本发明的实施方式包括的病毒衣壳衍生自豇豆花叶病毒(CPMV)或豇豆褪绿斑点病毒(CCMV)。本发明的实施方式包括的本发明利用的衣壳蛋白衍生自CCMV衣壳蛋白。更明确地，所述衣壳蛋白衍生自由SEQIDNo:11(表4)所示的CCMV衣壳氨基酸序列。在其它实施方式中，本发明利用的衣壳蛋白能是CCMV大衣壳蛋白的整条氨基酸序列，或是它的包含从SEQIDNo:11选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或更多个氨基酸残基的亚型。选择的该衣壳蛋白能具有同CCMV大衣壳蛋白氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:11选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或更多个氨基酸残基的亚型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它实施方式中，所述衣壳蛋白能被改变来提高所述衣壳融合肽的特征，诸如但不限于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性、提高的共价结合性质或改善的折叠或再组装。在其它实施方式中，本发明利用的衣壳蛋白衍生自CPMV小衣壳蛋白(SCPMVCapsid)。更具体地，该衣壳蛋白衍生自由SEQIDNo:12(表4)所示的SCPMV衣壳氨基酸序列。在其它实施方式中，本发明利用的衣壳蛋白能是CPMV小衣壳蛋白的整条氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:12选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、213或更多个氨基酸残基的亚型。选择的该衣壳蛋白能具有同CPMV小衣壳蛋白氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:12选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、213或更多个氨基酸残基的亚型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它实施方式中，所述衣壳蛋白能被改变来提高所述衣壳融合肽的特征，诸如但不限于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性、提高的共价结合性质或改善的折叠或再组装。在其它实施方式中，本发明利用的衣壳蛋白衍生自CPMV大衣壳蛋白(LCPMVCapsid)。更具体地，该衣壳蛋白衍生自SEQIDNo:13(表4)表示的LCPMV衣壳氨基酸序列。在其它实施方式中，本发明利用的衣壳蛋白能是CPMV大衣壳蛋白的整条氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:13选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、225、240、250、265、275、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370、374或更多个氨基酸残基的亚型。选择的该衣壳蛋白能具有同CPMV大衣壳蛋白氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:13选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、卯、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、225、240、250、265、275、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370、374或更多个氨基酸残基的亚型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它实施方式中，所述衣壳蛋白能被改变来提高所述衣壳融合肽的特征，诸如但不限于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性、提高的共价结合性质或改善的折叠或再组装。表4植物病毒衣壳氨基酸和核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>MEQNLFALSLDDTSSVRGSLLDTKFAQTRVLLSKAMAGGDVLLDEYLYDWNGQDFRATVAFLRTHVITGKIKVTATTNISDNSGCCLML細SGVRGKYSTDVYTICSQDSMTWNPGCKKNFSFTFNPNPCGDSWSAEMISRSRVRMTVICVSGWTLSPTTDVIAKLDWS翻EKCEPTIYHLADCQ丽LPLNRWMGKLTFPQGVTSEVRRMPLSIGGGAGATQAFLA丽PNSWISMWRYFRGELHFEVTKMSSPYIKATVTFLIAFGNLSDAFGFYESFPHRIVQFAEVEEKCTLVFSQQEFVTAWSTQVNPRTTLEADGCPYLYAimDSTTGTISGDFNLGVKLVGKDFCGIGSNPGIDGSRl丄GAIAQ—LCPMVSEQCapsidIDNo:13"賴激激产f编码衍生自流感病毒的肽的核酸被融合到编码植物病毒衣壳蛋白的核酸上来产生能以重组融合肽被表达的构建物。本发明使用的重组衣壳肽能在利用本领域广泛已知技术的生物表达系统中生产。例如，编码连接到至少一条抗原流感肽的植物病毒衣壳蛋白的融合肽的核酸构建物能被引入宿主细胞并被进行表达。为了在宿主细胞中进行表达，所述核酸序列能包括下述元件诸如转录增强序列、翻译增强序列、启动子、包括内部核糖体进入位点的核糖体进入位点、激活子、翻译起始和终止信号、转录终止子、顺反子调节子、多顺反子调节子的转录和翻译调控元件，促进表达的重组衣壳蛋白融合肽鉴定、分离、纯化或隔离的诸如核苷酸序列"tags"和"tag"肽编码序列的标记序列，包括His-tag、Flag-tag、T7-tag、S-tag、HSV-tag、B-tag、Strep-tag、聚精氨酸、聚半胱氨酸、聚苯丙氨酸、聚天冬氨酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n、硫氧还蛋白、P-半乳糖苷、氯霉素乙酰转移酶、环糊精葡糖转移酶、CTP:CMP-3-脱氧-D-甘露-辛酮糖胞苷酰转移酶(CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonatecytidyltransferase)、trpE或trpLE、卵白素、抗生蛋白链菌素、T7基因10、T4gp55、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G、GST、DHFR、CBP、MBP、半乳糖结合域、调钙蛋白结合域、KSI、c-myc、ompT、ompA、pe旧、NusA、泛素、六聚组氨酸、谷胱甘肽-S-转移酶、GFP、YFP、或这样的荧光蛋白的同系物、抗体分子、hemosylinA、或已知的对纯化有用的已知结合配偶体的抗原或配基。编码流感肽的核酸能被插入编码病毒衣壳蛋白的核酸的预定位点。在一个实施方式中，所述流感肽被插入衣壳编码序列以使在病毒或病毒样颗粒形成时被表达为环。流感肽可能会在植物衣壳中超过一个的插入位点被插入。这样，当所述衣壳融合肽重新组装来形成病毒或病毒样颗粒时，流感肽可能会插入衣壳的超过一个的表面环基序。可选择地，当所述衣壳融合肽重新组装来形成病毒或病毒样颗粒时，流感肽也可能会在给定环基序内的多个位点插入。而且，流感肽可能会在面对外部的环内和/或在面对内部的环内，即在所述衣壳分别背离或朝向衣壳中心的环内被插入。在衣壳表面环内的任何氨基酸或肽键均能作为所述流感肽的插入位点。典型地，所述插入位点能在大约所述环的中心，即在大约位于距离所述折叠衣壳肽三级结构的中心最远的位置被选择。当所述衣壳融合肽进行组装来形成病毒或病毒样颗粒时，所述流感肽编码序列可能会在所述流感衣壳编码序列的同所述被选择的环的这个大约中心相对应的位置内被插入。这包括阅读框的保留，该阅读框负责在所述肽插入位点下游被合成的衣壳肽序列的部分。在另一个实施方案中，所述流感肽能在所述衣壳的氨末端被插入。所述流感肽能通过一个或多个接头序列被连接到所述衣壳。在另一个实施方案中，所述流感肽能在所述衣壳的羧末端被插入。所述流感肽也能通过一个或多个能被化学或酶法水解裂解的接头被连接到羧末端。在一个实施方案中，所述流感肽序列在氨末端和羧末端，或在一个末端和在至少一个诸如在所述衣壳的三维构象内的表面被表达的位置的内部位置被连接。在一个实施方案中，当所述衣壳融合肽被组装来形成病毒或病毒样颗粒时，至少一种流感抗原肽在至少一个内部环内或在至少一个外部表面环内被表达。不止一个所述病毒衣壳的环能被修饰。当被组装为病毒或病毒样颗粒时，本发明实施方案包括的流感抗原肽在至少两个表面环上被暴露。在另一个实施方案中，至少两个流感抗原肽被插入到衣壳蛋白并在病毒衣壳、笼、病毒或病毒样颗粒的至少两个表面环上被暴露。在另一个实施方案中，至少三个流感抗原肽被插入到所述衣壳蛋白并在病毒或病毒样颗粒的至少三个表面环上被暴露。在表面环内的流感肽能具有相同的氨基酸序列。在个别的实施方案中，在所述表面环内的流感肽的氨基酸序列能有差别。编码所述病毒衣壳蛋白的核酸序列能被修改来改变病毒或病毒样颗粒的形成(参见例如Bmmfleld，etal.(2004)J.Gen.Virol.85:1049—1053)。例如，三类一般的修改被最典型地产生来修改病毒或病毒样颗粒的组装。这些修改被设计来改变被组装的蛋白笼内的毗连亚基间的内部、外部或交界。为了完成这个目标，诱变引物能被用于(i)通过用酸性谷氨酸替换N末端中的碱性氨基酸残基(例如K、R)来改变病毒核酸结合区域的内部表面电荷(Douglasetal.，2002b);(ii)从N末端删除内部氨基酸残基(例如，在CCMV中，通常删除残基4-37);(iii)插入编码11位氨基酸肽细胞寻耙序列的cDNA(Grafetal.,1987)到表面暴露环；和(iv)通过改变金属结合位点(例如，在CCMV中，残基81/148突变)修改病毒亚基间的相互作用。在一个实施方案中，所述流感抗原肽能被插入到来源于豇豆褪绿斑点病毒(CCMV)的衣壳中。本发明的实施方案包括的流感肽能在SEQIDNo:11中的CCMV衣壳蛋白的第129位氨基酸被插入。在另一个实施方案中，所述流感肽序列能在SEQIDNO:11中的CCMV衣壳蛋白的第60、61、62或63位氨基酸被插入。在另一个实施方案中，所述流感肽能在SEQIDNo:11中的CCMV衣壳蛋白的第129位和第60-63位氨基酸被插入。在一个实施方案中，从包含SEQIDNos:3、22、23和24，或它的衍生物或同系物的组中选择的M2肽被插入到所述CCMV衣壳蛋白。在一个实施方案中，所述流感抗原肽能被插入到来源于豇豆花叶病毒(CPMV)的小衣壳中。本发明的实施方案包括的流感肽能在SEQIDNo:12中的CPMV小衣壳蛋白(SCPMVCapsid)的第22和23位氨基酸间被插入。在一个实施方案中，从包含SEQIDNOs:3、22、23和24，或它的衍生物或同系物的组中选择的M2肽能被插入到CPMV小衣壳蛋白中。在一个实施方案中，所述流感抗原肽能被插入到来源于豇豆花叶病毒(CPMV)的大衣壳中。本发明的实施方案包括的流感肽能被插入到SEQIDNo:13中的CPMV大衣壳蛋白。在一个实施方案中，从包含SEQIDNOs:3、22、23和24，或它的衍生物或同系物的组中选择的M2肽能被插入到CPMV大衣壳蛋白中。在一个实施方案中，毗连目的流感抗原肽的或连接到病毒衣壳蛋白的标记序列也可被包括进来。在一个实施方案中，这个标记序列考虑到了所述重组衣壳融合肽的纯化。该标记序列可以是诸如六聚组氨酸的亲和标记。在另外一个实施方案中，该亲和标记能是谷胱甘肽-s-转移酶分子。该标记也能是诸如YFP或GFP或这样的荧光蛋白的同系物的荧光分子。该标记也能是部分抗体分子，或有利于纯化的已知抗原或已知结合配偶体的配基。本发明仔细考虑了使用合成或任何类型生物表达系统来生产包含所述流感肽的重组衣壳肽。