一种重组人透明质酸酶冻干制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于制剂领域，涉及一种重组人透明质酸酶冻干制剂及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 透明质酸(hyaluronic acid，HA)又称糖醛酸、玻璃酸或玻尿酸，是由D-葡萄糖醛 酸及N-乙酰葡糖胺两个双糖单位重复连接组成的直链高分子糖胺多聚糖，广泛地存在于脊 椎动物的结缔组织、粘液组织、眼球之晶状体及皮肤中，在胚胎、软骨、滑液、玻璃体、脐带、 鸡冠等组织中尤为丰富。透明质酸是人体组织基质中分布最广的一种酸性黏多糖，在体内 具有多种功能，如构成多种基质、限制水分及其它细胞外物质扩散的作用，调节渗透压，调 控大分子物质转运，在细胞周围形成物理屏障等。由于透明质酸在体内通过形成网状屏障 填充在胞外基质胶原蛋白纤维骨架之间，限制了药物大分子物质的皮下扩散，降低药物到 达血管的速度，且限制皮下注射的液体体积。
[0003] 透明质酸酶(115^1111'0111(^86，说386)，也称玻璃酸酶，是一种能够特异性水解透明 质酸、从而提高组织中液体渗透能力的蛋白内切酶，在体内广泛分布于血清、脑和胎盘等组 织和体液中。通过断裂葡糖胺的C1和葡萄糖醛酸C4间的葡糖酸键对透明质酸水解，暂时降 低细胞间质的粘度，促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收。
[0004] 透明质酸酶于1928年被发现，1940年研究确定命名，1948年即被FDA批准在美国上 市，作为扩散剂与其他药物合用。2001年，FDA将透明质酸酶列为短缺药品。2004年，FDA批准 了两种透明质酸酶制剂一ISTA Pharmaceuticals公司的羊型透明质酸酶(Vitrase)和 Amphastar Pharmaceuticals公司的牛型透明质酸酶(Amphadase)。2005年底，FDA又批准了 2种新型透明质酸酶制剂的上市申请，即Pr imaPharm公司研制的纯化牛睾丸透明质酸酶 (Hydase)和Halozyme制药有限公司与百特(Baxter)公司共同研制的重组人透明质酸酶 (Hylenex)。在获批的五种透明质酸酶中，仅有Hylenex为基因工程重组的人源性透明质酸 酶，其他四种均为动物来源的提取产品。由于众所周知的原料来源问题及动物污染风险等 原因，三种动物来源的产品先后停产。目前市售产品仅剩下羊型透明质酸酶Vitrase和重组 人透明质酸酶Hylenex两种。
[0005] 美国Halozyme公司的重组人透明质酸酶Hylenex是采用重组DNA技术在CH0细胞中 高效表达，高度纯化后获得的产品，具有纯度高，免疫原性低等优点，因此快速取代动物提 取的透明质酸酶而广泛应用。临床上透明质酸酶与其他注射药物合用，增加后者的吸收和 分散，可用于皮下输液，促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散以及皮下尿道造影术之中 (改善造影剂硫酸钡的再吸收）。透明质酸酶还常与局麻药在眼科手术时合用，加快麻醉药 的起效速度。此外，全球生物制药巨头如罗氏、强生等公司将重组人透明质酸酶Hylenex和 其旗下的数个全球销量超过50亿美金的抗体产品联用于肿瘤治疗，将昂贵的抗体给药方式 由传统的静脉输液替换为皮下注射，极大的简化了肿瘤病人的治疗方案，大幅降低病人和 医疗系统的费用支出。
[0006] 市场上广泛使用的透明质酸酶是一种液体制剂，液体制剂有效成分为重组人透明 质酸酶，其余成分为每毫升8.5mg氯化钠，1.4mg磷酸氢二钠，lmg人血白蛋白，1.5mg L-甲硫 氨酸，0.2mg吐温80，产品的货架期为24个月。该制剂的缺点在于透明质酸酶在液体制剂中 活性稳定性较差，运输，仓储，使用均不方便。更重要的为了维持酶的活性，液体制剂中使用 了人血白蛋白，人血白蛋白不仅成本高且来源于血浆，被病原体感染的风险高。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组人透明质酸酶冻干制剂及 其制备方法和应用。
[0008] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] -方面，本发明提供一种重组人透明质酸酶冻干制剂，所述重组人透明质酸酶冻 干制剂以10000支计算，包含如下组分：
[0010] 重组人透明质酸酶 1400000~500000000IU 缓冲剂 5~1:0 g 冷冻保护剤 60~180 g 赋形剂 1節~3W g 酶活保护剂 5~12g 表面活性剂 0.3~5 g。
[0011] 在本发明的重组人透明质酸酶冻干制剂中，以10000支计算，包含重组人透明质酸 酶 1400000 ~500000000IU，例如 1400000IU、1500000IU、1800000IU、1700000IU、1800000IU、 1900000IU、2000000IU、3000000IU、5000000IU、8000000IU、10000000IU、50000000IU、 80000000IU、100000000IU、300000000IU或500000000IU。
[0012] 在本发明的重组人透明质酸酶冻干制剂中，以10000支计算，包含缓冲剂5~10g， 例如5g、5 · 3g、5 · 5g、5 · 8g、6g、6.3g、6 · 5g、6.8g、7g、7 · 2g、7 · 5g、7 · 8g、8g、8 · 3g、8.5g、8.8g、 9g、9.2g、9.5g、9.8gSl0g。
