含有CpG寡核苷酸的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明总体上涉及一种含有CpG寡核苷酸的药物组合物，具体而言，本发明涉及 基于CpG寡核苷酸与铝佐剂的协同作用的用于加强针对抗原的免疫反应的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)是危害公众健康的全球性重大问题，使用疫苗能有效预防 HBV感染，降低慢性肝炎携带率，控制乙肝流行。据WT0报道，自1982年以来，全世界已经使 用了 10亿剂量的乙型肝炎病毒疫苗，对预防和控制乙型肝炎病毒的传播起到了非常重要 的作用。由于HBV采用的是易出错的基于RNA的复制，从而导致乙肝表面抗原（HBsAg)改变 的HBV抗性逃避突变株的出现。目前市场上预防用乙型肝炎疫苗均用氢氧化铝（A1(0H)3) 作为佐剂，其能够增强Th2类免疫应答和体液免疫，可以诱导机体产生和分泌保护性抗体 IgGl，氢氧化铝起贮藏作用且推迟抗原清除的时间，延长抗原暴露于免疫系统的时间；同时 活化补体，提高淋巴结诱捕能力和淋巴细胞的滞留时间；吸附抗原并转运抗原至淋巴结，产 生免疫应答；包裹抗原并缓慢地释放，起到抗原仓库的作用。但近年随着疫苗学及免疫学的 发展，已发现其局限性：氢氧化铝主要刺激Th2相关抗体的产生（包括IgE)，但不能诱导产 生Thl细胞免疫反应，不能刺激Thl活性，也不能加强细胞免疫（CTL)，阻断CD8+CTL的激 活。这种抗体虽能中和掉细胞外的病毒，但不能彻底清除掉潜伏在感染细胞中的乙型肝炎 病毒，往往导致患者体内乙型肝炎病毒的藏匿。而且人群中有10%左右的人对该疫苗反应 力低下或无反应。如何提高现有乙型肝炎病毒疫苗的免疫活性或研制出能有效激发清除藏 匿于细胞中的乙型肝炎病毒的疫苗尤为重要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的之一在于提供一种用于诱导受治者体内的免疫反应的药物 组合物，其包含：（a) 1iig/ml-100iig/ml抗原，（b) 25iig/ml-500iig/ml含有序列 5' -tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3' 的CpG寡核苷酸，和（c)25iig/ml-500iig/ml错佐剂。
[0004] 在本发明的一种实施方式中，所述CpG寡核苷酸的序列为 5' -tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3'，所述错佐剂为氢氧化错，所述抗原为与病毒相关的抗 原；优选地，所述病毒选自：肝炎病毒，例如，重组人乙型肝炎病毒，所述抗原为乙肝表面抗 原。
[0005] 在本发明的药物组合物中，所述铝佐剂的浓度为：25iig/ml_125iig/ml，或 125ug/ml-500ug/ml，或 125ug/ml-400ug/ml，或 125ug/ml-300ug/ml，或 250ug/ ml-500ug/ml，或 300ug/ml-400ug/ml，或 400ug/ml-500ug/ml，或 300ug/ml-500ug/ ml。所述含有序列 5'-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3' 的CpG寡核苷酸（CpG-ODN)的浓度 为：125ug/ml-500ug/ml，或 25ug/ml-125ug/ml，或 125ug/ml-250ug/ml，或 250ug/ ml-500iig/ml。所述抗原的浓度为：20iig/mL。
[0006] 根据本发明的优选实施方式，本发明的药物组合物中，所述抗原的浓度为：20ii g/ ml，所述铝佐剂的浓度为：250ii g/ml-500ii g/ml或300ii g/ml-500ii g/ml，所述CpG-ODN的 浓度为：125 ii g/ml-500 ii g/ml。
[0007] 在本发明更为优选的实施方式中，所述抗原的浓度为：20ii g/ml，所述铝佐剂的浓 度为：125 y g/ml、250 y g/ml、300 y g/ml、400 y g/ml或00 y g/ml，所述CpG-〇DN的浓度为： 125 u g/ml、250 u g/ml或500 u g/ml。
[0008] 在本发明尤为优选的实施方式中，所述抗原的浓度为20 ii g/ml，所述铝佐剂的浓 度为25 ii g/ml，所述CpG-ODN的浓度为500 ii g/ml ;或者所述抗原的浓度为20 ii g/ml，所 述铝佐剂的浓度为25 ii g/ml，所述CpG-ODN的浓度为125 ii g/ml;或者所述抗原的浓度为 20 ii g/ml，所述铝佐剂的浓度为125 ii g/ml，所述CpG-ODN的浓度为25 ii g/ml;或者所述抗 原的浓度为20 ii g/ml，所述铝佐剂的浓度为300 ii g/ml，所述CpG-〇DN的浓度为125 ii g/ ml;或者所述抗原的浓度为20 ii g/ml，所述铝佐剂的浓度为400 ii g/ml，所述CpG-〇DN的浓 度为125ii g/ml;或者所述抗原的浓度为20ii g/ml，所述铝佐剂的浓度为125ii g/ml，所述 CpG-〇DN的浓度为500 y g/ml。
[0009] 本发明的药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂选自：溶剂、分散 介质、包被剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂（例如，抗菌剂、抗真菌剂），等渗剂、延迟吸收 剂、盐、药物稳定剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、颜料，以及它们的组合或类似 物。