当前衣壳蛋白表达的方法包括昆虫表达系统、诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌的细菌表达系统、植物和植物细胞培养物表达系统、诸如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母的酵母表达系统和哺乳动物表达系统。在一个实施方案中，编码衣壳融合肽的核酸构建物在从包括整株植物或植物细胞培养物的植物细胞或荧光假单胞菌细胞中选择的宿主细胞中表达。在一个实施方案中，编码衣壳融合肽的核酸构建物在整株植物中表达。在一个实施方案中，编码衣壳融合肽的核酸构建物在植物细胞培养物中表达。在另一个实施方案中，编码衣壳融合肽的核酸构建物在荧光假单胞菌中表达。在上述宿主细胞中表达衣壳融合肽的技术在例如美国专利U.S.Pat.5,874,087,美国专利U.S.Pat.5,958,422，美国专利U.S.Pat.6,110,466，美国专利申请U.S.Application11/001,626和美国专利申请U.S.Application11/069,601的文献中以及下面的实施例中进行了描述。丄嫁毒或谅毒存微腳姿本发明的衣壳融合肽能从宿主细胞纯化而来并在体外进行组装来形成病毒样颗粒或笼结构，其中的病毒样颗粒不含有宿主细胞质膜。一旦所述重组衣壳融合肽在宿主细胞中表达，它就可以通过在本领域中所熟知的标准技术被分离和纯化到实际纯度。所述分离和纯化技术能依赖于被利用来生产所述衣壳融合肽的宿主细胞。这样的技术能包括但不限于，PEG浓縮、硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、镍亲和层析、羟基磷灰石层析、反相层析、凝集素层析、制备电泳、去污剂增溶、用如柱层析的物质进行的选择性沉淀、免疫纯化方法、分子排阻层析、免疫沉淀方法、离心、超离心、密度梯度离心(例如，蔗糖梯度或氯化铯(CsCl)梯度)、通过分子排阻膜的超滤，和本领域已知的任何其它蛋白分离方法。例如，具有确定分子吸附性质的衣壳蛋白融合肽能被可逆地结合到配基。利用适当的配基，衣壳蛋白融合肽能被选择性吸附到纯化柱，然后以相对纯的形式从该柱子上被洗脱下来。通过酶活性，该衣壳蛋白然后被移除。另外，所述衣壳蛋白融合肽能使用免疫亲和柱或Ni-NTA柱被纯化。综合的技术在下述文献中被进一步描述，例如，R.Scopes,PeptidePurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag:N.Y.(1982);Deutscher,GuidetoPeptidePurification,AcademicPress(1990);U.S.Pat.No.4，511，503;S.Roe,PeptidePurificationTechniques:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),OxfordPress(2001);D.Bollag,etal"PeptideMethods,Wiley-Lisa,Inc.(1996);AKPatraetal,，PeptideExprPurif，18(2):p/182-92(2000);andR.Mukhija,etal.，Gene165(2):p.303-6(1995)。也参见例如，Aipibel，etal.(1987andperiodicsupplements);Deutscher(1990)"GuidetoPeptidePurification,"MethodsinEnzymologyvol.182，andothervolumesinthis30series;Coligan,etal.(19%andperiodicSupplements)CurrentProtocolsinPeptideScienceWiley/Greene,NY;和肽纯化产品使用的厂商文南犬，例如，Pharmacia,Piscataway,NJ.或Bio-Rad,Richmond,Calif。重组技术的组合允许融合到适当的片段，例如，融合到FLAG序列或能被经由可被蛋白酶移除的序列融合的同等物。也参见例如，Hochuli(1989)ChemischeIndustrie12:69-70;Hochuli(1990)"PurificationofRecombinantPeptideswithMetalChelateAbsorbent"inSetlow(ed.)GeneticEngineering,PrincipleandMethods12:87-98,PlenumPress,NY;andCrowe,etal.(1992)QIAexpress:TheHighLevelExpression&PeptidePurificationSystemQIAGEN,Inc.,Chatsworth,Calif。在其它实施方案中，在宿主细胞尤其是细菌宿主细胞中表达的衣壳融合肽可能会形成不可溶的聚集物("包涵体")。几种方法适用于纯化从包涵体而来的肽。例如，通过裂解宿主细胞，例如通过在含50mMTRIS/HCLpH7.5、50mMNaCl、5mMMgC12、1mMDTT、0.1mMATP和1mMPMSF的缓冲液中孵育，包涵体纯化典型地涉及到包涵体的抽提、分离和/或纯化。通过使用2-3次法兰西压榨器细胞压榨，该细胞悬液被典型地裂解。通过在冰上使用Polytron(Brink腿Instruments)或超声波破碎，该细胞悬液也能被均质化。另外的裂解细菌的方法对本领域的那些熟练技术人员是明显的(参见例如，前面的Sambrooketal.;前面的A画beletal.)。假如必需，包涵体能被溶解，并且典型裂解的细胞悬液能被离心来移除不想要的不溶物。形成包涵体的衣壳融合肽可能会通过使用合适缓冲液的稀释或透析被复性。合适的溶剂包括但不限于尿素(从大约4M到大约8M)、甲酰胺(至少大约80%，体积比)，和盐酸胍(从大约4M到大约8M)。尽管盐酸胍和类似的试剂是变性剂，但这种变性是可逆的并且复性可能会在移除(例如通过透析)或稀释该变性剂后发生。其它合适的缓冲液对本领域的熟练技术人员是己知的。可选择地，从宿主周质中纯化重组衣壳融合肽、病毒样颗粒或笼结构是可能的。在宿主细胞裂解后，当重组肽被输入到宿主细胞周质时，细菌的周质部分还能通过除了本领域熟练技术人员已知的其它方法外的冷渗透休克进行分离。例如，为了从该周质中分离重组肽，细菌细胞能被离心来形成沉淀。该沉淀能被重悬在含20%蔗糖的缓冲液中。为了裂解这些细胞，这些细菌能被离心，产生的沉淀能被重悬在冰冷的含5mMMgS04的缓冲液中并在冰浴槽中放置大约IO分钟。该细胞悬液能被离心，产生的上清被轻轻倒出并被保存。通过本领域技术熟练人员所熟知的标准分离技术，存于上清中的重组肽能从宿主肽中分禺出。最初的盐分级分离能从目的重组衣壳蛋白融合肽中分离出许多不想要的宿主细胞肽(或衍生自细胞培养基的肽)。一个这样的例子能是硫酸铵。硫酸铵通过有效降低肽混合物中的水的量来沉淀肽。肽然后基于它们的溶解度进行沉淀。越疏水的肽越可能在更低的硫酸铵浓度下沉淀出来。典型的流程包括加入饱和硫酸铵到肽溶液以便使产生的硫酸铵浓度介于20-30%。这个浓度将使绝大多数疏水肽沉淀。产生的沉淀被丢弃(除非目的肽是疏水性的)，然后加入硫酸铵到上清中使浓度为已知的沉淀目的衣壳蛋白融合肽的浓度。产生的沉淀然后在缓冲液中溶解，假如必需，通过透析或透滤法移除多余的盐分。其它的诸如冷乙醇沉淀等依赖肽的溶解度的方法对本领域的技术人员是熟知的并能被用于分级复杂的衣壳蛋白融合肽混合物。通过使用不同孔径大小的膜(例如，Amicon或Millipore膜)超滤，重组衣壳蛋白融合肽的分子量能用于将它从具有更大或更小分子量的肽中分离出。作为第一步，所述衣壳蛋白融合肽混合物能通过具有比目的衣壳蛋白融合肽的分子量低的分子量截停的孔尺寸的膜进行超滤。超滤的保留物然后通过具有比目的衣壳蛋白融合肽的分子量高的分子量截停的孔尺寸的膜进行超滤。重组衣壳蛋白融合肽将通过膜进入滤液中。滤液然后能按下面描述的方法进行层析。重组衣壳融合肽也能基于它的大小、表面净电荷、疏水性和对配基的亲和性从其它肽中分离出来。此外，已建立的抗该衣壳蛋白的抗体能被结合到柱基质并且该衣壳蛋白能被免疫纯化。所有这些方法在本领域中均是广为人知的。对于一个技术人员而言，层析技术能在任何规模和使用来源于许多不同厂商(例如PharmaciaBiotech)的设备时实施是明显的。病毒样颗粒组装需要正确折叠的衣壳蛋白。然而，另外的VLP形成和稳定所需的显著因子可能是存在的，这些因子尤其包括pH值、离子强度、二硫键、二价阳离子键。参见例如，Bradyetal,(1977)"Dissociationofpolyomavirusbythechelationofcalciumionsfoundassociatedwithpurifiedvirions,"J.Virol.23(3):717-724;Gajardoetal,(1997)"TwoprolineresiduesareessentialinthecalciumbindingactivityofrotavirusVP7outercapsidprotein,"J.Virol"71:2211-2216;Walteretal,(1975)"Intermoleculardisulfidebonds:animportantstructuralfeatureofthepolyomavimscapsid,"ColdSpringHar.Symp.Quant.Biol"39:255-257(1975);Christansenetal,(1977)"Characterizationofcomponentsreleasedbyalkalidisruptionofsimianvirus40，"JVirol"21:1079-1084;Salunkeetal,(1986)"Self-assemblyofpurifiedpolyomaviruscapsidproteinVP1,"Cell46:895-904;Salunkeetal,(1989)"PolymorphismintheassemblyofpolyomaviruscapsidproteinVP,"Biophys.J.,56:887-900;Garceaetal,(1983)"Hostrangetransforminggeneofpolyomavirusplaysaroleinvirusassembly,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:3613-3617;Xietal,(1991)"Baculovirusexpressionofthehumanpapillomavirustype16capsidproteins:detectionofL1-L2proteincomplexes,"J.Gen.Virol.,72:2981-2988。可能会用于重新组装的技术在本领域中是广为人知的，并且包括但不限于，在实施例6中公开的技术。此外，本发明的衣壳融合肽能在宿主细胞中表达并在体内组装为病毒、病毒样颗粒或笼结构，其中的病毒或病毒样颗粒不含有宿主细胞质膜。在一个实施方案中，病毒、病毒样颗粒(VLP)或笼结构在衣壳蛋白表达时或表达后形成。在一个实施方案中，病毒、病毒样颗粒或笼在病毒或病毒样颗粒的表面暴露该流感肽。在一个实施方案中，病毒、病毒样颗粒或笼结构以重组衣壳融合肽的多体组装形式组装，该多体包括从三个到大约200个衣壳融合肽。在一个实施方案中，病毒、病毒样颗粒或笼结构包括至少30个、至少50个、至少60个、至少90个或至少120个衣壳融合肽。在另一个实施方案中，每一个病毒、病毒样颗粒或笼结构包括至少150个、至少160个、至少170个、至少180个衣壳融合肽。在一个实施方案中，病毒或病毒样颗粒以二十面体结构被组装。在另一个实施方案中，病毒样颗粒或病毒以同衣壳序列衍生的天然病毒相同的几何形状进行组装。然而，在个别的实施方案中，病毒或病毒样颗粒不具有同天然病毒相同的几何形状。例如，在其它实施方案中，该结构在由多个衣壳融合肽形成的但不形成天然型病毒颗粒的颗粒中组装。例如，具有少至3个病毒衣壳的笼结构能被形成。在个别实施方案中，具有大约6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57或60个衣壳的笼结构能被形成。在体内组装的植物病毒或植物病毒颗粒的纯化先前已经被描述。