一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法及疫苗制品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法及疫苗制品，属于兽药生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病（Pseudoraties，Pr)，是由疱疹病毒科猪疱疹病毒I型伪狂犬病病毒引 起多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是该病毒的自然宿主和储存者，仔猪和 其他易感动物多为急性致死性症状，具有明显的神经症状、死亡率尚达100% ;成年猪多为 隐性感染，表现为繁殖障碍与呼吸道症状。疫苗免疫是防制伪狂犬病的主要措施。
[0003] 2013年广东、江西、河南、山西、湖南等地猪场都在免疫伪狂犬疫苗后仍出现猪伪 狂犬病部分流行案例，2014伪狂犬病在河北、河南、湖北等地的一些猪场暴发流行，给发病 猪场带来巨大的损失，说明现有商品化的伪狂犬疫苗已不能对市场流行毒株起到很好的保 护。其原因主要在于，伪狂犬灭活疫苗由于其在免疫动物体内无法繁殖，需要较高的抗原 量，而现有技术的抗原量较低（l(f°TCID 5Q/0. lml)，如采用浓缩方法虽能提高抗原量，但也 会增加杂蛋白量，增加了疫苗的副反应。因此，急需攻克制备高滴度的猪伪狂犬病病毒疫苗 的技术难题。
[0004] 目前商品化猪伪狂犬病病毒疫苗的制备工艺主要采用转瓶培养工艺，即将伪狂犬 病病毒接入已经贴壁的传代细胞或原代细胞，培养一段时间后收获病毒液。如专利申请 CN101695573A公开了一种利用传代细胞生产伪狂犬病病毒疫苗的方法，利用传统的转瓶生 产工艺，用ST、PK15和IBRS-2传代细胞来繁殖伪狂犬病病毒。但由于转瓶培养工艺中，每 个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒产量和病毒滴度都不相同，导致疫 苗批间差异大；转瓶操作暴露点多，容易造成污染或隐性污染而引起病毒液报废；且操作 劳动强度大，生产效率低，已不适合当前疫苗大规模生产的要求。
[0005] 在伪狂犬病病毒大规模培养方面，还有关于利用微载体进行生物反应器培养伪狂 犬病病毒的报道。专利申请CN101695572A公开了一种利用TideCell固定床微载体生物反 应器生产伪狂犬疫苗的方法；专利申请CN102038946A公开了 一种利用微载体培养搅拌式 的生物反应器生产伪狂犬疫苗的方法。但是上述方法，均需借助价格昂贵的微载体才能进 行细胞悬浮培养，生产成本相对较高；借助微载体培养时，需使用胰酶消化，消化后细胞利 用率低，生产工艺复杂。
[0006] 因此研制一种工艺简单稳定、批间差异小、生广效率尚、并能制备尚含量的病毒的 猪伪狂犬病病毒疫苗的生产方法具有重要的意义。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法及 使用本发明所述方法制备的伪狂犬病病毒疫苗。
[0008] 本发明的第一方面是一种应用生物反应器不依赖微载体制备猪伪狂犬病病毒疫 苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0009] (1)制备悬浮传代细胞；
[0010] (2)扩增培养所述步骤（1)制备的悬浮传代细胞；以及
[0011] ⑶在所述步骤⑵扩增培养后的悬浮传代细胞接种伪狂犬病病毒，扩增培养伪 狂犬病病毒。
[0012] 作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤（a)中所述的传代细胞系为BHK-21细 胞，来源于美国典型培养物典藏中心（ATCC)，保藏号为：CCL-10 ;
[0013] 所述伪狂犬病病毒毒株优选猪伪狂犬变异株及其基因缺失株。
[0014] 术语"猪伪狂犬变异株"也称为高致病性猪伪狂犬毒株，是指：表现为任何年龄的 猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短（1~2天），发病率在10%~100%之间，发病 猪死亡率在10%~100%之间（仔猪死亡率可高达1〇〇%)，感染后可引起猪只高热（40~ 42°C，持续3日以上），呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流 产（高达35%)，早产，死胎，弱仔（弱仔14日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状。
[0015] 最优选地，所述伪狂犬病病毒毒株包括伪狂犬变异株及其基因缺失株，所述伪狂 犬变异株包括但不限于猪伪狂犬病病毒HN1201株（Pseudorabies virus, strain HN1201)， 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. V 201311，保藏地址为中国武汉?武 汉大学，保藏日期为2013年5月20日JS-2012株，公开于童武，张青占，郑浩等，免疫 后发病仔猪中伪狂犬病病毒的分离和鉴定[J].中国动物传染病学报2013, 21 (3):1-7); 猪伪狂犬HeNl株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号 为 CGMCCN0. 6656，公开于专利申请 CN102994458A ;NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株 和 NVDC-PRV-SD 株，公开于文献 Xiuling Yu, Zhi Zhou, Dongmei Hu, et al. Pathogenic PseudorabiesVirus, China, 2012EmergingInfectious Diseases, www.cdc.gov/eid ol. 20, No. 1，January 2014);猪伪狂犬病病毒 HN1202 株（Pseudorabies virus, strain HN1202)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. V 201335,保藏地址为中国 武汉?武汉大学，保藏日期为2013年8月26日；PRV TJ strain (PRV TJ)株，公开于文献 China Chun-Hua Wang Jin Yuan, Hua-Yang Qin,et al，A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variantemerging in Bartha-K61_vaccinated swine population in China Vaccine 32 (2014) 3379 - 3385 ;猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCCNo. 8170,公开 于专利申请CN103627678A ;
[0016] 所述伪狂犬变异株的基因缺失株包括但不限于缺失gE基因的猪伪狂犬病HN1201 株，公开于中国专利申请CN103923884A ;猪伪狂犬病gE和gl基因缺失病毒株PRV-ZJ011G 株，保藏号为CGMCCNo. 7957,公开于中国专利申请CN103756977A ;猪伪狂犬病gE基因缺失 株，保藏号为CGMCC N0. 6657,公开于中国专利申请CN102994458A。
[0017] 作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤（2)中扩增培养悬浮传代细胞采用不 需胰酶消化，直接添加新鲜培养基稀释的连续放大方式培养，所述连续放大方式中单次培 养前悬浮传代细胞浓度为〇. 2 X 106个/ml~2 X 10 6个/ml，所述单次培养过程至悬浮传代 细胞浓度为1X 1〇6个/ml~10 X 10 6个/ml时结束。
[0018] 作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤（2)中扩增培养悬浮传代细胞采用连 续放大方式培养，所述连续放大方式中单次培养前悬浮传代细胞浓度为0. 6 X 106个/ml~ 1 X 106个/ml，所述单次培养过程至悬浮传代细胞浓度为3X 10 6~6X 10 6个/ml时结束。 最优选地，所述步骤（2)中扩增培养悬浮传代细胞采用连续放大方式培养，所述连续放大 方式中单次培养前悬浮传代细胞浓度为0. 6 X 106个/ml~1 X 10 6个/ml，所述单次培养过 程至悬浮传代细胞浓度为3. 4 X 106~4 X 10 6个/ml时结束。
[0019] 作为本发明的一种优选实施方