一种海洋生物抗菌肽的应用及含有其的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有抗菌活性的多肽的应用;本发明还涉及含有其的药物组合物 以及杀灭VBNC状态微生物的方法。
【背景技术】
[0002] VBNC(活的但不可培养的微生物（viable but non-culturable state，VBNC))状 态细菌是指原来可进行培养的微生物在不良外界环境的胁迫下进入了的一个休眠时期，用 常规方法培养时，不能繁殖，但仍然具有新陈代谢活性的一种特殊存在形式，并在一定的环 境条件下可以复苏，即可以恢复到用常规方法培养的状态。VBNC状态菌因特定的自我保护 机制使其能够在不利环境条件下继续存活较长时间，细菌的这种特殊VBNC状态存活形式成 为环境中病原体的重要组成部分。这对于细菌本身来说是非常有利的，但是对公共卫生却 具有极大威胁，因为进入VBNC状态的细菌会保留若干毒力因素和潜在的毒力，且一旦复苏 便具有感染性。食品工业质量监测样本和水分配系统，或临床样本检测也会低估评估风险 或检测不到该状态的活细胞，这无疑又增加了一层安全隐患。VBNC状态的细菌因其具有不 可培养的特点，不但可逃避传统检测方法的检测，还对多种理化因子包括抗生素产生抗性， 并在适当的条件下可复苏，进而成为疫病发生的源头。因此，VBNC状态细菌是极大的公共卫 生安全隐患，找到一种能够安全、高效杀灭VBNC状态细菌的方法意义重大。
[0003] 抗微生物多肽又称为抗菌肽(Antimicmbial peptides，AMPs)是生物体合成的一 类小分子防御多肽，是动物固有免疫系统的重要成员。继1972年瑞典科学家Boman等首先在 果绳中发现抗菌肽及其具有免疫功能（Boman HG,Nilsson I，Rasmuson B. Inducible antibacterial defence system in Drosophila.Nature, 1972,237:232-235)，随后众多 研究者先后从细菌、真菌、高等植物、无脊椎动物、脊椎动物乃至人体中发现并分离获得上 千种具有抗菌活性的多肽。
[0004] 抗菌肽的抑菌机制有桶-板模型（barrel stave model)、毯式模型（carpet model)及环状孔模型（toroidal pore model)，关键都是通过其阳离子性接近细胞膜，再以 其疏水性氨基酸插入生物膜，若浓度适宜或较高，形成跨膜通道或引起膜破碎，使细胞内物 质外泄和跨膜电势瓦解，从而导致细菌细胞裂解性的死亡;若抗菌肽浓度偏低时不足以裂 解性杀死病原体，则会有一部分抗菌肽进入细胞与胞内多聚阴离子(如DNA、蛋白质)结合而 抑制微生物的繁殖。抗菌肽的作用机制让细菌等微生物难有机会产生有抗性的突变性，即 不易产生耐药性。
[0005] 近年来研究发现，抗菌肽具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌均 有抑杀作用，还可以抗原虫、抗病毒以及杀伤动物体内的肿瘤细胞，使其最有可能替代抗生 素成为新一代相对安全的抗菌药物(Guani-Guerra E，Santos_Mendoza T，Lug〇-Reyes S0, Teran LM.Antimicrobial peptides:general overview and clinical implications in human health and disease.Clin.Immunol.,2010,135(1):1-11.；Lakshmaiah Narayana J,Chen JY.Antimicrobial peptides:Possible anti-infective agents·Peptides， 2015,72:88-94.)〇
[0006]美国学者Silphaduang和Noga从杂交条纹f卢（Morone saxatilia^XM. chrysops 早）的肥大细胞中分离出3条长为22aa的抗菌肽，分别命名为Piscidin-l，-2，-3(词源自 piscine-鱼的），N端富含Phe、Ile或His等氨基酸，C端多变(序列见图lhPiscidin是鱼类特 有的一个抗菌肽家族，为典型两亲性α螺旋构型阳离子肽。Piscidin家族成员对多种致病菌 包括多重耐药菌株格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)均有较强抑杀作用，而且对病毒、 真菌乃至寄生虫也均有抑制作用（Silphaduang U，Noga EJ.Peptide antibiotics in mast cells of fish.Nature ,2001,414(6861):268-269.；Silphaduang U,Colorni A, Noga EJ.Evidence for widespread distribution of piscidin antimicrobial peptides in teleost fish.Diseases of Aquatic Organisms,2006,72(3):241-252·)〇 如图1所示，斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)piscidin家族成员之一epinecidin-1的 完整序列是epinecidin-1 prepropeptide，共67aa，切除信号肽后为46aa，由于命名抗菌肽 piscidin的美国学者Si lphaduang等分离到的piscidin为22aa，人们推测石斑鱼抗菌肽 piscidin家族成员发挥抗菌作用的多肽可能为21aa，即切除信号肽后再去除C端25aa(见图 1 中的epinecidin-Ι )，21aa的epinecidin-1 (GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLV，以下称GV21)显示其 具有抗菌活性。