[0010] 本发明的另一目的在于提供本发明的药物组合物在制备用于诱导受治者体内针 对抗原的免疫反应的药物中的应用。通过使用药物领域常用的赋形剂可将本发明的药物组 合物配制为用于肠胃外给药的剂型，例如，注射剂型；用于口服给药的剂型，例如，片剂、药 丸、胶囊、凝胶、糖浆、浆状物和悬浮液，或用于透皮给药的剂型，或者其他本领域常用的剂 型。在本发明的一种实施方式中，通过本发明的药物组合物配制的用于诱导受治者体内针 对抗原的免疫反应的药物可为乙肝疫苗或丙肝疫苗，可选地，通过本发明的药物组合物配 制的用于诱导受治者体内针对抗原的免疫反应的药物为基因工程乙肝疫苗，包括重组酵母 乙肝疫苗和重组CH0乙肝疫苗。
[0011] 本发明的又一目的在于提供一种诱导受治者体内针对抗原的免疫反应的方法，所 述方法包括：将有效量的本发明的药物组合物给药于所述受治者。所述方法还可包括将有 效量的本发明的药物组合物再次给药于所述受治者。其中，所述再次给药的时间间隔为2 周至12周。在本发明的一种实施方式中，所述再次给药的时间间隔为4周。通过向受治者 给药两次本发明的药物组合物即可诱导受治者体内针对抗原的免疫反应，产生保护性抗体 应答水平，这相对于目前给药三次来诱导免疫反应的方法而言，减少了给药次数，缩短了诱 导受治者体内的免疫反应的全程免疫时间。
【附图说明】
[0012] 图1表示联合使用不同浓度的CpG和不同浓度的铝佐剂诱导HBsAg产生IgG的总 量的变化；
[0013] 图2表示使用不同浓度的CpG和不同浓度的铝佐剂联合诱导HBsAg产生IgG2a亚 型的量的变化；
[0014] 图3表示使用不同浓度的CpG和不同浓度的铝佐剂联合诱导HBsAg产生IgG2a与 IgGl的比值的变化；
[0015] 图4表示使用不同浓度的CpG和不同浓度的铝佐剂联合在小鼠体内诱导HBsAg产 生抗-HBs抗体滴度的变化；
[0016] 图5表示使用不同浓度的CpG和不同浓度的铝佐剂联合在小鼠体内诱导IFN-Y 产生的量的变化。
【具体实施方式】
[0017] 以下将结合实施例对本发明涉及的多个方面进行详细说明，这些实施例仅用于举 例说明。本领域普通技术人员可理解的是，本发明不受实施例中所描述的具体操作步骤的 限制。
[0018] 除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属技术 领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0019] 术语释义
[0020] 免疫佐剂
[0021] 本发明的免疫佐剂是本领域普通技术人员熟知的免疫佐剂，其一般分为如下四 类：（1)微生物及其产物，常用的微生物有分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及革兰 氏阴性杆菌的提取物脂多糖，分枝杆菌的提取物胞壁酰二肽等；(2)多聚核苷酸，例如，多 聚肌苷酸：胞苷酸（poly1 :C)，多聚腺苷酸（poly1:A:ii)等；(3)弗氏佐剂，（4)无机物，例 如明矾，等。免疫佐剂主要通过以下机制起效：（1)刺激单核-吞噬细胞系统，增强其对抗 原的处理和提呈能力；（2)延长抗原在体内的存留期，增加与免疫细胞接触的机会；（3)诱 发抗原注射部位及其局部淋巴结的炎症反应，有利于刺激免疫细胞的增殖作用。
[0022] CdG宴核苷酸
[0023] 本发明中所述的CpG寡核苷酸属于新型免疫佐剂，其是由磷酸二酯键连接成的非 甲基化的二核苷酸，具有免疫刺激作用。CpG-ODN能促进B细胞增殖分化并分泌IL-6,从而 诱导抗体的分泌；激活单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等抗原提呈细胞分泌多种细胞因子 (例如，IL-12,IL-6，TNF_a，IFN-a和IFN-3等）。通过细胞因子间接促进杀伤性T细胞 (CTL)和天然杀伤细胞（NK细胞）的活性，诱导细胞内病原体产生细胞免疫，并诱导NK细胞 和T细胞分泌IFN-Y。除了诱导天然免疫反应之外，CpG-ODN还可以增强抗原特异性反应， 这是由于（1)通过B细胞抗原受体引发的信号传导途径和通过CpG引发的B细胞信号传导 途径之间存在强烈的协同作用；（2)能够增加抗原特异性的T辅助的Thl样细胞因子，从而 增强了B细胞和T细胞的抗原特异型反应，以及（3)细胞反应需要有共刺激分子的正调控。
[0024] 早在19世纪90年代，人们就发现给癌症患者注射细菌提取物能明显减轻病情，后 来研究表明，细菌DNA具有直接的免疫刺激作用和抗肿瘤作用。通过合成的寡聚脱氧核苷 酸进行实验研究，发现细菌DNA的免疫刺激作用和其中的非甲基化CpG二核苷酸有关。
[0025] 具有免疫刺激活性的CpG-ODN的基本结构特点如下：
[0026] a.CpG基序是CpG-ODN产生免疫刺激作用的基本结构，其由CpG二核苷酸及其5' 端和3'端的各两个碱基构成。
[0027] b. CpG两侧的嘌呤和嘧啶以及CpG的间隔都会影响CpG-ODN的免疫刺激活性及其 作用特点。
[0028] c. 0DN所含CpG基序的数目，通常含有2-4个CpG基序是最佳的，CpG基序间的间 隔，通常至少要间隔两个碱基，而且最好是胸腺嘧啶。
[0029] d.含有poly-G序列（3个或以上鸟嘌呤组成）的CpG-ODN具有较强的刺激浆细胞 样树树突细胞（pDC)产生干扰素-a的作用；全部硫代修饰的CpG-ODN最稳定，且对B细胞 的刺激作用最佳，但全部硫代修饰的CpG-ODN刺激pDC产生IFN- a的作用却不及部分硫代 修饰的CpG-ODN。