专利名称：一种微生物的分子标记及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种微生物的分子标记及其构建和应用。
背景技术：
CpG-DNA是含有未甲基化CpG的DNA序列，能够刺激脊椎动物的免疫系统。这种 序列通常可以用人工合成方法获得，称为CpG寡核苷酸(CpG 0DN)，也可以构建于质粒DNA 中。由于CpG-DNA广泛存在于细菌DNA中，但很少存在于脊椎动物DNA中，因而CpG-DNA是 一种细菌等微生物的分子标记，可以被脊椎动物免疫系统识别。识别CpG-DNA的免疫分子 是Toll样受体家族成员TLR9 ；TLR9与CpG-DNA作用诱发多种免疫反应，包括促使淋巴细胞 增值，激活自然杀伤细胞、巨噬细胞等免疫因子等。基于其免疫促进活性，CpG-DNA被认为是 一种具有良好应用前景的免疫佐剂和抑菌因子。由于CpG-DNA具有种属特异性，因而不同 物种的有效CpG-DNA序列不同。目前鱼类CpG-DNA的研究大多针对虹鳟、大西洋鲑鱼等，针 对牙鲆的CpG-DNA研究很少。由于牙鲆是我国重要的海水养殖鱼类，具有广阔的市场和很 高的经济价值，因而开展牙鲆特异性CpG-DNA研究对我国水产养殖业发展具有切实意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种微生物的分子标记及其构建和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种微生物的分子标记微生物的分子标记为牙鲆特异性CpG-DNA序列，为序列 表SEQ ID中的碱基序列所示。构建1)将质粒pCN3用BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG43用T4DNA连接酶于室温连 接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养 24-30小时，挑取转化子，提取质粒，待用；所述CPG43为5，-GATCGCGCGCGCGCGTCTATTCGTCG TTGGTTGTCGTTTTGGTG-3，；2)将上述所得质粒用BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG40用T4DNA连接酶于室温 连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养 24-30小时，挑取转化子，提取质粒，即为具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒；所述CPG40 为 5，-GATCACGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTATG-3，。应用所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染。所序列表 SEQ ID中的碱基序列能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。所述具有序列表 SEQ ID中的碱基序列的质粒的PBS溶液至浓度为20ug/ml，具有序列表SEQID中的碱基序 列的质粒的PBS溶液以100-120ul的剂量腹腔注射牙鲆能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水 气单胞菌侵染。本发明具有如下优点1.能够非特异性抑制病原侵染。本发明的微生物的分子标记CpG-DNA能够使鱼类抵御多种常见细菌病原的侵染。2.制备简单，造价低廉。由于本发明的微生物的分子标记CpG-DNA携带于质粒上， 因而可以在细菌中扩增，通过常规质粒提取即可获得，避免了昂贵的人工合成途径。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组二 DNA提取 皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。4.所有寡核苷酸合成皆由“上海生工生物工程技术服务有限公司”合成。实施例1牙鲆特异性CpG-DNA序列具序列表SEQ ID中的碱基序列。序列表SFQ ID为GATCGCGCGCGCGCGTCTATTCGTCGTTGGTTGTCGTTTTGGTGGATCACGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTAT(a)序列特征 长度84 类型核苷酸序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源人工设计实施例2含有牙鲆特异性CpG-DNA序列的质粒的构建M M 14 pCN3(参 B Jiao X, Zhang M, Hu Y, and Sun L. Construction and evaluation of DNA vaccinesencoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine. 2009 ； 27 :5195-5202.进行构建)用 BamHI 酶切后与寡聚核苷酸 CPG43(5，-GATCGCGCGCGCGCGTCT ATTCGTCGTTGGTTGTCGTTTTGGTG-3，)用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化入大 肠杆菌DH5 a后在含有100ug/ml的安卡青霉素的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取 转化子，提取质粒，即为质粒pC2M。将pC2M用BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG40 (5’_GATCA CGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTATG-3，)用 T4DNA 连接酶于室温连接 2-4 小时，连接 液转化入大肠杆菌DH5后在含有lOOug/ml的安卡青霉素的LB固体培养基上培养24-30小 时，挑取转化子，提取质粒，即为具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒，经测序可知质粒中含有有序列表SEQ ID中的碱基序列。实施例2pC4M的抑菌应用1)迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱 德华氏菌TX1(保存于CGMCC，编号为CGMCC No. 2330)和嗜水气单胞菌AH1. 927 (购于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，编号1.927)使两种菌的菌悬液分别培 养至0D_均为0. 6，然后分别以5000g，4°C离心lOmin，收集各自的菌体，将TX1悬浮于PBS 中至终浓度为5X 106cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液；将T4悬浮于PBS中至终浓度为 2X 107cfu/ml，即为嗜水气单胞菌悬液。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97. 5%蒸馏水；所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl，0. 02 % KC1，0. 358 % Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04，98. 798%蒸馏水。2)将96条牙鲆(每条重约7g)随机分为4组，每组24条。将这4组分别命名为 A、B、C和D组。将A和C组的每条鱼腹腔注射lOOul具有序列表SEQ ID中的碱基序列的 质粒的PBS溶液，其中每lOOul含有2ug具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒。将B和 D组(对照组)的每条鱼腹腔注射lOOul PBS。2天后将A和B组鱼每条腹腔注射lOOul上 述步骤1)的迟缓爱德华氏菌悬液；将C和D组鱼每条腹腔注射lOOul上述步骤1)的嗜水 气单胞菌悬液。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组 鱼的总死亡数目A组，10条；B组，20条，C组，8条；D组，20条。利用下列公式计算相对免 疫保护效率(RPS)RPS = 100 X (1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)由此得出具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒针对迟缓爱德华氏菌和嗜水气 单胞菌的免疫保护效率分别为50%和60%。结论具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒能够显著抑制迟缓爱德华氏菌和 嗜水气单胞菌侵染。
权利要求
一种微生物的分子标记，其特征在于微生物的分子标记为牙鲆特异性CpG-DNA序列，为序列表SEQ ID中的碱基序列所示。
2.一种按权利要求1所述的微生物的分子标记的构建，其特征在于1)将质粒PCN3用BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG43用T4DNA连接酶于室温连接2_4 小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养24_30小 时，挑取转化子，提取质粒，待用；所述 CPG43 为 5，-GATCGCGCGCGCGCGTCTATTCGTCGTTGGTTGT CGTTTTGGTG-3，；2)将上述所得质粒用BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG40用T4DNA连接酶于室温连 接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养 24-30小时，挑取转化子，提取质粒，即为具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒；所述 CPG 40 为 5’ -GATCACGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTATG-3，。
3.一种按权利要求1所述的微生物的分子标记的应用，其特征在于所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染。
4.按权利要求3所述的微生物的分子标记的应用，其特征在于所序列表SEQID中的 碱基序列能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。
5.按权利要求3所述的微生物的分子标记的应用，其特征在于所述具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒的PBS溶液至浓度为20ug/ml，具有序列表SEQ ID中的碱基序列的 质粒的PBS溶液以100-120ul的剂量腹腔注射牙鲆能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单 胞菌侵染。
全文摘要
本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种微生物的分子标记及其构建和应用。微生物的分子标记为牙鲆特异性CpG-DNA序列，为序列表SEQ ID中的碱基序列所示。所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染。本发明所得牙鲆特异性CpG-DNA序列对多种常见病原菌具有抑制作用，因而在牙鲆病害防治中具有良好的应用前景。
文档编号A61K31/7088GK101851621SQ201010151850
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者刘春胜, 孙黎 申请人:中国科学院海洋研究所