近年来，国内外学者及发明人均在多种石斑鱼(Epinephelus sp.)体内发 现抗菌肽piscidin家族的成员（命名为epinecidin或piscidin) (Yin ZX,He W, Chen WJ, Yan JH,Yang JN,Chan SM,He JG.Cloning,expression and antimicrobial activity of an antimicrobial peptide,epinecidin-1,from the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides.Aquaculture,2006,253:204-211 ·;陈大玮，邓利，何凡，邱聪龄，马 一见，刘志刚.棕点石斑鱼piscidin抗菌肽基因的克隆及其成熟肽的原核表达.渔业科学进 展，2011 ,32(4):126-133.)。尚无证据显示pise id in家族基因是否与别的抗菌肽如 hepcidin家族类似，表达的氨基酸序列在切除信号肽后的prodomain还将切去部分片段以 释放成熟肽。
[0007]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡 萄球菌属，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。大肠杆菌(Escherichia coli)为 革兰氏阴性短杆菌，一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道 外感染，某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，引起严重腹泻和败血症。副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)，又称为肠炎弧菌，属于弧菌属，是一种常见的病原菌。肠炎弧 菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，主要的栖息地在海水中，是引起食物中毒的主要病原菌 之一，在沿海地区，每年都有相当多的病患因食用被肠炎弧菌污染的海产品而发生食物中 毒。
[0008] 这三种菌是临床及食品卫生中最常见的病原菌，而且这些细菌在环境胁迫下可进 入VBNC状态，进而对抗生素产生强耐药性，并在适当条件下可以复苏成为疫病发生的源头 之一，造成公共卫生安全隐患。
[0009] 目前，尚未见国内外有关安全、有效地杀灭VBNC状态细菌的方法的报道。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的在于提供一种多肽的抗菌和/或杀菌用途，所述多肽基于海洋 生物基因 Piscidin肽序列设计。所述多肽具有抑制或杀灭细菌特别是处于VBNC状态细胞的 效果。
[0011] 本发明的另一个目的在于提供含有所述多肽的具有抗菌活性的药物组合物。
[0012] 本发明的又一个目的在于提供一种杀灭处于VBNC状态的微生物的方法。
[0013] 根据本发明的一方面，具有抗菌活性的多肽（以下简称抗菌肽或GV46)，其氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。所述抗菌肽由46个氨基酸组成，序列来源于GenBank，登录号为 AY294407(Epinephelus coioides epinecidin-lprepropeptide mRNA,complete cds)，是 从斜带石斑鱼中克隆出的序列，推导的氨基酸序列为：
[0014] MRCIALFLVLSLVVLMAEPGEGFIFHIIKGLFHAGKMIHGLVTRRRHGVEELQDLDQRAFEREKAFA (下划线所示为预测的信号肽序列）。发明人从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)血衆中 鉴定出切除信号肽后的长度为46aa的piscidin多肽(GV46)，抑菌实验显示该多肽对大肠杆 菌、金黄色葡萄球菌和/或副溶血弧菌表现出明显的杀灭效果。更进一步的是，所述抗菌肽 对于处于呢1^(活的但不可培养的微生物(￥丨&1316 13111：11011-(31111：11瓜1316 8七&七6，￥1^(]))状 态的微生物显示出较强的杀灭效果，这些细菌包括但不限于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和/ 或副溶血弧菌。
[0015] 可以将本发明的多肽添加药学上可接受的各种添加剂和/或辅料制备成药物组合 物，所述药物组合物具有抗菌的效果，尤其是具有抑制或杀灭大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 和/或副溶血弧菌的效果，更进一步是对处于VBNC状态的上述细菌具有抑制或杀灭效果。
[0016] 根据本发明的再一方面，提供一种杀灭处于VBNC状态的微生物的方法，将所述处 于VBNC状态的微生物与所述的抗菌多肽接触。
[0017] 本发明的抗菌肽具有对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和/或副溶血弧菌较强的杀灭 效果，特别是针对处于VBNC状态的微生物显示出很强的杀灭效果。
【附图说明】
[0018] 图1是部分piscidin-样多肽氨基酸序列比对，epinecidin-lprepropeptide和 epinecidin-l (斜带石斑鱼（Epinephelus coioides)，Genbank登录号：AAQ57624); piscidin-1,2,3(条纹鱼卢鱼（Morone saxati 1 isc^XΜ· chrysops