式，所述步骤（1)中所述传代细胞于方瓶中静止培 养，培养2~4d后收集液体中漂浮的活细胞；
[0020] 作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤（1)中所述传代细胞静止培养时使用 的培养基为无血清培养基，包括但不限于北京清大天一科技有限公司的BHK21无血清培养 基，货号为SAF200 ;北京赛百泰生物技术有限公司的BHK21无血清培养基，货号为SFM-10 ; 倍进的 BS-SFM，货号为 BSS20310，Gibco 公司的 VP-SFM AGTTM，货号为 12559-019 ;Gibco 公 司的CD BHK-21，货号为A1627701 ;Hylcon公司的SFM4MegaVir，货号为SH30587 ;默克公司 的 Cellvento? BHK-200,货号为 FC00408。
[0021] 作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤（2)中用摇瓶或磁力搅拌瓶培养悬浮 传代细胞，所述摇瓶培养的条件为5% C02, 37°C，90~lOOrpm，所述磁力搅拌瓶培养的条件 为 5% C02,37°C，30rpm。
[0022] 作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤（2)中用生物反应器培养悬浮传代细 胞，所述生物反应器培养参数为pH 7.0~7. 4,温度为36~38 °C，溶氧（Do)为30 %~ 60 %，揽摔速度为50rpm~lOOrpm。
[0023] 作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤（3)中所述伪狂犬病病毒接毒剂量为 0. 0005~5M. 0.1 ，优选为0. 005~0. 5M. 0.1 ;在所述伪狂犬病病毒接种24h~72h后（或 细胞活率降至80%以下时）收获病毒液。
[0024] 作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤（2)中采用直接添加新鲜培养基稀释 的连续放大方式扩增培养悬浮传代细胞，所述连续放大方式为灌流和流加连续培养。
[0025] 本发明的另一方面是一种使用本发明所述方法制备的伪狂犬病病毒疫苗。
[0026] 作为本发明的一种优选实施方式，所述猪伪狂犬病病毒疫苗含量为灭活前 10ia(]TCID 5Q/ml。。
[0027] 基于此，本发明的突出优点在于：
[0028] (1)本方法采用生物反应器大规模纯悬浮培养流行毒株伪狂犬病病毒，简化了生 产工艺，减少了人力、物力的投入，降低了成本；
[0029] (2)用此方法培养的纯悬浮BHK-21细胞生产伪狂犬病病毒细胞放大容易，单批产 量大，批间差异小，产品质量稳定；
[0030] (3)用此方法培养的纯悬浮BHK-21细胞生产伪狂犬病病毒，病毒含量高；
[0031] (4)用此方法生产的伪狂犬病病毒疫苗对市场流行的高致病性伪狂犬毒株的攻 击，能起到很好的保护，养殖场免疫后能降低伪狂犬病造成的经济损失。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0033] 以下实施例中，所述BHK-21细胞，来源于美国典型培养物典藏中心（ATCC)，保藏 号为：CCL-10 ;
[0034] 所述高致病性伪狂犬病病毒毒株为猪伪狂犬病病毒PRV HN1201株，来源于中国典 型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. V 201311。
[0035] 实施例1 一种制备伪狂犬病病毒疫苗的方法
[0036] 1.按照Cellvento? BHK-200无血清细胞培养基（默克，FC00408)说明书配 制BHK-21悬浮细胞用培养基，在容器中加入注射用水至总体积的90%，将一袋培养基 (2. 16g)全部倒入容器中，轻微搅拌溶解，按照2g/L的重量体积比加入碳酸氢钠，轻微搅拌 后加注射用水至1L，用lmol/L的氢氧化钠或lmol/L的盐酸调pH值至7. 2,用0· 1 μ m滤膜 正压过滤除菌。