例如，参见Dijkstra，J.andDeJager,C.P"1998;Matthews,R.E.R,1991，PlantVirology,ThirdEdition,AcademicPress,Inc.,HarcourtBraceJovanovich,Publishers,和下面的实施例。大多数病毒能通过下述的两个或多个操作的组合被分离高速沉降、密度梯度离心、使用聚乙二醇的沉淀、盐沉淀、凝胶过滤、层析和透析。一旦含有病毒或病毒样颗粒的细胞破碎并且细胞内含物被释放和混合，病毒或病毒样颗粒发现它们自己处于不正常的环境中。因此，使用设计来保护病毒或病毒样颗粒在分离的各个阶段保持完整和非聚集状态的人造培养基经常是必要的。有利于纯化病毒或病毒样颗粒制备物稳定性的条件可能是同在粗提取物或部分提纯制备物所需的条件不同的。此外，不同因素可能会在影响病毒稳定性的程度上强烈地相互作用。在研制合适的培养基过程中被认为是主要因素的因素包括pH值和缓冲体系、金属离子和离子强度、还原剂和抗紫锥菊多酚的保护物质、消除植物蛋白和核糖体的添加剂、酶和去污剂。许多病毒在一个相当窄的pH范围内稳定，并且所述抽提物必须保持在这个范围内。因此，缓冲液的选择可能是重要的。磷酸盐缓冲液经常被使用，但这些缓冲液可能对某些病毒或病毒样颗粒具有有害作用。为了保持结构的完整性，某些病毒或病毒样颗粒需要二价金属离子的存在。离子强度也可能是重要的。还原剂经常被加入到抽提介质中。这些物质协助容易通过氧化丢失感染性的病毒或病毒样颗粒的保存。它们也可能会降低宿主组分对病毒的吸附。酚类物质可能会在病毒或病毒样颗粒的分离和保存中导致严重的困难。几种方法已经或多或少成功地用于最小化酚在分离过程中对植物病毒或病毒样颗粒的影响。pH7.4的缓冲液中的0.01M的EDTA钠盐导致了大多数核糖体的破裂，防止了它们与病毒颗粒的共沉淀。这种物质能用于稳定性不需要二价金属离子的病毒。核糖核酸酶、核糖体、19S蛋白和来源于碎片化叶绿体的绿色微粒物质能在某种镁浓度下被皂粘土容易地吸附。木炭可能会用于吸附和消除宿主物质，尤其是色素。为了各种目的，酶类能被加入最初的抽提物中。例如，果胶酶和纤维素酶协助病毒或病毒样颗粒的释放，否则这些病毒或病毒样颗粒将保留在纤维部分中。这些酶也消化某些物质，否则这些物质将同病毒或病毒样颗粒共沉淀。TritonX-100或Tween80有时能用在最初抽提介质中来协助病毒或病毒样颗粒从不溶的细胞成分中释放。去污剂也可能协助植物抽提物的最初净化。非离子去污剂裂解可能会污染病毒或病毒样颗粒的细胞膜。许多种方法能用来破碎或均质化含有病毒或病毒样颗粒的植物组织。这些方法包括(0研杵和研钵，(ii)各种分批型食品搅拌器和榨汁机，和(ii0轧制机、胶体磨和能处理数千克组织的商业绞肉机。假如使用了抽提介质，确保破碎细胞同介质直接接触经常是必需的。均质化的组织通常通过粗布过滤来分离含有病毒的植物体液和破碎的植物组织。在粗提物中，病毒或病毒样颗粒同各种细胞成分混合在一起，这些细胞成分在同病毒或病毒样颗粒相同宽的尺寸范围内并可能在某些方面具有相似的性质。这些颗粒包括核糖体、来源于叶绿体并具有聚集倾向的19S蛋白、植物铁蛋白、膜碎片和破裂叶绿体的碎片。也存在的是未破碎的细胞、细胞的所有更小的可溶蛋白和低分子量溶质。病毒分离的第一步通常被设计来尽可能多地去除大分子宿主物质而留下病毒或病毒样颗粒在溶液中。抽提介质可能被设计来沉淀核糖体和其他的高分子量宿主物质或来分解它们。抽提物可能被进行如加热、例如氯仿或n-丁醇-氯仿的有机溶剂抽提等处理。处理过的抽提物然后在相当低的速度下进行离心。该处理沉淀了细胞碎片和凝固的宿主物质。足够时间的高速离心将沉淀病毒或病毒样颗粒。这是一个非常有用的歩骤，因为它服务了浓縮病毒颗粒和移除低分子量物质这两个目的。某些植物病毒优先在单相聚乙二醇(PEG)系统中沉淀，尽管某些宿主DNA也可能会被沉淀。PEG沉淀是用在病毒或病毒样颗粒分离中的最普通方法之一。沉淀的确切条件依赖于pH值、离子强度和大分子的浓度。它在分离任何特定病毒中的应用是经验性的。PEG沉淀的主要优势是不需要昂贵的超滤，尽管差异离心经常用作纯化方法的第二步。许多病毒可能会形成非常难于重悬的沉淀。密度梯度离心提供了浓縮这样的病毒或病毒样颗粒而不形成沉淀的可能并被用于许多病毒的分离方法。离心管被部分地充入具有从离心管底部到顶部的渐减密度的溶液。对于植物病毒，蔗糖被普遍用来形成该梯度，并且病毒溶液被铺在密度梯度的顶部。伴随用铯盐形成的梯度，所述病毒或病毒样颗粒可能在沉降的开始被分布到整个溶液中或它们可能被铺在密度梯度的顶部。密度梯度可能会以三种途径被使用(i)等密梯度离心，(ii)速率区带沉淀，和(iii)平衡区带状沉淀。离心后，由于病毒带的光散射性质，它们可能会被直视到。盐沉淀也被普遍使用。处于高达大约三分之一饱和度浓度的硫酸铵被最普遍地使用，尽管许多其他盐将沉淀病毒或病毒样颗粒。在放置几个小时或几天后，病毒或病毒样颗粒在低速离心下被离心下来并重溶在小体积的合适介质中。许多蛋白在或靠近它们的等电点处具有低溶解度。等电点沉淀能用于在有关条件下保持稳定的病毒或病毒样颗粒。通过离心或过滤收集沉淀并重溶在合适介质中。通过纤维素薄膜的透析能用来从起始抽提物中移除低分子量物质和改变介质。更通常地，它被用来在盐沉淀或结晶化后，或在盐或蔗糖溶液密度梯度离心后去除盐分。通过一步纯化和浓縮取得的病毒或病毒样颗粒制备物将仍然包含某些小分子量宿主物质。更多的这些物质能通过进一步的纯化步骤被去除。该方法依赖于病毒或病毒样颗粒的稳定性和制备的规模。有时候，高度纯化的制备物能通过反复应用相同的方法获得。例如，制备可能会经历重复的PEG沉淀，或可能会给与多个循环的高速和低速沉淀。后面的方法导致宿主大分子的优先去除，因为当来源于高速离心的沉淀被重悬时这些大分子保持不溶。通常来讲，在一个分离过程中，应用至少两个依赖于病毒或病毒样颗粒的不同性质的方法是有用的。在去除宿主成分时，这可能比重复应用同一种方法更有效。进一步纯化的其中一种最有用的方法，特别是对更不稳定的病毒或病毒样颗粒而言，是密度梯度离心。蔗糖是最普遍使用的制备梯度的物质。蔗糖密度梯度离心是经常选择的进一歩纯化的方法。诸如氯化铯的盐的强溶液也是充分稳定的病毒的有效梯度物质。在两个不同梯度中的连续的分级有时候可能会给出有用的结果。琼脂凝胶过滤或葡聚糖凝胶过滤可能会为某些病毒或病毒样颗粒的进一步纯化提供有用的步骤，这些病毒或病毒粒对高速离心中涉及到的沉淀形成不稳定。单克隆抗病毒抗体能被结合到诸如琼脂糖的支持基质上来形成能特异性结合通过该柱的溶液中的病毒的柱子。通过降低pH值病毒能被洗脱。层析方法能用来为部分纯化的制备物提供有效的纯化步骤。例如，在磷酸盐缓冲液中的磷酸钙凝胶柱、纤维素柱或快速蛋白液相层析能用来纯化各种病毒。在病毒分离的各个阶段，浓縮病毒并去除盐分或蔗糖是必需的。高速离心被普遍用来浓縮病毒和降低低分子量物质的数量。透析用于去除或调换盐类。II、抗原流感全蛋白或蛋白片段本发明利用同上面公开的包含流感肽的衣壳融合肽组合的至少一种衍生自包括人和/或禽流感病毒的流感病毒的分离抗原蛋白或蛋白片段、它的衍生物或同系物。在一个实施方案中，分离抗原蛋白或蛋白片段、它的衍生物或同系物衍生自新出现的流感病毒株。本发明利用的流感病毒蛋白或蛋白片段能是衍生自已鉴定的流感病毒株的M1、M2、HA、NA、NP、PB1、PB2、PA或NP2蛋白或它的衍生物或同系物。大量的流感病毒株和对应的蛋白序列已经被鉴定并且公众能通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的流感病毒资源站点获得这些序列，该站点网址为http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html。在本发明的一个实施方案中，衍生自流感病毒的蛋白或蛋白片段能从包含HA和NA蛋白或蛋白片段的组中选择。本发明另外的实施方案包括的NA蛋白或蛋白片段衍生自从包含亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的组中选择的流感NA病毒的组。在一个实施方案中，所述流感病毒肽是衍生自人或禽流感NA蛋白的蛋白或蛋白片段。在其它实施方案中，所述流感病毒抗原蛋白或蛋白片段衍生自流感HA蛋白。本发明另外的实施方案包括的HA蛋白或蛋白片段衍生自从包含亚型Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14和H15的组中选择的流感HA病毒的组。本发明实施方案包括的HA肽衍生自人和/或禽流感HA蛋白的组。在另外的实施方案中，所述HA肽能衍生自禽流感HA蛋白。在一个实施方案中，该HA蛋白从亚型H5、H7禾BH9中选择。在本发明的一个实施方案中，分离抗原蛋白或蛋白片段从新出现的流感病毒株中选择。世界卫生组织每年两次检査世界流感流行病学数据并周期性地更新新出现的流感病毒株的鉴定。在推导用于本发明的分离抗原蛋白或蛋白片段中有用的遗传信息对本领域的技术人员是可得的。例如，洛斯阿拉莫斯国家实验室维护了含有新出现流感病毒株遗传信息的流感序列数据库，该网址为http:〃www-flu.lanl.gov/。本发明的实施方案也包括的同病毒样颗粒组合的HA蛋白或蛋白片段衍生自SEQIDNO:15(表5)中的A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的568个氨基酸残基的序列，它的被SEQIDNO:16(表5)核苷酸序列编码的衍生物或同系物。在其它实施方案中，本发明利用的流感病毒蛋白能是A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的HA蛋白或蛋白片段的整条氨基酸序列，或它的包含从SEQIDNo:15选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、565、568或更多个氨基酸残基的亚型。选择的流感病毒蛋白能具有同A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的HA蛋白或蛋白片段氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:15选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、565、568或更多个氨基酸残基的亚型，或它的包含从SEQIDNo:15选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或更多个氨基酸残基的亚型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它实施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改变来提高所述蛋白的特征，诸如但不限于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性、提高的共价结合性质。可选择地，同病毒样颗粒组合的HA蛋白或蛋白片段衍生自SEQIDNo:17(表5)。在其它实施方案中，本发明利用的流感病毒蛋白能是SEQIDNo:17中的HA蛋白或蛋白片段的整条氨基酸序列，或它的包含从SEQIDNo:17选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、530、537或更多个氨基酸残基的亚型。选择的流感病毒蛋白能具有同SEQIDNo:17的氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:17选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、530、537或更多个氨基酸残基的亚型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它实施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改变来提高所述蛋白的特征，诸如但不限于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性、提高的共价结合性质。在其它实施方案中，所述HA蛋白片段将是被SEQIDNo:19(表5)核苷酸序列编码的A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的36kDa大小的HA1片段(SEQIDNo:18，表5)。