，该细胞系源于马-达二氏 (Mad in-Dar dy)犬肾。原始的MDCK细胞系可从ATCC获得，编号为CCL-34，但也可以使用这个 细胞系的衍生物和其它MDCK细胞系。例如，参考文献48公开了一种适化后能在悬浮培养物 中生长的MDCK细胞系（"MDCK 33016"，保藏编号为DSM ACC 2219)。同样，参考文献52公开了 一种能在无血清培养物中悬浮生长的MDCK衍生的细胞系（"B-702"，保藏编号为FERM BP-7449)。参考文献53公开了非致瘤性]\?)0(细胞，包括"]\?)0(-5"（41'0：?了4-6500)、"]\?)0(-SF101"（ATCC PTA-6501)、"MDCK-SF102"（ATCC PTA-6502)和"MDCK-SF103"（PTA-6503)。参 考文献54公开了对感染高度易感的MDCK细胞系，包括"MDCK. 5F1"细胞(ATCC CRL-12042)。 这些MDCK细胞系都可以使用。
[0050] 病毒可以在贴壁培养或悬浮培养的细胞中生长。也可以采用微载体培养。在一些 实施方式中，可改造细胞使其适应悬浮生长。
[0051] 优选将细胞系培养在无血清培养基和/或不含蛋白的培养基中。在本发明中称某 培养基为无血清培养基表示，该培养基中不含来源于人或动物血清的添加物。在这种培养 物中生长的细胞天然地包含其自身的蛋白质，但是不含蛋白的培养基应当被理解为这样的 培养基:在没有蛋白质、生长因子、其他蛋白添加物和非血清蛋白的情况下细胞能够在其中 繁殖(如，在感染前），但是可选地包含如胰蛋白酶或可能为病毒生长所需的其他蛋白酶之 类的蛋白。
[0052] 在病毒复制期间，支持病毒复制的细胞系以在37°C以下培养为佳[55](例如30-36 °C，或约30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C)。
[0053] 在培养的细胞内扩增流感病毒的方法通常包括:用待生长的毒株接种物接种细胞 培养物，将被感染的细胞培养一段所需时间来扩增病毒，例如根据病毒滴度或抗原表达情 况确定培养时间（例如接种后24到168小时），以及收集扩增的病毒。以1: 500到1:1的病毒 (根据PFU或TCID5Q测定）：细胞比接种培养的细胞，优选1:100到1: 5，更优选1:50到1:10。将 病毒加到细胞悬液中或细胞单层上，在25 °C到40 °C、优选28 °C到37 °C，让病毒吸附到细胞 上，历时至少60分钟，但是一般不超过300分钟，优选90到240分钟。可通过冻融或通过酶作 用分离感染的细胞培养物(例如细胞单层），以增加收获的培养物上清中的病毒含量。然后 对收获的液体进行灭活或冻存。培养细胞按约0.0001到10的感染复数（"m.o.i. "）感染，优 选约0.002到5,更优选0.001到2。更优选的是，细胞按约0.01的m.o.i.感染。可在感染后30 到60小时收获被感染的细胞。优选在感染后34到48小时收获细胞。更优选在感染后38到40 小时收获细胞。通常在细胞培养期间添加蛋白酶(一般是胰蛋白酶）以使病毒释放。可在培 养期间任何合适的阶段添加蛋白酶，例如，在接种前，在接种的同时或接种后[55]。
[0054]在一些实施方式中，特别是采用MDCK细胞的实施方式中，细胞系从主工作细胞库 传代的群体倍增水平不超过40。
[0055]病毒接种物和病毒培养物最好不含（即，已检测污染且污染检测结果呈阴性)单纯 疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多 瘤病毒、双核糖核酸病毒、环状构象病毒和/或细小病毒[56]。特别好的是不含单纯疱疹病 毒。
[0056] 宿主细胞DNA
[0057] 如病毒已在细胞系上生长，那么尽可能减少最后疫苗内残存细胞系DNA就是标准 操作，这是为了尽可能消除该DNA的致瘤性。
[0058]因此，根据本发明制备的疫苗组合物优选每个剂量包含10ng以下(优选lng以下， 更优选l〇〇pg以下）的残存宿主细胞DNA，但仍可能存在痕量的宿主细胞DNA。
