专利名称：检测β-兴奋剂类药物的五联检测卡及其制备方法
技术领域：
本发明涉及β -肾上腺素受体激动剂检测技术领域，特别是涉及一种克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五联检测卡及其制备方法。
背景技术：
随着畜牧业规模化、商业化的发展，兽药和饲料添加剂在畜牧业生产中得到了广泛的应用，兽药广泛使用于各种疾病的有效控制，降低了动物死亡率；提高饲料转化率，提高了动物增重率和缩短了动物饲养周期，改善皮革质量，降低禁食胴体和动物组织废弃率；促进了动物源性产品产量的增长和动物集约化养殖的发展。现在的兽药不仅用来防治动物疾病，而且越来越多的药物用于促进生长，同步发情等非治疗用途，造成了更加严重的兽药残留问题。
近几年食品安全问题不断升级，“瘦肉精”在食用动物饲料中的滥用受到人们越来越高的重视，因为该兴奋剂残留于食品基质中，通过食物链进入人体后，会对人体健康造成极大的危害。“瘦肉精”是一类动物用药的统称。它作为一类化学用品，而不是一种特定的物质，是指能够促进瘦肉生长的药物添加剂。任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。目前，能够实现这种功能的物质是一类叫做β -兴奋剂(β-agonist)的药物，比如在中国造成中毒的克伦特罗(clenbuterol)和美国允许使用的莱克多巴胺(Ractopamine ),其他类似药物还有沙丁胺醇(SalbutamoI)和特布他林(Terbutal ine)等，以及去年饲料中从未出现过的苯乙醇胺A，这种瘦肉精新品种的出现，再次敲响了我国食品安全警钟。目前对于常见的兴奋剂克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林的检测主要有酶联免疫(ELISA)、气相色谱-质谱法(GC-MC)、高效液相色谱法(HPLC)等检测方法，但这些方法需要的设备昂贵，操作复杂，难于推广。因而有必要建立一种简便快捷、可靠，并且能同时检测这五种物质的检测方法，监控动物源性食品中的兽药残留，确保动物源性食品的安全。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能同时检测克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林的检测卡，适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉、结果准确的检测方法。本发明的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五联胶体金检测卡，由包被了克伦特罗单克隆抗体、莱克多巴胺单克隆抗体、沙丁胺醇单克隆抗体、苯乙醇胺A单克隆抗体和特布他林单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林共5种蛋白质偶联物和兔抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板及塑料模具等组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。本发明的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五联胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现
(1)胶体金溶液制备取IL三角烧瓶I个,加入超纯水495 mL，而后加入质量浓度为1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL,配制成500 mL质量浓度为O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入质量浓度为1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 ·2Η20)溶液5_7 mL,继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用； (2)抗体的预处理将要标记的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林单克隆抗体在1000 r/min, 4°C条件下,离心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀释成I mg/mL;或者用O. 01 mol/L PBS将要标记的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林单克隆抗体稀释成I mg/mL,过O. 22 Mm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备取步骤(I)中的胶体金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg克伦特罗或莱克多巴胺或沙丁胺醇或苯乙醇胺A或特布他林单克隆抗体的蛋白溶液,反应10 min ；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温低速1500 r/min离心20min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C, 12000 r/min离心20 min,弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL，制备成克伦特罗单克隆抗体蛋白质偶联物或莱克多巴胺单克隆抗体蛋白质偶联物或沙丁胺醇单克隆抗体蛋白质偶联物或苯乙醇胺A单克隆抗体蛋白质偶联物或特布他林单克隆抗体蛋白质偶联物的胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备将步骤(3)克伦特罗单克隆抗体蛋白质偶联物、莱克多巴胺单克隆抗体蛋白质偶联物、沙丁胺醇单克隆抗体蛋白质偶联物、苯乙醇胺A单克隆抗体蛋白质偶联物和特布他林单克隆抗体蛋白质偶联物的胶体金标记物依次用划膜仪以5 PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含克伦特罗单克隆抗体蛋白质偶联物、莱克多巴胺单克隆抗体蛋白质偶联物、沙丁胺醇单克隆抗体蛋白质偶联物、苯乙醇胺A单克隆抗体蛋白质偶联物和特布他林单克隆抗体蛋白质偶联物的胶体金膜；