在其它实施方案中，本发明利用的流感病毒蛋白能是SEQIDNo:18中的HA蛋白或蛋白片段的整条氨基酸序列，或它的包含从SEQIDNo:18选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、350、352或更多个氨基酸残基的亚型。选择的流感病毒蛋白能具有同SEQIDNo:18的氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:18选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、350、352或更多个氨基酸残基的亚型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它实施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改变来提高所述蛋白的特征，诸如但不限于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性、提高的共价结合性质。在另一个实施方案中，所述HA蛋白片段将是被SEQIDNo:21(表5)核苷酸序列编码的A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的26kDa大小的HA2片段(SEQIDNo:20，表5)。在其它实施方案中，本发明利用的流感病毒蛋白能是SEQIDNo:20中的HA蛋白或蛋白片段的整条氨基酸序列，或它的包含从SEQIDNo:20选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个氨基酸残基的亚型。选择的流感病毒蛋白能具有同SEQIDNo:20的氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:20选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个氨基酸残基的亚型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它实施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改变来提高所述蛋白的特征，诸如但不限于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性、提高的共价结合性质。在本发明的实施方案中，同病毒样颗粒组合的HA蛋白或蛋白片段衍生自SEQIDNO:25(表5)中的A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)病毒株的565个氨基酸残基的序列，它的被SEQIDNO:26-28(表5)核苷酸序列编码的衍生物或同系物。在其它实施方案中，本发明利用的流感病毒蛋白能是A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)病毒株的HA蛋白或蛋白片段的整条氨基酸序列，或它的包含从SEQIDNo:25选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、565或更多个氨基酸残基的亚型。在其它实施方案中，本发明利用的流感病毒蛋白能是缺少天然N末端信号和C末端跨膜区域和胞质尾的SEQIDNo:29(表5)中的A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)病毒株的HA蛋白片段。选择的流感病毒蛋白能具有同A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)病毒株的HA蛋白或蛋白片段氨基酸序列或它的包含从SEQIDNo:25和SEQIDNo:29选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、565或更多个氨基酸残基的亚型，或它的包含从SEQIDNo:25和SEQIDNo:29选择的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或更多个氨基酸残基的亚型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它实施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改变来提高所述蛋白的特征，诸如但不限于，在宿主中提高的表达、增强的免疫原性、提高的共价结合性质。表5:HA蛋白和核酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>在一个实施方案中，含有流感肽的病毒样颗粒同至少一个衍生自包括人或禽流感病毒的流感病毒的NA蛋白或蛋白片段和至少一个衍生自包括人或禽流感病毒的流感病毒的HA蛋白或蛋白片段进行组合。在另外的实施方案中，含有流感肽的病毒样颗粒同至少一个衍生自流感病毒的NA蛋白或蛋白片段和至少一个衍生自流感病毒的HA蛋白或蛋白片段，和任何包含人和/或禽流感蛋白或蛋白片段的从包含Ml、M2、NP、PB1、PB2、PA禾BNP2以及它的衍生物或同系物的组中选择的流感病毒蛋白或蛋白片段的组合进行组合。fl、條節或筋/f激姓产本发明仔细考虑了使用合成或任何类型生物表达系统来生产流感抗原蛋白或蛋白片段。当前蛋白表达的方法包括昆虫表达系统、诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌的细菌表达系统、植物和植物细胞培养物表达系统、诸如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母的酵母表达系统和哺乳动物表达系统。在一个实施方案中，蛋白或蛋白片段在从包括整株植物或植物细胞培养物的植物细胞或荧光假单胞菌细胞中选择的宿主细胞中表达。本发明另外的实施方案包含的蛋白或蛋白片段在完整植物宿主中表达。在其它实施方案中，该蛋白或蛋白片段在植物细胞培养物中表达。在上述宿主细胞中表达重组蛋白或蛋白片段的技术在本领域中是广为人知的。在一个实施方案中，植物病毒载体被用来在整株植物或植物细胞中表达流感蛋白或蛋白片段。本发明实施方案包含的PVX载体被用来在烟草植物中表达HA蛋白或蛋白片段。在另外的实施方案中，PVX载体被用来在烟草NT1植物细胞中表达HA蛋白或蛋白片段。利用病毒载体的技术在例如美国专利U.S.Pat.4,885,248、U.S.Pat,5,173,410、U.S.Pat.5,500,360、U.S.Pat.5,602,242、U.S.Pat.5,804,439、U.S.Pat.5,627,060、U.S.Pat.5,466,788、U.S.Pat.5,670,353、U.S.Pat.5,633,447和U.SPat.5,846,795以及下面的实施例14和15中进行了描述。在其它实施方案中，转基因植物或植物细胞培养物被用来表达HA蛋白或蛋白片段。用来在转基因植物或植物细胞中表达蛋白或蛋白片段的方法在本领域中是广为人知的。在其它实施方案和实施例18和实施例19中，HA蛋白或蛋白片段在荧光假单胞菌的胞质或周质中表达。能用于在宿主细胞中表达的流感蛋白或蛋白片段的分离和纯化的方法同那些先前在衣壳融合肽分离和纯化的例子中公开的方法相似或相同。III、含有流感肽的VLPs和流感抗原蛋白的组合本发明提供了用作抗流感病毒疫苗的组合物，该组合物包含i)至少一条衍生自流感病毒并融合到衍生自植物病毒的衣壳蛋白且形成重组衣壳融合肽的肽，其中，重组衣壳融合肽能组装来形成病毒或病毒样颗粒，和ii)至少一条衍生自流感病毒的抗原蛋白或蛋白片段。在本发明的一个实施方案中，所述抗原蛋白或蛋白片段不是被化学地附加或连接到病毒样颗粒。在其它实施方案中，所述抗原流感蛋白或蛋白片段被化学连接到病毒或病毒样颗粒上。参见例如，图1和图2。通过使用任何本领域的结合方法，本发明的抗原流感蛋白或蛋白片段和病毒样颗粒能被结合。参见例如GillitzerE,WillitsD,YoungM，DouglasT.(2002)"Chemicalmodificationofaviralcageformultivalentpresentation,"ChemCommun(Camb)20:2390-1;WangQ,KaltgradE,LinT,JohnsonJE，FinnMG(2002)"Naturalsupramolecularbuildingblocks.Wild-typecowpeamosaicvirus,"ChemBiol.9(7》805-l1;WangQ,LinT3TangL，JohnsonJE，FinnMG.(2002)"Icosahedralvimsparticlesasaddressablenanoscalebuildingblocks,"AngewChemIntEdEngl.41(3):459-62;Rajaetal.(2003)"Hybridvirus-polymermaterials.1.SynthesisandpropertiesofPeg-decoratedcowpeamosaicvirus,"Biomacromolecules4:472-476;WangQ,LinT，JohnsonJE,FinnMG.(2002)"Naturalsupramolecularbuildingblocks.Cysteine-addedmutantsofcowpeamosaicvims，"ChemBiol.9(7):813-9。其它用于结合的方法可能会包括，例如，通过使用磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-羧酸盐酯(sSMCC)(sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate)，N-[e-马来酉先亚胺己酰氧基]-磺基琥珀酰亚胺酯(sEMCS)(N-[s-maleimidocaproyloxy]-sulfosuccinimdeester)，N-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)(N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester)，戊二醛，1-乙基-3-(3二甲胺基丙胺)碳二亚胺(EDCI)(l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide)，双-重氣耳关苯胺(BDB)(Bis-diazobenzidine)或N-乙酰高半胱氨酸硫内酯(NAHT)(N-acetylhomocysteinethiolactone)。在载体马来酰亚胺激活方法中，通过使用磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-羧酸盐酯(sSMCC)或N-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)可获得结合。使用sSMCC的方法被广泛使用并是高度特异性的(参见例如Meyeretal.2002,J.ofVirol.76，2150-2158)。sSMCC交联半胱氨酸残基的SH-基到病毒样蛋白上的赖氨酸残基的氨基。在使用sSMCC的结合反应中，通过结合sSMCC试剂到病毒或病毒样颗粒的胺(例如赖氨酸)残基，病毒样颗粒被首先活化。在将活化的病毒或病毒样颗粒从多余的试剂和副产物中分离后，含半胱氨酸的肽被加入并且通过加入SH-基到活化的病毒或病毒样颗粒的马来酰亚胺官能团上使联结发生。使用MBS的方法通过相似的机理结合肽和病毒或病毒样颗粒。使用sSMCC的结合反应能对SH-基高度特异。'这样，在抗原流感蛋白或蛋白片段中的半胱氨酸残基对温和结合是基本的。假如抗原蛋白或蛋白片段不具有半胱氨酸残基，那么半胱氨酸残基能被优选地在N-末端或C-末端加入到肽上。假如蛋白或蛋白片段中的所希望的表型含有半胱氨酸残基，结合应该用不使用sSMCC活化的病毒或病毒样颗粒的方法获得。假如蛋白或蛋白片段含有多于一个的半胱氨酸残基，蛋白或蛋白片段不应通过使用sSMCC来结合到病毒或病毒样颗粒上，除非多余的半胱氨酸能被取代或修饰。联结不应干扰蛋白或蛋白片段中的所希望的表型。