[0037] 2.复苏液氮中冻存的BHK-21传代细胞系于底面积为75cm2的方瓶中静止培养， BHK-21悬浮细胞用培养基的添加量为20ml。
[0038] 3.培养3d后收集液体中漂浮的活细胞于100ml摇瓶中培养，在37°C，5% C02， llOrpm的摇床中培养。
[0039] 4.待摇瓶中BHK-21细胞浓度达4X 106个/ml左右时，加入新鲜培养基对摇瓶中 细胞进行稀释，并转移到其他摇瓶中，使细胞终浓度为1X 1〇6个/ml。
[0040] 5.收集摇瓶中培养72h的悬浮BHK-21细胞，使细胞总数在3 X 101°个左右，将细 胞转移至NBS 51040L生物反应器，然后添加新鲜培养基至30L，使细胞终浓度为1 X 106个 /ml。生物反应器培养参数为pH 7. 2,温度为37°C，溶氧（Do)为60%，搅拌速度为80rpm。
[0041] 6.细胞在生物反应器培养48h后按照0. 5M. 0.1 接种伪狂犬病病毒，病毒接种后观 察细胞活率，当细胞活率降至80%以下时开始收获病毒液。
[0042] 7.对收获的病毒液进行病毒含量测定（半数组织感染量）与细菌、支原体和外源 病毒检验，病毒含量为l〇 ia°TCIDM/ml，并且纯净性检验合格。
[0043] 8.对收获检验合格的病毒液经过滤、横向切留超滤处理去除细胞碎片及部分杂 蛋白，即制得病毒液。然后加入终浓度0.2%甲醛灭活剂灭活，然后将灭活后的病毒液置 于-20°C冷冻保存备用。
[0044] 9.PRV抗原的灭活检验，灭活后，无菌从病毒灭活液中取样，接种培养24h的 BHK-21细胞，培养120h无细胞病变后方可用于配苗。
[0045] 10.伪狂犬病病毒疫苗的制备，取检验合格的PRV灭活后的病毒液与206佐剂以 1:1的体积比混合，搅拌、分装即制备PRV灭活疫苗。
[0046] 上述实施例中，步骤（8)所述的灭活剂选择二乙烯亚胺和β丙内酯同样能达到相 同的灭活效果。
[0047] 上述实施例中，选择北京赛百泰生物技术有限公司的ΒΗΚ21无血清培养基，货 号为SFM-10 ;倍进的BS-SFM，货号为BSS20310, Gibco公司的VP-SFM AGTTM，货号为 12559-019 ;Gibco 公司的 CD BHK-21，货号为 A1627701 ;Hylcone 公司的 SFM4MegaVir，货号 为SH30587的无血清培养基也可达到一样的病毒含量。
[0048] 实施例2利用生物反应器悬浮BHK-21细胞在生物反应器连续放大
[0049] 1.在NBS Cellgenll53L生物反应器中，按实施例1步骤1~3制备的悬浮BHK-21 细胞，取1个装量为250ml细胞的摇瓶，计数后取1. 2 X 109个转移至生物反应器中，并补加 培养基至1. 2L，使细胞终浓度为1 X 106个/ml。其中所述生物反应器培养参数为pH 7. 2， 温度为37°C，溶氧（Do)为60%，搅拌速度为80r pm，所述培养基为Cellvento? BHK-200无 血清细胞培养基（默克，FC00408)。
[0050] 2.每日从生物反应器中取出细胞悬浮液，台盼蓝染色后进行计数，培养3~4d当 细胞浓度约4X 106个/ml时，用于进一步放大。
[0051] 3.不用胰酶，直接将细胞收集瓶和生物反应器通过管道连接，通过通气的压力，直 接将细胞悬液打入细胞收集瓶中。
[0052] 4.将收集的细胞通过管道直接连接更大规格的生物反应器NBS Cellgen31010L， 补加体积至10L，使终浓度为1 X 106个/ml。生物反应器培养参数为pH 7. 2,温度为37 °C， 溶氧（Do)为60 %，搅拌速度为80r pm。
[0053] 5.每日从10L生物反应器中取出细胞悬浮液，台盼蓝染色后进行计数，培养3~ 4d当细胞浓度约4X 106个/ml