(5)包被膜制备将兔抗鼠IgG抗体稀释成Img/mL、克伦特罗抗原稀释成O. 3 mg/mL、莱克多巴胺抗原稀释成O. 5 mg/mL、沙丁胺醇抗原稀释成I mg/mL、苯乙醇胺抗原稀释成I. 5mg/mLA和特布他林抗原稀释成2. O mg/mL,用划膜仪依次以I PL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干；
(6)样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。所述步骤(3)中的金标抗体稀释液由5 g小牛血清蛋白(BSA) ,10 g鹿糖,加100mL 0.01 mol/L PBS溶液溶解配制而成，过O. 22 滤膜，现配现用；金标抗体洗涤缓冲液是由 10 g 小牛血清蛋白(BSA)和 I g PEG-20000，用 0.01 mol/L PBS ρΗ7· 4 定容至 100 mL所得。
所述步骤(6)中的样品垫处理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和O. 8 g氯化钠(NaCl)，用含有 O. 5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。本发明可有效用于同时测定β-兴奋剂克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五种物质，方法简单，方便、快捷，结果准确。
图I为本发明五联胶体金检测卡的结构图图中I.加样孔 2.克伦特罗检测线
3.莱克多巴胺检测线 4.沙丁胺醇检测线5.苯乙醇胺A检测线6.特布他林检测线
7.质控线8.检测孔9.试纸条10.检测卡外壳；
图2为本发明五联胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中11.样品垫12.胶体金结合垫13. PVC胶板14.包被膜15.吸水垫。
具体实施例方式实施例I
图I为本发明五联胶体金检测卡的结构图、图2为本发明五联胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图图中13为PVC胶板；11为样品垫；12为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗体胶体金标记物；14为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了克伦特罗-BSA、莱克多巴胺-BSA、沙丁胺醇-BSA、苯乙醇胺A-BSA、特布他林-BSA和兔抗鼠IgG ；15为吸水垫。在PVC胶板13的一端上(样品加样端)粘附样品垫11、胶体金结合垫12，样品垫11搭接在胶体金结合垫12上。在PVC胶板13的中间粘附硝酸纤维素膜14。在硝酸纤维素膜14上设置有克伦特罗-BSA检测线2、莱克多巴胺-BSA检测线3、沙丁胺醇-BSA检测线4、苯乙醇胺A-BSA检测线5、特布他林检测线6和兔抗鼠IgG质控线7。在PVC胶板13的另一端粘附吸水垫15。硝酸纤维素膜14的一端与结合垫9略交叉，另一端与吸水垫15略交叉。该试纸条9可装入有塑料模具制成的检测卡外壳10中，在检测卡外壳10的上盖上设有加样孔I和检测孔5，样品垫8正对加样孔1，硝酸纤维素膜14正对检测孔8。实施例2
克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五联胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现
一、胶体金溶液制备取IL三角烧瓶I个,加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用；
二、抗体的预处理将要标记的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林单克隆抗体在1000 r/min, 4°C条件下,离心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀释成I mg/mL;或者用O. 01 mol/L PBS将要标记的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林单克隆抗体稀释成I mg/mL,过O. 22 Mm滤膜；
三、胶体金标记物的制备取步骤(一)中的胶体金溶液40mL，用O. 25 mol/L 1(20)3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg克伦特罗或莱克多巴胺或沙丁胺醇或苯乙醇胺A或特布他林单克隆抗体的蛋白溶液,反应10 min ；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温低速1500 r/min离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C, 12000 r/min离心20 min,弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL，制备成伦特罗克隆抗体蛋白质偶联物或莱克多巴胺克隆抗体蛋白质偶联物或沙丁胺醇克隆抗体蛋白质偶联物或苯乙醇胺A克隆抗体蛋白质偶联物或特布他林单克隆抗体蛋白质偶联物的胶体金标记物；
四、胶体金膜的制备将步骤(三)克伦特罗克隆抗体蛋白质偶联物、莱克多巴胺克隆抗体蛋白质偶联物、沙丁胺醇克隆抗体蛋白质偶联物、苯乙醇胺A克隆抗体蛋白质偶联物和特布他林单克隆抗体蛋白质偶联物的胶体金标记物依次用划膜仪以5 PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含克伦特罗克隆抗体蛋白 质偶联物、莱克多巴胺克隆抗体蛋白质偶联物、沙丁胺醇克隆抗体蛋白质偶联物、苯乙醇胺A克隆抗体蛋白质偶联物和特布他林单克隆抗体蛋白质偶联物的胶体金膜；
五、包被膜制备将兔抗鼠IgG抗体稀释成Img/mL、克伦特罗抗原稀释成O. 3 mg/mL、莱克多巴胺抗原稀释成O. 5 mg/mL、沙丁胺醇抗原稀释成I mg/mL、苯乙醇胺抗原稀释成I. 5mg/mLA和特布他林抗原稀释成2. O mg/mL,用划膜仪依次以I PL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干；
六、样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
七、检测卡的组装=PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。实施例3
最低检出限量试验