半胱氨酸被用具有至少一个氨基酸的距离作为间隔物来优选地同所希望的表型序列隔离。本发明中另一个有用的结合通过使用N-乙酰高半胱氨酸硫内酯(NAHT)来获得。例如，硫代内酯能用来引入硫醇官能团到病毒或病毒样颗粒上来允许同马来酰亚胺化或溴-乙酰化的肽进行结合。(Tolmanetal.Int.J.PeptideProteinRes.41,1993，455-466;Conleyetal.Vaccine]994，12,445-451)。在本发明的其它实施方案中，偶联蛋白或蛋白片段到病毒或病毒样颗粒的结合反应涉及引入和/或使用反应物上的内在亲核基及引入和/或使用在其它反应物中的内在亲电基。一个活化方案将用来引入亲核硫醇基到病毒或病毒样颗粒并加入亲电基(优选地是卤化垸或马来酰亚胺)到流感蛋白或蛋白片段。产生的结合物将具有联结蛋白或蛋白片段和病毒或病毒颗粒的硫醇醚键。流感蛋白或蛋白片段的亲电基(马来酰亚胺或卤化烷)和病毒或病毒样颗粒的内在亲核基(优选地，伯胺和硫醇)间的直接反应导致了仲胺联结或硫醇醚键。选择性的设计涉及加入马来酰亚胺基或卤化烷到病毒或病毒样颗粒及引入末端半胱氨酸到流感蛋白或蛋白片段和/或再次使用导致硫醇醚键的内在流感蛋白硫醇。含有硫的氨基酸含有反应性的硫基。含有硫的氨基酸的例子包括半胱氨酸和诸如高半胱氨酸的非蛋白氨基酸。此外，在激活和同病毒或病毒样颗粒反应前，反应性硫可能会以二硫化物形式存在。例如，存在于流感蛋白或蛋白片段中的半胱氨酸能用在同病毒或病毒样颗粒的偶联反应中，该病毒或病毒样颗粒被诸如马来酰亚胺或卤化烷的亲电基激活。通过使用含有反应性马来酰亚胺和活化酯的异双功能交联剂引入马来酰亚胺基是普遍的。结合流感蛋白到病毒样颗粒的共价连接子在生理条件下可能是稳定的。这样的连接子的例子有非特异的交联试剂、单殖间隔物(monogeneticspacers)禾口双殖间隔物(bigenericspacers)。非特异交联试剂和它们的使用在本领域中是广为人知的。这样的试剂及它们的使用的例子包括同戊二醛的反应；同N乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺的反应，同或不同琥珀酰化的病毒或病毒样颗粒的混合物；糖基化取代物的高碘酸氧化，随后的在存在硼氢化钠或氰基硼氢化钠时同病毒或病毒样颗粒的游离氨基的偶联反应；非酰化末端丝氨酸和苏氨酸残基的高碘酸氧化能产生末端醛，该醛然后能同胺或肼反应，产生能用氰基硼氢化钠还原到仲胺的希夫碱或腙；芳香氨基的重氮化及随后的蛋白的酪氨酸残基上的偶联反应；同异氰酸盐的反应；或混合酸酐的反应。通常参见，Briand,etal.，1985J.Imm.Meth.78:59。单殖间隔物和它们的使用在本领域中是广为人知的。单殖间隔物是双功能的并且在结合发生前需要仅一个反应对的配偶体的功能化。双殖间隔物和它们的使用在本领域中是广为人知的。双殖间隔物在反应对的每一个配偶体被功能化后形成。当每一个功能化的配偶体同它的相应配偶体反应来形成稳定的共价键时结合发生。(参见例如，Marburg,etal.,1986J.Am.Chem.Sot.108:5282-5287,andMarburg,etal.,U.S.PatentNo.4，695，624)。本发明的优点是能获得结合物中流感蛋白同病毒或病毒样颗粒的各种摩尔比率。这个在病毒或病毒样颗粒上的"肽偶联载荷"能通过以试验或错误方式改变结合方法的方面来获得具有所希望的性质的结合物的方式被改变。例如，假如使得病毒或病毒样颗粒上的每一个反应位点均被结合到流感蛋白或蛋白片段的高偶联载荷是所期望的，那么人们能估计病毒或病毒样颗粒上的反应位点并在偶联反应中包括额外流感蛋白或蛋白片段的大摩尔比率。假如低密度偶联载荷是所希望的，人们能算入'病毒或病毒样颗粒'上每摩尔反应位点少于1摩尔流感蛋白的摩尔比率。人们选择的特定条件将最终被获得的收率、结合物的物理性质、产生的结合物的效价、人们希望给予的患者群体和期望剂量所指导。假如疫苗中的总蛋白不是重点考虑的问题，那么人么就能制定具有不同偶联载荷和不同免疫原性的结合物的剂量配方来传递相同的有效剂量。然而，假如总蛋白或总体积是重点考虑的问题，例如，假如结合物必须用在组合疫苗中，人们可能会注意结合物贡献到最终组合疫苗中的总体积或总蛋白。人们然后能评估具有不同偶联载荷的几种结合物的免疫原性，然后选择使用具有足够免疫原性和能被接受的总蛋白或总体积水平的结合物来加入到组合疫苗中。IV、疫苗本发明提供了用作抗流感病毒疫苗的组合物。在一个实施方案中，含有本发明组分的药物组合物能以酸性盐或碱性盐制备。药学上可接受的盐(水溶或油溶形式或可分散产品)包括传统的无毒盐或惯常的形成于例如无机或有机酸或碱的铵盐。这样的盐的例子包括酸加成盐，例如醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐(cyclopentanepropionate)、葡丰唐酸盐(digluconate)、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、glucoheptanoate、磷酸甘油、半硫酸盐(hernisulfate)、庚酸盐、己酸盐、氢氯化物、氢溴化物(hydrobromide)氢碘化物、2-羟基乙磺酸盐(2-hydroxyethanesulfonate)、乳酸盐马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐(2-naphthalenesulfonate)、烟酸盐草酸盐扑酸盐、果胶(pectinate)、过硫酸盐、3-苯丙酸盐(3-phenylpropionate)、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐酒石酸盐、硫氰酸盐(thioeyanate)、甲苯磺酸盐和十一酸盐；和碱性盐，例如，铵盐、诸如钠和钾盐的碱性金属盐、诸如钙盐和镁盐的碱土金属盐、诸如dicycloheylamine盐的同有机碱形成的盐、N-甲基-D-葡萄糖胺和同诸如精氨酸和赖氨酸等氨基酸形成的盐。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物在没有佐剂的情况下被给与到动物或患者。在其他实施方案中，该组合物在有佐剂的情况下被给与。基于铝的佐剂在本领域中普遍使用并且包括磷酸铝、氢氧化铝、羟磷酸铝和羟-硫酸-磷酸铝(aluminnunhyrdoxy-sulfate-phosphate)。普遍使用的佐剂的商品名包括ADJUPHOS、MERCKALUM和ALHYDROGEL。组合物能如所期望的和对使用的特定佐剂恰当的方式结合到佐剂或同佐剂共沉淀。非铝佐剂也能使用。非铝佐剂包括QS21、Lipid-A和它的衍生物或变种，福氏(Freund's)完全或非完全佐剂、中性脂质体、包含疫苗和细胞因子或炎症趋化因子类的脂质体。其他的佐剂包括CpG序列的免疫刺激核酸。参见例如，图3。通过使用本领域当前使用的任何技术，包括，例如，经口、经粘膜、静脉给药、肌肉给药、鞘内给药、硬膜外给药、腹膜内给药或皮下给药，本发明的组合物能被给与。本发明的实施方案包括的组合物通过鼻、口腔或皮肤而经粘膜传递。本发明另外的实施方案包括的组合物经鼻内传递。在其他实施方案中，所述组合物经口腔给药，通过消化植物宿主细胞生产组合物。在其他实施方案中，所述组合物经由贴剂而经皮给药。通过把本领域中熟知的包括受治者年龄、体重、性别和医疗条件、给药途径、期望效果和使用的特定组合物(例如，流感蛋白、装载在病毒或病毒样考虑上的蛋白，等)等因素考虑进去，合适的给药方案被优先确定。该疫苗能以多剂量接种的方式使用。在一个实施方案中，剂量将包括从大约lug到大约l.Omg总蛋白的范围。在本发明的另一个实施方案中该范围从大约0.01mg到l.Omg。然而，人们可能会更喜欢基于传递的肽的数量来调整剂量。在其他实施方案中，这些范围是指导。更精确的剂量能通过评估生产的结合物的免疫原性来确定，以便递送免疫有效的剂量。免疫有效剂量是剌激患者的免疫系统来建立免疫反应的剂量。优选地，免疫系统刺激的水平将足以产生足能提供长期的抵抗特定流感病毒感染导致的疾病的保护的免疫记忆。剂量的周期依赖于本领域熟知的因素。在最初的给药后，一个或多个加强剂量可能会随后给与来保持抗体滴度。给药方案的例子将是第一天给一剂，在第1或2个月给第二剂，在第3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或大于12个月时给与第三剂，和当需要时在遥远的时间给与额外的加强剂量。如此产生的免疫反应能彻底或部分抵抗流感病毒感染导致的疾病和虚弱症状。VI、生产包含VLPs的流感肽和流感抗原蛋白的组合物的方法在本发明另外的方面，生产用于人类或动物的流感疫苗的组合物的方法被提供，该方法包含i)提供编码包含融合到流感病毒肽的植物病毒衣壳蛋白的重组衣壳融合肽的第一核酸，所述流感病毒肽从包含M1、M2、HA、NA、NP、PB1、PB2、PA和NP2的组中选择，并在宿主细胞中表达该第一核酸，其中的宿主细胞选自植物细胞或荧光假单胞菌；ii)组装该衣壳融合肽来形成病毒或病毒样颗粒，其中的病毒或病毒样颗粒不含有宿主细胞的质膜或细胞壁蛋白；iii)提供至少一种编码至少一条衍生自新出现的流感病毒株的抗原蛋白或蛋白片段的第二核酸，并在宿主细胞中表达该第二核酸，其中的宿主细胞是植物细胞或荧光假单胞菌，并且可选地，其中的新出现流感病毒株被世界卫生组织所鉴定；和iv)分离并纯化该抗原蛋白或蛋白片段；和V)组合该病毒或病毒样颗粒和该抗原蛋白或蛋白片段来形成能给与到人或动物的组合物。在一个实施方案中，病毒或病毒样颗粒在植物宿主中生产，例如，在完整植物或植物细胞培养物中。在其他实施方案中，病毒样颗粒在荧光假单胞菌宿主细胞中生产。在一个实施方案中，抗原蛋白或蛋白片段在植物宿主中生产，例如，在完整植物或植物细胞培养物中。在其他实施方案中，抗原蛋白或蛋白片段在荧光假单胞菌宿主细胞中生产。在一个实施方案中，病毒或病毒样颗粒和抗原蛋白或蛋白片段在同一植物或荧光假单胞菌宿主细胞中共生产，并且衣壳融合肽在体内组装来形成病毒或病毒样颗粒。可选地，抗原蛋白和病毒样颗粒在植物和/或荧光假单胞菌宿主细胞中生产、分离、和纯化，其中的衣壳融合肽在体内组装或在体外重新组装来形成病毒样颗粒并同流感抗原蛋白或蛋白片段组合来形成能用于人类或动物的组合物。实施例实施例1、克隆流感A病毒的M2-e通用表位到豇豆褪绿斑点病毒(CCMV)外壳蛋白(CP)两条衍生自流感A病毒M2蛋白的23个氨基酸的肽M2e-1和M2e-2被独立地克隆入CCMVCP基因来在CCMV病毒样颗粒(VLPs)上进行表达。M2e-1肽序列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(Seq.ID.No.1)M2e-2肽序列SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(Seq.ID.No.2)所述插入物的每一条均用下面详述的热循环程序被重叠DNA寡核苷酸来合成<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>(来源于，InvitrogenCorp,Carlsbad,CA,USA,下文中称"Invitrogen")利用的寡核苷酸包括M2e-1F5'CGGGGATCCTGTCACTCTTGACAGAGGTAGAAACACCGATACGTAATGAATGG3，(Seq.ID.No.14)M2e-1R5'CGCAGGATCCCATCTGAAGAATCATTACAACGACAGCCCCATTCATTACGTATC3'(Seq.ID.No.30)M2e-2F5'CGGGGATCCTGTCACTCTTGACAGAGGTAGAAACACCGATACGTAATGAATGG3'(Seq.ID.No.31)M2e-2R5'CGCAGGATCCCATCTGAAGAGCCATTACAACGACATTCCCATTCATTACG3'(Seq.ID.No.32)产生的PCR产物用BflwM限制酶消化并亚克隆到用^W7M酶切的穿梭质粒pESC-CCMV129中，然后进行去磷酸化。嵌合CCMV-CP基因的编码序列然后被测序来确保插入的肽序列的方向和修饰的CP基因的完整性。嵌合外壳蛋白基因然后在Spel和Ibl位点被切离穿梭质粒并被亚克隆到荧光假单胞菌表达质粒pDOW1803的SpeI和A72oI位点。