[0013] 在本发明的重组人透明质酸酶冻干制剂中，以10000支计算，包含冷冻保护剂60~ 180gJ^|^n60g、65g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g、150g、160g、170gSl80g。
[0014] 在本发明的重组人透明质酸酶冻干制剂中，以10000支计算，包含赋形剂180~ 300gjl^ni80g、185g、190g、195g、200g、210g、220g、230g、240g、250g、260g、270g、280g、 290g或300g。
[0015] 在本发明的重组人透明质酸酶冻干制剂中，以10000支计算，包含酶活保护剂5~ 12gj|^n5g、6g、7g、8g、9g、10g、llgSl2g。
[0016] 在本发明的重组人透明质酸酶冻干制剂中，以10000支计算，包含表面活性剂0.3 ~5gjl^n0.3g、0.4g、0.5g、0.7g、0.9g、lg、1.3g、1.5g、1.8g、2g、2.2g、2.5g、2.8gS3g。
[0017] 优选地，在本发明中，所述重组人透明质酸酶通过CH0表达的细胞上清液纯化得 到。
[0018] 优选地，所述重组人透明质酸酶纯度>95%，比活大于100000IU/mg。
[0019] 在本发明中，所述缓冲剂为磷酸盐缓冲液。
[0020] 优选地，所述冷冻保护剂为蔗糖、海藻糖、麦芽糖或乳糖中的任意一种或至少两种 的组合，优选为蔗糖和/或海藻糖。
[0021 ]优选地，所述赋形剂为甘露醇和/或甘氨酸，优选为甘露醇。
[0022]优选地，所述酶活保护剂为氯化钠、氯化钙或乙二胺四乙酸二钠中的任意一种或 至少两种的组合，优选为氯化钙和乙二胺四乙酸二钠的组合。
[0023] 优选地，以10000支计算，所述重组人透明质酸酶冻干制剂中氯化钙的含量为1.2-2.48，例如1.28、1.38、1.58、1.78、1.98、28、2.18、2.28、2.38或2.4 8，乙二胺四乙酸二钠含 量为 4.8_6.0gj|^n4.8g、4.9g、5g、5.2g、5.4g、5.6g、5.8g、5.9gS6g。
[0024] 优选地，所述表面活性剂为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或Triton X-100中的任 意一种或至少两种的组合，优选为聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80。
[0025] 优选地，所述冻干制剂用注射用水溶解后，用于皮下或者静脉注射。
[0026] 另一方面，本发明提供了如第一方面所述的重组人透明质酸酶冻干制剂的制备方 法，所述方法包括以下步骤：
[0027] A、重组人透明质酸酶、缓冲剂、冷冻保护剂、赋形剂、酶活保护剂和表面活性剂加 入至水中混合均匀，制备得到重组人透明质酸酶液体制剂；
[0028] B、将步骤A得到的重组人透明质酸酶液体制剂进行分装，分装后的制剂冷冻干燥 得到重组人透明质酸酶冻干制剂。
[0029]优选地，所述冷冻干燥过程为：
[0030] (1)在-2Γ ~-8Γ环境下，例如在-2Γ、-3 Γ、-4Γ、-5Γ、-6Γ、-7Γ或-8Γ，预冻 0.5~lhj|^n0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9hSlh;
[0031] (2)在-35Γ ~_4(TC 环境下，例如在 _35。(：、-36。(：、-37。(：、-38。(：、-39。(：或-40。(：，预 冻2 ~4h，例如 2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h、3.3h、3.5h、3.7h、3.9hS4h;
[0032] (3)在-15Γ ~-3(TC，例如-20Γ、-2Γ(：、-22Γ、-23Γ、-24Γ、-25Γ、-26Γ、-27 °C、-28°C、-29°C或-3CTC，10~20mbar环境下，例如lOmbar、1 lmbar、12mbar、13mbar、 14mbar、15mbar、16mbar、17mbar、18mbar、19mbar 或 20mbar，干燥 15~25h，例如 15h、16h、 17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24hS25h;
[0033] (4)在-5Γ ~1(TC，例如-5Γ、-4Γ、-3Γ、-2Γ、-Γ(：、(Τ(：、Γ(：、2Γ、3Γ、4Γ、5Γ、 6°C、7°C、8°C、9°C或 10°C，10~20mbar环境下，例如lOmbar、1 lmbar、12mbar、13mbar、 14mbar、15mbar、16mbar、17mbar、18mbar、19mbar 或 20mbar，干燥0 · 5 ~3h，例如0 · 5h、0 · 7h、 0.9h、lh、1.3h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8hS3h;
[0034] (5)在15Γ ~3(TC，例如15Γ、16Γ、17Γ、18Γ、1%~、20Γ、22Γ、24Γ、26Γ、28 °C、29°C或3CTC，10~20mbar环境下，例如lOmbar、llmbar、12mbar、13mbar、14mbar、15mbar、 1611^&1'、1711^&1'、1811^&1'、1911^&1'或2〇11^&1'，干燥5~15]1，例如5]1、6]1、7]1、8]1、9]1、1〇]1、11]1、 12h、13h、14h或15h。
[0035] 另一方面，本发明提供了所述重组人透明质酸酶冻干制剂在制备促进手术及创伤 后局部水肿或血肿消散、促进局麻药的浸润、减轻注射部位的疼痛或者加速皮下注射或