分别配制标准的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林标准品溶液浓度是0、0. 5 ng/mL、l ng/mL、2. 5 ng/mL、5 ng/mL ;滴加2滴样品到到检测卡加样孔上,5min后观察检测线T和质控线C的显色结果。经多次检验，克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林的检出率达99%以上，最低检出限量少于5 ng/mL。
权利要求
1.检测β-兴奋剂类药物的五联检测卡，其特征在于由包被了克伦特罗单克隆抗体、莱克多巴胺单克隆抗体、沙丁胺醇单克隆抗体、苯乙醇胺A单克隆抗体和特布他林单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林共5种蛋白质偶联物和兔抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水棉、PVC胶板及塑料模具组成，在PVC胶板的一端 依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水棉。
2.根据权利要求I所述的检测β_兴奋剂类药物的五联检测卡的制备方法，其特征在于由以下步骤制备得到 胶体金溶液制备取I L三角烧瓶I个，加入超纯水495 mL，而后加入质量浓度为1%氯金酸5 mL，配制成500 mL质量浓度为O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入质量浓度为1%柠檬酸三钠溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用； 抗体的预处理将要标记的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林单克隆抗体在1000 r/min,4°C条件下,离心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀释成Img/mL;或者用O. 01 mol/L PBS将要标记的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林单克隆抗体稀释成I mg/mL,过O. 22 Mm滤膜； 胶体金标记物的制备取步骤(I)中的胶体金溶液40 mL，用O. 25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg克伦特罗或莱克多巴胺或沙丁胺醇或苯乙醇胺A或特布他林单克隆抗体的蛋白溶液，反应10 min ;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温1500 r/min离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C, 12000 r/min离心20 min,弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL，制备成克伦特罗单克隆抗体蛋白质偶联物或莱克多巴胺单克隆抗体蛋白质偶联物或沙丁胺醇单克隆抗体蛋白质偶联物或苯乙醇胺A单克隆抗体蛋白质偶联物或特布他林单克隆抗体蛋白质偶联物的胶体金标记物； 胶体金膜的制备将步骤(3)克伦特罗单克隆抗体蛋白质偶联物、莱克多巴胺单克隆抗体蛋白质偶联物、沙丁胺醇单克隆抗体蛋白质偶联物、苯乙醇胺A单克隆抗体蛋白质偶联物和特布他林单克隆抗体蛋白质偶联物的胶体金标记物依次用划膜仪以5 μ /cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含克伦特罗单克隆抗体蛋白质偶联物、莱克多巴胺单克隆抗体蛋白质偶联物、沙丁胺醇单克隆抗体蛋白质偶联物、苯乙醇胺A单克隆抗体蛋白质偶联物和特布他林单克隆抗体蛋白质偶联物的胶体金膜； 包被膜制备将兔抗鼠IgG抗体稀释成I mg/mL、克伦特罗抗原稀释成O. 3 mg/mL、莱克多巴胺抗原稀释成O. 5 mg/mL、沙丁胺醇抗原稀释成I mg/mL、苯乙醇胺抗原稀释成I. 5 mg/mLA和特布他林抗原稀释成2. O mg/mL，用划膜仪依次以I PL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干； 样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干； 检测卡的组装PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
3.根据权利要求2所述的检测β_兴奋剂类药物的五联检测卡的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的金标抗体稀释液由5 g小牛血清蛋白，10 g鹿糖,加100 mL O. 01 mol/L PBS溶液溶解配制而成，过O. 22 Mffl滤膜，现配现用；金标抗体洗涤缓冲液是由10 g小牛血清蛋白和 I g PEG-20000，用 0.01 mol/L PBS ρΗ7· 4 定容至 100 mL 所得。
4.根据权利要求2所述的检测β_兴奋剂类药物的五联检测卡的制备方法，其特征在于所述步骤￠)中的样品垫处理液是由I g小牛血清蛋白和0.8 g氯化钠，用含有O.5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
全文摘要
本发明涉及检测β-兴奋剂类药物的五联检测卡及其制备方法，涉及β-肾上腺素受体激动剂检测技术领域。本发明的检测卡外壳中有试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水棉组成；胶体金膜为含克伦特罗单克隆抗体、莱克多巴胺单克隆抗体、沙丁胺醇单克隆抗体、苯乙醇胺A单克隆抗体和特布他林单克隆抗体胶体金标记物的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有五条检测线T线和一条质控线C线，质控线C线包被有兔抗鼠IgG抗体。本发明可同时检测出克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林，方法简单、方便、快捷，结果准确。
文档编号G01N33/577GK102901818SQ201210366379
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者杜道林, 洪霞, 薛永来, 张祯 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司