产生的质粒通过电穿孔转化到电穿孔感受态荧光假单胞菌MB214中，以15ug/ml的四环素作为选择试剂。实施例2、流感A病毒NP表位克隆入豇豆褪绿斑点病毒(CCMV)外壳蛋白(CP)衍生自流感A病毒NP蛋白的两个肽NP55-69和NP147-158被独立地克隆入将表达在CCMV病毒样颗粒(VLPs)上的CCMVCP基因中。NP55-69肽序列RLIQNSLTIERMVLS(S叫.ID.No.9)NP147-158肽序列TYQRTRALVRTG(Seq.ID.No.10)所述插入物的每一种均用在实施例1中公开的热循环程序通过重叠DNA寡核苷酸合成。这些寡核苷酸包括NP55-69FTGGTGCTGAGCGG3'(Seq.ID.No:33)子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、镍亲和层析、羟基磷灰石层析、反相层析、凝集素层析、制备电泳、去污剂增溶、用如柱层析的物质进行的选择性沉淀、免疫纯化方法、分子排阻层析、免疫沉淀方法、离心、超离心、密度梯度离心(例如，蔗糖梯度或氯化铯(CsCl)梯度)、通过分子排阻膜的超滤，和本领域已知的任何其它蛋白分离方法。例如，具有确定分子吸附性质的衣壳蛋白融合肽能被可逆地结合到配基。利用适当的配基，衣壳蛋白融合肽能被选择性吸附到纯化柱，然后以相对纯的形式从该柱子上被洗脱下来。通过酶活性，该衣壳蛋白然后被移除。另外，所述衣壳蛋白融合肽能使用免疫亲和柱或Ni-NTA柱被纯化。综合的技术在下述文献中被进一步描述，例如，R.Scopes,PeptidePurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag:N.Y.(1982);Deutscher,GuidetoPeptidePurification,AcademicPress(1990);U.S.Pat.No.4，511，503;S.Roe,PeptidePurificationTechniques:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),OxfordPress(2001);D.Bollag,etal"PeptideMethods,Wiley-Lisa,Inc.(1996);AKPatraetal,，PeptideExprPurif，18(2):p/182-92(2000);andR.Mukhija,etal.，Gene165(2):p.303-6(1995)。也参见例如，Aipibel，etal.(1987andperiodicsupplements);Deutscher(1990)"GuidetoPeptidePurification,"MethodsinEnzymologyvol.182，andothervolumesinthis30series;Coligan,etal.(19%andperiodicSupplements)CurrentProtocolsinPeptideScienceWiley/Greene,NY;和肽纯化产品使用的厂商文南犬，例如，Pharmacia,Piscataway,NJ.或Bio-Rad,Richmond,Calif。重组技术的组合允许融合到适当的片段，例如，融合到FLAG序列或能被经由可被蛋白酶移除的序列融合的同等物。也参见例如，Hochuli(1989)ChemischeIndustrie12:69-70;Hochuli(1990)"PurificationofRecombinantPeptideswithMetalChelateAbsorbent"inSetlow(ed.)GeneticEngineering,PrincipleandMethods12:87-98,PlenumPress,NY;andCrowe,etal.(1992)QIAexpress:TheHighLevelExpression&PeptidePurificationSystemQIAGEN,Inc.,Chatsworth,Calif。在其它实施方案中，在宿主细胞尤其是细菌宿主细胞中表达的衣壳融合肽可能会形成不可溶的聚集物("包涵体")。几种方法适用于纯化从包涵体而来的肽。例如，通过裂解宿主细胞，例如通过在含50mMHA91-108RAGTTGCTGAAAGCCTTGCTCAG3'(Seq.ID.No:38)产生的PCR产物用SflwM限制酶消化并亚克隆入用S"w//1酶切的穿梭质粒pESC-CCMV129中，然后进行去磷酸化。嵌合CCMV-CP基因的编码序列然后被测序来确保插入的肽序列的方向和修饰的CP基因的完整性。嵌合外壳蛋白基因然后在^el和屈ol位点被切离穿梭质粒并被亚克隆到荧光假单胞菌表达质粒pDOW1803的^el和扇o[位点。产生的质粒通过电穿孔转化到电穿孔感受态荧光假单胞菌MB214中，以15ug/ml的四环素作为选择试剂。实施例4、重组CCMV衣壳融合肽的表达CCMV129-融合肽表达质粒按下述流程转化入荧光假单胞菌MB214。在玻璃瓶中的宿主细胞在冰上逐渐地融化。对每一个转化，1PL纯化的表达质粒DNA被加入到宿主细胞中，产生的混合物用移液管头轻轻地旋动来混合，然后在冰上孵育30分装。该混合物被转移到一次性使用的电穿孔杯(伯乐基因脉冲器杯(BioRadGenePulserCuvette)，0.2cm电极距，catno.165-2086)。将该电穿孔杯放到预设到2000hrns、25[ifarads、2.25kV条件的伯乐基因脉冲器中。细胞被短暂地脉冲(大约l-2秒)。迅速加入冷的LB培养基，产生的混悬物在30'C孵育2小时。然后将细胞铺在LBtet15(补充四环素的LB培养基)琼脂上并在3(TC生长过夜。从每一个平板上挑取一个菌落，挑取的样品接种到在遮光摇瓶中的50mlLB种子培养物(LBseedculture)中。液体悬浮培养物以250rpm转速在3(TC生长过夜。产生的每一种种子培养物的10ml然后用来接种在1升遮光摇瓶中的200mL摇瓶培养基(即酵母抽提物和含有微量元素的盐、柠檬酸钠和甘油，pH值6.8)。为了选择加入四环素。接种的培养物以250rpm转速在30。C生长过夜，为了表达CCMV129-融合肽嵌合外壳蛋白，用IPTG进行诱导。将从每一个摇瓶培养物中取出的lmL培养物进行离心来沉淀细胞。细胞沉淀在含有2mMEDTA的pH值8.2的0.75mL冷50mMTris-HCl中重悬。然后加入0.1%体积的10%TritonX-100去污剂，然后加入溶菌酶使终浓度为0.2mg/mL。细胞然后在冰上孵育2小时，在那个时间清澈粘稠的细胞裂解物应该是明显的。将1/200体积的1MMgCl2加入裂解物中，然后加入1/200体积的2mg/mLDNaseI，然后在冰上孵育1小时，在那个时间裂解物应该已经变成粘稠度少得多的液体。处理过的裂解物然后在4。C下在桌面离心机中以最高速离心30分钟，然后上清倾入干净的管中。倾入的上清是"可溶的"蛋白组分。剩下的沉淀然后重悬于0.75mLTE缓冲液中(含lOmMTris-Cl、pH值7.5、含lmMEDTA)。重悬的沉淀是"不可溶的"组分。实施例5、重组CCMV衣壳融合肽的分析"可溶的"和"不可溶的"组分在NuPAGE4-12%双-Tris胶(购自Invitrogen，Cat.NP0323)上、具有1.0mmX15个孔、按照制造商说明书进行电泳。5ul每种组分同5ul2X还原性SDS-PAGE上样缓冲液混合，并在上样到胶上前煮沸5分钟。所述胶用简单蓝安全染色剂(购自Invitrogen，Cat.LC6060)染色并用水过夜脱色。图4显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同M2e-1流感病毒肽融合CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。图5显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同M2e-2流感病毒肽融合CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。图6显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同NP55-69流感病毒肽融合CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。图7显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同NP147-158流感病毒肽融合CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。图8显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同HA91-108流感病毒肽融合CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。实施例6、重组CCMVVLPs的纯化用来纯化嵌合CCMVVLPs的方法包含下述步骤(1)细胞裂解，(2)包涵体(IB)洗涤和分离，(3)IB可溶化，(4)热休克蛋白(HSP)污染物去除，(5)内毒素去除，(6)外壳蛋白复性，(7)澄清，(8)VLP组装，(9)缓冲液更换到pH7.0的PBS，禾n(10)无菌过滤。下述缓冲液被使用a、裂解缓冲液-100mMNaCl/5mMEDTA/0.1-0.2mMPMSF/50mMTris,pH7.5b、缓冲液AU-低离子强度-8M尿素/lmMDTT/20mMTris，pH7.5c、缓冲液Bw/8M尿素-lMNaCl/8M尿素/lmMDTT/20mMTris,pH7.5d、CIP溶液-0.5NNaOH/2MNaCle、柱制备溶液-100mMTris，pH7.5,f、储存溶液-20%乙醇g、缓冲液B-lMNaCl/lmMDTT/20mMTris，pH7.5h、MustangE(购自Pall，cat.#MSTG25E3)-过滤的病毒组装缓冲液-0.1NaOAc，pH4.8，O.lMNaCl，0.0002MPMSF。i、MustangE-过滤的pH7.0PBS。15-20克荧光假单胞菌湿细胞泥被量入50mL锥形瓶中，加入裂解缓冲液使总体积为40ml。细胞泥溶液被涡旋和搅拌直至有点均质化。通过使用高速齿轮并在1280psi下两次通过法兰西压榨器，细胞被裂解。裂解物(~33ml)在4。C以IOOOOXG离心IO分钟。将上清丢弃。产生的沉淀紧密并具有粉状一致性、色淡并同细胞糊不同。将4-5ml裂解缓冲液加入到沉淀中，然后该溶液用刮勺涡旋和搅动直至沉淀溶解。加入裂解缓冲液至总体积为40ml。涡旋该样品直至沉淀溶解。该样品在4°C以10000XG离心10分钟。该IB洗涤用裂解缓冲液至少重复一次，最后一次用去离子水进行。通过涡旋，IBs溶于4-5ml8M尿素/lmMDTT/20mMTris，pH7.5的溶液中。IB溶液的体积被用8M尿素/lmMDTT/20mMTris,pH7.5调整到40ml。假如需要，该溶液在冷冻的超声破碎器槽中超声破碎15分钟并在4。C摇动过夜，然后进行澄清化(通过在4'C下以10000XG离心10分钟或用0.45umWhatmanGD/X滤纸过滤，cat.#6976-2504)。Q-SepharoseFastFlow(GEHealth)柱用10倍柱体积(CV)的缓冲液AU-低离子强度-8M尿素/lmMDTT/20mMTris-HC1，pH7.5(AU-Low)进行平衡。每ml树脂上8mlIB溶液，收集2ml流出(FT)组分。该柱然后用6CV缓冲液AU-Low洗涤，用5CV含8M尿素的缓冲液B进行洗脱。该柱用6CVCIP溶液清洗和再生并储存于20%乙醇中。在收集的FT组分中发现了带有HSP污染物的CCMV外壳蛋白。SartobindQl5X或QIOOX滤膜(Sartorius)用10ml缓冲液AU-Low平衡。IB溶液用该膜过滤且滤液被澄清。过滤的溶液同5X体积的缓冲液B加到管中并立即混合。稀释的溶液可以在4'C混合几分钟，然后在4'C下用3500Da膜过夜透析缓冲液B,同时缓慢搅拌。缓冲液至少改变一次。在透析后，假如需要，澄清该溶液。复性的蛋白溶液被透析入病毒组装缓冲液中12小时并通过离心或0.2um过滤进行澄清。重新组装的VLP溶液通过过300KDa膜被浓縮在病毒组装缓冲液中并使用3缓冲液交换法交换到PBS，pH7.0中。用0.2um滤纸进行最终的除菌过滤。