[0059] 优选的是包含<10ng(例如，<lng，〈100pg)宿主细胞DNA/15yg血凝素的疫苗，以及 包含<10ng(例如，<lng，〈100pg)宿主细胞DNA/0.25ml体积的疫苗。更好的是包含<10ng(例 如，<lng，〈100pg)宿主细胞DNA/50yg血凝素的疫苗，以及包含<10ng(例如，<lng，〈100pg)宿 主细胞DNA/0.5ml体积的疫苗。
[0000] 较好的是，任何残存宿主细胞DNA的平均长度小于500bp，例如，小于400bp、小于 300bp、小于200bp、小于 100bp等。
[0061 ]污染性DNA可在疫苗制备过程中通过标准纯化方法去除，例如，色谱法等。核酸酶 处理，例如DNA酶处理，可提高残存宿主细胞DNA的清除率。降低宿主细胞DNA污染的合适方 法可见参考文献57和58，包括两步处理，第一步使用DNA酶(例如，Benzonase)，可在病毒生 长期使用，然后用阳离子去污剂(例如，CTAB)，可在病毒粒子裂解过程中使用。也可以采用 丙内酯处理进行去除。
[0062]测定残存宿主细胞DNA现在是生物制品的常规法定要求，也是本领域技术人员常 规技术之一。用于测定DNA的方法通常是经验证的实验[59,60]。一项经验证的实验其性能 特征可以数学和定量术语来描述，其可能的误差原因应是已知的。这样的实验通常已就诸 如精度、准度、特异性等特征经过了测试。待一项实验经过校准(例如，用已知标准量的宿主 细胞DNA校准)并测试后，就可进行常规的定量DNA测定。有三种主要的DNA定量测定技术可 以使用：杂交方法，如DNA印迹(Southern Blots)或狭缝印迹(Slot Blots) [61];免疫测定 方法，如Threshold?系统[62];以及定量PCR[63]。这些方法都是本领域技术人员熟知的，但 每一种方法的精准度可能与待测的宿主细胞有关，例如，杂交探针的选择、扩增用的引物 和/或探针的选择等。Molecular Devices的Threshold?系统是一种可测定pg级总DNA的定 量分析方法，已被用于检测生物药物的污染D N A水平[6 2 ]。典型的实验包括生物素化的 ssDNA结合蛋白、尿素酶结合的抗ssDNA抗体和DNA之间非序列特异性地形成反应复合物。所 有检测组分都包括在厂家生产的完整总DNA分析试剂盒内。许多商业制造商都提供用于检 测残存宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTec?实验室服务公司（AppT ec?Lab〇rat〇ry Services)、BR公司（BioReliance?)、阿尔泰技术公司(Althea Technologies)等。参考文献 64对用于测定人病毒疫苗内宿主细胞DNA污染的化学发光杂交分析和总DNA Threshold?系 统进行了比较。
[0063]药用组合物
[0064]本发明使用的疫苗通常除流感病毒外还包含其它组分，如它们通常包含一种或多 种药用载体和/或赋形剂。有关这些组分的全面讨论可参见参考文献65。在许多实施方式 中，还可包含佐剂。
[0065]组合物在给药时通常为水溶液形式。
[0066]组合物可包含防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。但在一些实施方式中，与 PREPANDRIX?产品不同，疫苗应基本上不含含汞物质，例如不含硫柳汞[8,66]。不含汞的疫 苗是更优选的。不含防腐剂的疫苗是特别优选的。α-生育酚琥珀酸盐可作为汞化合物的替 代物[8]。特别优选的是不含防腐剂的疫苗。
[0067] 为了控制渗透压（tonicity)，优选包含生理盐，如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓 度可为1到20mg/ml。其他可以使用的盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和/或氯化镁 等。在佐剂与抗原分开存在于不同容器时，氯化钠可存在于两个容器中。