实施例7、纯化的重组CCMVVLPs分析纯化的VLPs在NuPAGE4-12%双-Tris胶(购自Invitrogen，Cat.NP0323)上、具有1.0mmX15个孔、按照制造商说明书进行电泳。5ul样品同5ul2X还原性SDS-PAGE上样缓冲液混合，并在上样到胶上前煮沸5分钟。所述胶用简单蓝安全染色剂(购自Iiwitrogen，Cat.LC6060)染色并用水过夜脱色。Westernblot检测使用作为第一抗体的抗-CCMVIgG(德国DSMZ登入号.ASOOIO、抗流感AM2蛋白(购自ABR(AffinityBioReagents)的小鼠单克隆IgGlKappa，cat#:MAI-082)，和WESTERNBREEZE试剂盒(购自Invitrogen,Cat.WB7105)，并按制作者的方法进行实验。图9显示了通过简单蓝安全染色剂染色(Invitrogen)的SDS-PAGE检测到的同M2e-1流感病毒肽融合的纯化的CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达和检测。图10显示了通过使用抗CCMV和抗M2抗体14B的westernblotting检测到同M2e-1流感病毒肽融合的CCMV129CP在荧光假单胞菌中的表达。M2e肽被抗M2抗体所识别。实施例8、流感A病毒M2-e通用表位克隆入豇豆花叶病毒(CPMV)外壳蛋白(CP)衍生自流感A病毒M2蛋白的M2e-3被独立地克隆入将表达在CPMV病毒颗粒上的CPMV小CP基因中。M2e-3肽序列SLLTEVETP丽EGCRCNDSSD(Seq.ID.No.3)所述插入物用在实施例1中公开的热循环程序通过重叠DNA寡核苷酸合成。所述寡核苷酸是M2e-3F5，ATGGATAGCTAGCACTCCTCCTGCTAGTCTGCTGACID.No.39)M2e-3R5TGCCTGTGACGTCTGAAAATGGATCGCTGCTATCGTTGCAGCGGCAGCCTTCGTTGCGAATCGG3'(S叫ID.No.40)产生的PCR产物用Jaffl和A%el限制酶(NEB)消化并亚克隆入用Ja/II和JV/zel酶切的质粒pDOW2604中，然后进行去磷酸化。2ixL连接产物转化入Topl0Oneshot大肠杆菌细胞(Invkrogen)。细胞/连接产物混合物在冰上孵育30分钟，在加入0.5mlLB动物无豆水解产物培养基(Teknova)前热休克45秒。转化细胞在铺到含100ug/ml氨节西物无豆水解产物培养基琼脂平板前，在37°C摇1小时。嵌合CPMV-CP基因的编码序列(pDOW-M2e-3)然后被测序来确保插入的肽序列的方向和修饰的CP基因的完整性。实施例9、含流感A病毒M2-e通用表位的重组CPMV在豇豆植物中的生产嵌合CPMV颗粒在植物中的生产购自FerryMorse序号1450的豇豆加利福尼亚#5种子室温下在湿纸巾中过夜萌芽。萌芽的种子转移到土壤中。萌芽后七天该豆苗用存在研磨剂的CPMVRNAl和嵌合CPMVRNA2进行接种。所述CPMVRNA通过体外转录从用M/wI酶切的pDOW2605质粒和用EcoRI酶切的pDOW-M2e-3质粒生产而来。线性化的质粒DNA用Qiagen净化柱或类似的净化试剂盒进行柱纯化。用含有CAP(40mM)的T7MEGAscript试剂盒(Ambion,catalog#1334)按照制造商说明书进行转录反应。转录物的质量通过在琼脂糖凝胶上跑11RNA转录物进行分析。'在接种后，这些植物在25r、光周期为16小时光照8小时黑暗的情况下生长二到三周。显示出症状的叶子被采集并在纯化前冻存于-80°C。嵌合CPMV颗粒的纯化40克CPMV感染的叶片组织被冻存于-8(TC。冷冻的叶片组织用手粉碎并倒入序号8011S的Waring高速搅拌器。120ml含PMSF的冷AIEC结合缓冲液(30mMTris碱pH7.50，0.2mMPMSF)被倾倒在粉碎的叶片上。这些叶片在高速下磨两次共3秒。获得的溶液倒入500ml的离心瓶中。搅拌器用30ml冷A正C结合缓冲液洗涤且该洗涤液也倒入500ml的离心瓶中。获得的溶液以15000G离心30分钟来去除植物细胞残片。上清倒入刻度量筒中。为了沉淀CPMV病毒，冷PEG6000溶液(20%PEG6000，lMNaCl)被加入到上清中使PEG终浓度为含0.2MNaCl的4。/。PEG6000，并且该溶液被轻轻混合。获得的溶液在冰上沉淀1小时。该病毒沉淀溶液然后以15000G离心30分钟来收集CPMV病毒沉淀。上清被倒掉，然后病毒沉淀被迅速重悬在阴离子交换结合缓冲液(30mMTris碱pH7.50)中。为了进一步纯化该病毒样颗粒，该蛋白混合物，通过使用购自AppliedBiosystems序号1-2559-11的POROS50HQ强阴离子交换树脂分馏该蛋白混合物。20倍柱体积梯度是从溶液A(30mMTris碱pH6.75)到缓冲液B(含1MNaCl的30mMTris碱pH6.75)。该层析用贝勾自AmershamBiosciences序号18-1112-41的AKTAexplorer进行。含有期望病毒样颗粒的在梯度上的第一个峰用100KDa截留膜序号UFC910096的Millipore离心浓縮器将缓冲液交换成PBS。获得的样品冻存于-8(TC。实施例10、含流感A病毒M2-e通用表位的重组CPMV的分析小外壳蛋白和大外壳蛋白的稳定性用SDS-PAGE进行实验。组装的嵌合CPMV病毒颗粒的完整性用分子排阻层析进行实验。纯化的颗粒在NuPAGE4-120/。双-Tris胶(购自Invitrogen，Cat.NP0323)上、具有1.0mmX15个孔、按照制造商说明书进行电泳。5ul样品同5ul2X还原性SDS-PAGE上样缓冲液混合，并在上样到胶上前煮沸5分钟。所述胶用简单蓝安全染色剂(购自Invitrogen，Cat.LC6060)染色并用水过夜脱色。Westernblot检测使用作为第一抗体的多克隆抗-CPMV多克隆兔IgGJ16、抗流感AM2蛋白(购自ABR(A伍nityBioReagents)的小鼠单克隆lgGlKappa，cat#:MA1-082)，禾PWESTERNBREEZE试剂盒(购自Invitrogen,Cat.WB7105)，并按制作者的方法进行实验。图11显示了通过SDS-PAGE和使用抗CPMV和抗M2抗体14B的WesternBlotting检测到的同M2e-1流感病毒肽融融合的CPMV在植物中的表达。M2e肽被抗M2抗体所识别。实施例11、用于在植物或植物细胞中表达的HA基因和基因片段编码SEQIDNO:15中从流感病毒A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株中鉴定的流感HA的基因从DNA2.0(DNA2.0，MenloPark,CA94025,USA)订购合成。合成的HA基因被工程化来支持植物密码子使用偏好并包含位于该基因两侧用于克隆目的的在该基因中没有相同限制性酶切位点的制造好的限制性位点。合成的全长HA基因缺少C末端跨膜区域和胞质尾。参见图12和图13。用于在植物细胞中克隆和表达的密码子优化的全长HA基因ORF的核苷酸序列在表5，SEQIDNo:16中显示。从SEQIDNo:16翻译而来的全长HA蛋白的氨基酸序列在表5，SEQIDNo:17中显示。该序列缺少C末端跨膜区域和胞质尾并在蛋白的C末端包含His-标记。密码子优化的HA蛋白片段的核苷酸序列HAl和HA2在表5，SEQIDNo:19和21中显示。从SEQIDNO:19和21翻译而来的HAl和HA2蛋白片段的氨基酸序列在表5，SEQIDNo:18和20中显示。两条HA片段均含有天然的信号肽，C末端跨膜区域和胞质尾被移除，并在该蛋白片段的C末端包含His-标记。实施例12、流感全长HA、HAl和HA2克隆入基于pDOW3451PVX的表达载体通过使用允许将全长HA基因从载体G01129(DNA2.0)中切离的限制酶EcoRV和BspEl来分离全长的HA基因。消化的G01129跑琼脂糖凝胶来将载体和HA基因分离。HA基因进行凝胶纯化，然后亚克隆入也用EcoRV和BspEl酶切的载体pDOW3451并使用小牛碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化。参见图14。成功的新载体pDOW3471克隆通过限制酶切图谱和筛选HA基因的菌落PCR进行确认。通过在PCR反应中使用G01129作为模板来分离HAl和HA2基因片段。第一个PCR反应用来扩增包含EcoRV限制位点、信号肽和ORF起点的HAl基因。反义引物用来在C末端加入6聚组氨酸标记和BspEl限制位点。PCR反应使用SuperPCRMix(Invitrogen)按照厂商说明书进行。用来扩增HAl片段的引物是Thai1FHA15'GCGCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTC3'(S叫ID.No.41)Thai3HAlBspEl5'GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTCTCTTCTTACGTC3'(Seq.ID.No.42)第二个反应用来扩增HA2片段。使用了下述引物Thai8FHA2EcoRVTCAGTTTGGTCAAATCAGGATTGTTCG3'(Seq.ID.No.43)Thai7HA2BspEl5'GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTTGGTAGATACC3'(Seq.ID.No.44)PCR反应的热循环设置包括1、95。C2分钟2、94。C30秒3、56。C30秒4、68。Cl:10分钟5、回到步骤234次6、68。C10分钟7、4°CPCR后，HA1和HA2片段的产物用五coiV和进行消化，跑DNA凝胶，用来克隆入载体pDOW3451的条带被切下。成功的新载体pDOW3471克隆通过限制酶切图谱和筛选HA基因的菌落PCR进行确认。实施例13、从pDOW3475和pDOW3466制备RNA转录物pDOW3471和pDOW3466(含有带有外壳蛋白中的删除的PVX基因组的帮助者质粒)均用限制酶Spel线性化，Quickspin柱净化(Qiagen)和无核酸酶的水(Ambion)洗脱。通过使用mMessageMachineT7capped试剂盒(Ambion)的成份，体外转录反应按下述方法建立。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>反应在冰上进行建立，然后在37'C孵育2小时。在体外RNA转录后，每个反应的少量样品进行跑胶来观察RNA产物。实施例14、烟草(7V/cW/Vmtf&wZAtfVma)植物接种和HA蛋白在植物中的生产使用从pDOW3475和pDOW3466体外转录的RNA接种烟草植物。一片2-3周龄的植物叶子用少量金刚砂进行研磨。RNA接种物应用在新叶和金刚砂上。使用干净的手套将所述RNA擦入叶片组织。每一植物接种使用一剂同pDOW3466组合的pDOW3475的接种物(20iiL体外转录RNA)。观察植物的症状形成。参见图15.实施例15、NTl-烟草细胞接种和HA蛋白在植物细胞中的生产通过将体外转录RNA电穿孔到NT1原生质体进行烟草NT1细胞的转染。通过使用纤维溶素(cellulysin)和离析酶去除细胞壁制备用于电穿孔的NT1原生质体。在pDOW3475RNA电穿孔入细胞前五分钟，5ug含有HcPro基因的质粒同细胞进行孵育。HcPro先前已经被证明能阻止基因沉默从而增加了病毒复制的量和活性。互补(complementation)被推论在植物细胞培养物繁殖表达HA基因的病毒RNA中不是必需的。pDOW3466衍生的RNA用作接种物。在紧邻电穿孔前，5uL体外转录的RNA被加入到在冰冷的0.4cm电极距电穿孔杯(Biorad)中的lml处理过的植物细胞中，并快速混匀。细胞在500ixF和250V下脉冲11-13秒。细胞铺到陪替培养皿中的5mlNTl培养基上，用parafilm密封，然后在室温下生长48小时。细胞被进行实验来检测成功的转染和HA生产。为了在天然和变性条件下通过Ni-NTA离心柱(Qiagen)纯化组氨酸标记的HA蛋白，全部的细胞培养物被沉淀、冷冻、用研杵磨碎、和裂解。样品然后用使用第一抗体抗-His抗体(Qiagen3packset)和第二抗体抗小鼠AP(WesternBreeze,Invitrogen)的westernblot进行检领!j。