[0068] 组合物的渗透压通常为200m0sm/kg到400m0sm/kg，优选240-360m0sm/kg，更优选 290-310m0sm/kg〇
[0069] 本发明组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括:磷酸盐缓冲剂;Tris 缓冲剂;硼酸盐缓冲剂;琥珀酸盐缓冲剂;组氨酸缓冲剂(特别是与氢氧化铝佐剂一起）；或 者柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂的使用浓度一般为5_20mM。
[0070] 组合物的pH-般在5.0到8.1之间，更常见的是在6.0到8.0之间，例如6.5-7.5或 7.0-7.8。
[0071] 组合物最好是无菌的。组合物最好是无热原的，例如，每剂EU(内毒素单位，标准计 量)〈1，每剂EU优选〈0.1。组合物优选不含谷蛋白。
[0072] 本发明的组合物，特别是裂解疫苗或表面抗原疫苗，可包含去污剂，例如，聚氧乙 烯脱水山梨酯表面活性剂(被称为"吐温"）、辛苯聚醇(如辛苯聚醇_9(曲通X-100)或叔辛基 苯氧聚乙氧基乙醇）、溴化十六烷基三甲胺（"CTAB"）或脱氧胆酸钠。去污剂可以只以痕量存 在。因此，疫苗可包含含量各低于lmg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。其它痕量存在的 残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素 B)。在佐剂与抗原分开保存在不 同容器时，去污剂通常存在于含有抗原的容器中（如抗原与聚山梨醇酯80和辛苯聚醇-10在 一起)。
[0073] 组合物可包含用于单次免疫的材料，或者包含用于多次免疫的材料（即，"多剂量" 药盒）。多剂量组合物中优选包含防腐剂。作为多剂量组合物包含防腐剂的替代手段，或者 在包含防腐剂以外，可以将组合物装在带有用于取用材料的无菌接配器的容器内。
[0074]人流感病毒疫苗通常以约0.5mL的单位剂量体积通过肌肉内注射给药。但在本发 明的一些实施方式中，可使用该体积一半的单位剂量(即，约0.25ml)。此减少的剂量体积特 别可给予儿童。还可使用更低的剂量(如0.1ml或0.2ml)，例如用于皮内注射。
[0075]优选将疫苗存放在2°C到8°C。它们不应被冷冻。理想的是避免光线直接照射。
[0076]可以各种合适的容器提供疫苗，疫苗可被配制成立即可用的，或者为给药前临时 混合的试剂盒的一部分，如分开的抗原和佐剂组分(如PREPANDRIX?产品中的那样）。合适的 容器包括小瓶、注射器(如一次性注射器）、鼻喷雾器等。这些容器应无菌。如果将组合物/组 分存于小瓶中，所述小瓶优选由玻璃或塑料材料制成。优选先将小瓶灭菌再加入组合物。为 避免患者对乳胶过敏的问题，优选用无乳胶的塞子密封小瓶，优选所有包装材料均不含乳 胶。小瓶可装有单剂量疫苗，或可装有一剂量以上（"多剂量"小瓶），例如10剂量。优选用无 色玻璃制成小瓶。小瓶可装有盖子(例如，Luer锁扣），该盖子适于将注射器插入其中。小瓶， 尤其是多剂量小瓶，可具有允许无菌取出其内容物的盖子。如果组分包装在注射器中，注射 器可装有针头。如果未装针头，可随注射器提供单独的针头用于装配和使用。这种针头可以 是有鞘的。优选安全针头。常见的是1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头。注射器可装 有可剥离标签，其上打印了批号、流感季节和内含物的有效期，从而有助于记录保管。注射 器的柱塞优选具有限位器，从而能防止柱塞在抽吸期间意外掉出。注射器可装有乳胶橡胶 盖子和/或柱塞。一次性注射器含有单剂量疫苗。在装上针头之前，注射器一般装有针帽以 密封顶端，所述针帽优选由丁基橡胶制成。
[0077] 可给容器做上显示半剂量体积的标记，例如以有助于递送给儿童。例如，含有 0.5ml剂量的注射器可具有显示0.25ml体积的标记。因此，可以0.5ml的单位剂量体积包装 疫苗，但疫苗可以0.25ml的定量剂量体积给予，容器上的标记有助于这种半剂量给药。
[0078] 如果使用玻璃容器(例如，