实施例16、HA或HA片段在荧光假单胞菌中的表达编码SEQIDNO:25中从流感病毒A/Vietnam/2004(H5N1)病毒株中鉴定的流感HA的基因从DNA2.0(DNA2.0，MenloPark,CA94025，USA)订购合成。合成的HA基因被工程化来支持荧光假单胞菌密码子使用偏好并含有核糖体结合位点和位于该基因两侧用于克隆目的的在该基因中没有相同限制性酶切位点的制造好的限制性位点。用于在荧光假单胞菌细胞中克隆和表达的密码子优化的全长HA基因ORF的核苷酸序列在表5，SEQIDNo:26中显示。HA蛋白基因在Spel和Xhol位点被切离所述质粒并取代buibui基因在Spel和Xhol位点被亚克隆入荧光假单胞菌表达质粒pDOW1803。产生的质粒通过电穿孔被转化入电穿孔感受态荧光假单胞菌MB214。在玻璃瓶中的宿主细胞在冰上逐渐地融化。对每一个转化，1uL纯化的表达质粒DNA被加入到宿主细胞中，产生的混合物用移液管头轻轻地旋动来混合，然后在冰上孵育30分装。该混合物被转移到一次性使用的电穿孔杯(伯乐基因脉冲器杯，0.2cm电极距，catno.165-2086)。将该电穿孔杯放到预设到200Ohms、25pfarads、2.25kV条件的伯乐基因脉冲器中。细胞被短暂地脉冲(大约l-2秒)。迅速加入冷的LB培养基，产生的混悬物在3(TC孵育2小时。然后将细胞铺在LBtetl5(补充15叱/ml四环素的LB培养基)琼脂上并在3(TC生长过夜。从每一个平板上挑取一个菌落，挑取的样品接种到在遮光摇瓶中的50mlLB种子培养物(LBseedculture)中。液体悬浮培养物以250rpm转速在3(TC生长过夜。10ml产生的每一种种子培养物然后用来接种在1升遮光摇瓶中的200mL摇瓶培养基(即酵母抽提物和含有微量元素的盐、柠檬酸钠和甘油，pH值6.8)。为了选择加入四环素。接种的培养物以250rpm转速在3(TC生长过夜，为了表达HA蛋白，用IPTG进行诱导。实施例17、pbp-HA在荧光假单胞菌DC454周质中的克隆和表达24个氨基酸残基的磷酸盐结合蛋白分泌(pbp)信号肽被融合到SEQIDNo:29中的修饰的流感病毒A/Vietnam/2004(H5N1)病毒株的不含它的天然分泌信号肽和C末端跨膜区域的HA蛋白的N端。pbp信号肽用下述引物对从pDOW1113中扩增出pbpF-Spel5'(Seq.ID.No.45)pbp-HA-Rev5'GTGATAGCCGATGCAAATCTGGTCGGCCACCGCGTTGGC3'(S叫ID.No.46)在SEQIDNo:26中的修饰的HA蛋白从含有HA基因的穿梭质粒中通过PCR用下述弓1物对扩增出pbp-HA-For5'GCCAACGCGGTGGCCGACCAGATTTGCATCGGCTATCAC3'(Seq.ID.No.47)HA-XhoI-Rev5，CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC3'(Seq.ID.No.48)融合pbp-HA基因然后用下述引物对进行扩增pbpF-Spel5'GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG3'(Seq.ID.49)HA-XhoI-Rev5'CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC3'(Seq.ID.No.48)<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>步骤1:包含pbp信号的质粒用作PCR模板。pbpF-Spel和pbp-HA-Rev引物在反应1中使用。pbp-HA-For和HA-XhoI-Rev引物在反应2中使用。PCR反应按上面公开的热循环方法进行。步骤2:PCR产物1和2用作这个反应的PCR模板。pbpF-Spel和HA-XhoI-Rev引物用来扩增最终的PCR产物。最终的PCR产物然后用^el和lol进行消化并克隆入用Spel和屈ol限制酶切的荧光假单胞菌表达载体pDOW1169并去磷酸化。连接产物在用MicroBio-spin6层析柱(BioRad)纯化后通过电穿孔转化入荧光假单胞菌DC454。该转化物在LB培养基中在3(TC摇2小时后铺在M9葡萄糖培养基平板(Teknova)上。这些平板在3(TC孵育48小时。插入物的存在同限制酶消化和测序确定。蛋白表达单个的转化子接种到50mlM9葡萄糖培养基中并过夜生长。OD600值3.0-5.0的荧光假单胞菌培养物用来接种摇瓶培养物。摇瓶然后在30"C以300rpm转速孵育过夜。OD600值15.0-20.0的过夜培养物用300uM的异丙基-0-D-半乳糖硫吡楠糖苷(IPTG)进行诱导。培养物在诱导后24小时收集。实施例18、HA或HA片段在体外同CCMV病毒或病毒样颗粒结合含有流感插入物的嵌合CCMVVLP颗粒按实施例1-7公开的方法生产，然后被进一步处理来结合HA蛋白、或HA蛋白的片段、或HA蛋白的突变体、或如实施例11-17中公开的衍生的HA片段的突变体到CCMV外壳蛋白。所述HA蛋白或蛋白片段被联结到CCMV颗粒或它的突变体的表面暴露半胱氨酸残基。在存在50mM醋酸钠pH4.8中的lmMCuS04、摩尔比率为93pMCCMV衣壳蛋白对385pMHA的情况下，通过氧化偶联CCMV上的半胱氨酸硫醇基到所述蛋白上的游离硫醇基上述联结反应得以实现。该反应进行l-4小时。可选地，通过在Gillitzer,etal.,Chemicalmodificationofaviralcageformultivalentpresentation,Chem.Commun.,2002，2390-2391禾口Chatterjietal"ChemicalconjugationofheterologousproteinsonthesurfaceofCowpeaMosaicVims.BioconjugateChem.,2004,Vol.15，807-813中描述的方法，所述HA蛋白也能联结到CCMVVLP颗粒的表面。通过分子排阻层析将结合的颗粒同非结合的颗粒分离开，所述分子排阻层析使用购自GEBioscience的1cmX30cmSuperose6柱并以0.1MNaP04pH7.00的缓冲液为流动相。可选地，通过4%PEG0.2MNacl沉淀及随后的在30mMTrispH7.50缓冲液中重悬也可将结合的颗粒同游离的HA蛋白或蛋白片段分离。实施例19、HA或HA片段在体外同CPMV病毒或病毒样颗粒结合含有流感插入物的嵌合CPMVVLP颗粒按实施例8-10公开的方法生产，然后被进一步处理来结合HA蛋白、或HA蛋白的片段、或HA蛋白的突变体、或如实施例11-17中公开的衍生的HA片段的突变体到CPMV外壳蛋白。所述HA蛋白被联结到CPMV颗粒或它的突变体的表面暴露半胱氨酸残基。在存在50mM醋酸钠pH4.8中的lmMCuS04、摩尔比率为93pMCPMV衣壳蛋白对385pMHA的情况下，通过氧化偶联CPMV上的半胱氨酸硫醇基到所述蛋白上的游离硫醇基上述联结反应得以实现。该反应进行1-4小时。可选地，通过在Gillitzer,etal.,Chemicalmodificationofaviralcageformultivalentpresentation,Chem.Commim"2002,2390-2391禾nChatterjietal"ChemicalconjugationofheterologousproteinsonthesurfaceofCowpeaMosaicVims.BioconjugateChem.,2004,Vol.15,807-813中描述的方法，所述HA蛋白也能联结到CPMVVLP颗粒的表面。通过分子排阻层析将结合的颗粒同非结合的颗粒分离开，所述分子排阻层析使用购自GEBioscience的1cmX30cmSuperose6柱并以0.1MNaP04pH7.00的缓冲液为流动相。可选地，通过4。/。PEG0.2MNacl沉淀及随后的在30mMTrispH7.50缓冲液中重悬也可将结合的颗粒同非结合的HA蛋白或蛋白片段分离。实施例20、用含有M2e表位的嵌合CCMV和CPMV颗粒免疫小鼠含有流感表位插入物并结合到HA蛋白的CCMVVLPs按实施例18中公开的方法生产并给与到雌性Balb/c小鼠。7周龄Balb/c小鼠每三周一次腹腔注射100ug纯化的结合HA的CCMVVLP。对于鼻内免疫，100"g结合的CCMVVLP被给与到麻醉的小鼠。lOOul总体积被给与到两个鼻孔中(每个鼻孔50ixl)。对照小鼠按照相同的剂量日程表被给与携带诸如炭疽保护抗原(PA)的不相关肽插入物的CCMVVLP。可选地，对照小鼠被给与pH7.0的PBS。在第一次给药前1天和两次后续的给药的每一次后两周，获取血清样品、鼻内和肺冲洗物。免疫小鼠然后在最后一次免疫后2-3周以4000PFU/小鼠的活的小鼠可适合的流感病毒株进行攻毒。然后观察这些小鼠的存活率。为了确定针对CCMV、HA和M2e蛋白的免疫反应，所述样品通过ELISA实验测定抗体滴度。权利要求1.生产用于人或动物的流感疫苗的组合物的方法，其包含i)提供编码重组衣壳融合肽的第一核酸，所述衣壳融合肽包含融合到流感病毒肽的植物病毒衣壳蛋白，并在宿主细胞中表达所述衣壳融合肽；ii)组装所述衣壳融合肽来形成病毒或病毒样颗粒；iii)提供至少一种编码至少一条衍生自流感病毒株的抗原蛋白或蛋白片段的第二核酸，并在宿主细胞中表达所述抗原蛋白或蛋白片段；iv)分离并纯化所述抗原蛋白或蛋白片段；和v)组合所述病毒或病毒样颗粒和所述抗原蛋白或蛋白片段来形成能给与到人或动物的组合物。2、权利要求l的方法，其中的分离抗原蛋白或蛋白片段偶联到病毒或病毒样颗粒。3、权利要求l的方法，其中的分离抗原蛋白或蛋白片段衍生自新出现的流感病毒株。4、权利要求l的方法，其中的衣壳融合肽包含衍生自保守流感病毒肽的流感病毒肽。5、权利要求4的方法，其中的保守流感病毒肽衍生自流感M2肽。6、权利要求5的方法，其中的M2肽选自Seq.ID.No.1-5或22-24。7、权利要求6的方法，其中的M2肽选自S叫.ID.No.3、22、23或24。8、权利要求1的方法，其中的植物病毒衣壳蛋白衍生自CCMV或CPMV植物病毒。9、权利要求8的方法，其中的植物病毒衣壳蛋白选自S叫ID.No.11-13。10、权利要求1的方法，其中的病毒或病毒样颗粒不含有来源于宿主细胞质膜或细胞壁的蛋白。11、一种组合物，该组合物包含i)重组衣壳融合肽，该衣壳融合肽包含融合到流感病毒肽的植物病毒衣壳蛋白，其中的衣壳融合肽进行组装来形成病毒或病毒样颗粒，禾口ii)至少一条衍生自流感病毒的分离抗原蛋白或蛋白片段。12、权利要求ll的组合物，其中的分离抗原蛋白或蛋白片段偶联到病毒或病毒样颗粒。13、权利要求ll的组合物，其中的分离抗原蛋白或蛋白片段衍生自新*出现的流感病毒株。14、权利要求ll的组合物，其中的衣壳融合肽包含衍生自保守流感病毒肽的流感病毒肽。15、权利要求14的组合物，其中的保守流感病毒肽衍生自流感M2肽。16、权利要求15的组合物，其中的M2肽选自Seq.ID.No.1-5或22-24。17、权利要求16的组合物，其中的M2肽选自Seq.ID.No.3、22、23或24。18、权利要求11的组合物，其中的植物病毒衣壳蛋白衍生自CCMV或CPMV植物病毒。19、权利要求18的组合物，其中的植物病毒衣壳蛋白选自Seq.ID.No.11-13。20、权利要求ll的组合物，其中的病毒或病毒样颗粒不含有来源于宿主细胞质膜或细胞壁的蛋白。21、权利要求ll的组合物，其中的组合物进一步包含免疫刺激分子。22、权利要求21的组合物，其中的免疫刺激分子包含CpG序列。23、选自Seq.ID.No.3、22、23或24的肽序列。全文摘要本发明提供了用作抵抗流感病毒的疫苗的组合物，以及生产该组合物的快速方法。所述组合物包括i、至少一条衍生自流感病毒的肽，其中的肽融合到衍生自植物病毒的衣壳蛋白上，形成重组衣壳融合肽和ii、至少一条分离的衍生自人或禽流感病毒的抗原蛋白或蛋白片段。所述的分离的衍生自人或禽流感病毒的抗原蛋白或蛋白片段能被共价结合到重组衣壳融合肽的表面。文档编号A61K39/145GK101227920SQ200680026505公开日2008年7月23日申请日期2006年7月19日优先权日2005年7月19日发明者J·M·拉达姆,J·P·费尔普斯,L·拉索霍娃,N·党申请人:陶氏环球技术公司