一种新型微生物保护剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种新型聚乙烯醇-低共熔溶剂微生物保护剂及其应用。
【背景技术】
[0002]微生物菌种保藏是生物技术中必备的试验，冷冻保存法及冷冻干燥保存法是常见的2种微生物菌种保藏方法。菌株保藏过程中一般需要添加保护剂，常用的保护剂有5-10%脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤、加7.5%葡萄糖的血清以及40%甘油等。也常用高分子物质及其分解产物作为保护剂，例如白蛋白、动物胶、粘液蛋白、各种胨、肉汁、酵母汁、可溶性淀粉、糊精、海藻酸、果胶、阿拉伯胶、葡聚糖、聚乙烯啦略烷酮及羧甲基纤维素等。上述保护剂一般用量都较大，而在实际应用中常需要用量低、效果好的微生物保护剂。随着科技进步，一些具有较好应用前景的新型微生物保护剂被挖掘和开发，如聚乙烯醇和低共熔溶剂等。
[0003]聚乙烯醇是一种由聚醋酸乙烯脂水解而成的，且分子链上含有大量极性羟基的水溶性聚合物。由于分子链易形成氢键，且其链结构对称规整，因此具有良好的成膜性、水溶性、乳化性和黏结性。另外还润滑、摩擦、高弹性能，良好的生物相容性、化学稳定性及生物可降解性。
[0004]低共熔溶剂，是由两种或多种成分组成的低共熔混合物，也被称为是一种更为绿色的液体。它通常是由一定化学计量比的氢键供体和氢键受体组合而成的低共熔混合物。另外，由于其制备原料成本低廉，制备过程是百分百原子经济性反应，产物易生物降解、对环境无危害和毒副作用，所以它是一种可广泛应用的新型的绿色溶剂。目前低共熔溶剂在生物技术及提取分离工程中的有着广泛的应用。针对目前微生物保护剂应用存在的不足，开发一种使用剂量低且有效的微生物保护剂具有较好的市场前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有微生物保护剂的缺陷，提供一种新型的微生物保护剂。
[0006]本发明目的可通过如下技术方案实现:
[0007]—种新型微生物保护剂及其应用，该保护剂由聚乙烯醇和低共熔溶剂组成，两种组分质量比为1:2，该保护剂使用剂量为0.25?0.75%。在该保护剂中，聚乙烯醇的分子量范围为30000?70000Da;低共熔液体由甜菜碱、海藻糖和甘氨酸按摩尔比1: 2: 2组成，混匀后加热至90°C，共熔形成一种粘稠透明的液体，室温成液态。该保护剂主要应用于乳酸菌的冷冻保藏或冷冻干燥保藏，尤其对乳酸菌中的德式乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)冷冻干燥保藏最有效。
[0008]本发明微生物保护剂与现有微生物保护剂相比具有如下的有益效果:
[0009]1、使用剂量低；
[0010]2、该保护剂可广泛应用于各种微生物菌种的保藏。
【具体实施方式】
[0011]以食品工业中常用的德式乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)为例说明新型聚乙稀醇-低共恪溶剂微生物保护剂的应用。
[0012]实施例1
[0013](I)菌悬液的制备:
[0014]将供试菌株德式乳杆菌保加利亚亚种，分别按I % (100ml培养基接种Iml菌液)接种量，各接种于1.5L的MRS肉汤培养基中，在42°C下培养至稳定期(1_2天)，在4°C，离心力为10，000 Xg的条件下离心lOmin，去上清，菌泥用60mM无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.5)洗涤2次后，重悬于50mL无菌PBS溶液中。
[0015](2)添加保护剂预冻:
[0016]取上述制得的菌悬液1mL两份，加入聚乙烯醇-低共熔溶剂微生物保护剂，使其终浓度为0.25%和0.75% (g/g)，将含有保护剂的菌悬液分装在无菌西林瓶中，每瓶lmL，塞上灭菌棉球。每种保护剂的菌悬液各5瓶。取两种不同浓度保护剂各4瓶放入-70°C超低温冰箱中进行预冻，预冻时间4h。剩余2瓶测原始菌落总数。
[0017](3)未加保护剂预冻(对照):
[0018]取上述制得的菌悬液10mL，加入0.25%和0.75% (g/g)的PBS溶液，分装在无菌西林瓶中，每瓶lmL，共10瓶，塞上灭菌棉球。8瓶放入_70°C超低温冰箱中进行预冻，预冻时间4h。剩余2瓶测菌落总数。
[0019](4)冷冻干燥:
[0020]将预冻好的菌体，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为-50°C，真空度为4Pa，时间为24h。冷冻干燥结束后，于超净台上取出棉球加盖灭菌塞，样品备用。菌体冻干后，于4°C条件下放置3天，而后测定菌落总数。
[0021]结果表明:加入0.25%和0.75% (g/g)聚乙烯醇-低共熔溶剂微生物保护剂的样品菌落总数分别是对照的12-1O3及14-1O5倍。
【主权项】
1.一种新型微生物保护剂及其应用，其特征在于该保护剂由聚乙烯醇和低共熔溶剂组成，两种组分质量比为1: 2，该保护剂使用量为0.25?0.75%。2.根据权利要求1所述微生物保护剂，其特征在于聚乙烯醇的分子量范围为30000?70000Dao3.根据权利要求1所述微生物保护剂，其特征在于所述的低共熔溶剂由甜菜碱、海藻糖和甘氨酸按摩尔比1: 2: 2组成，组分混匀后加热至90°C，共熔形成一种粘稠透明的液体，室温成液态。4.根据权利要求1所述微生物保护剂应用，其特征在于该保护剂主要应用于乳酸菌的冷冻保藏或冷冻干燥保藏，尤其对乳酸菌中的德式乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)冷冻干燥保藏最有效。
【专利摘要】本发明涉及一种新型微生物保护剂及其应用，该保护剂由聚乙烯醇和低共熔溶剂组成，在微生物冷冻干燥过程中或微生物冷冻贮藏过程中应用。本发明产品使用剂量小，成本低廉，可广泛作为各种微生物保护剂。
【IPC分类】C12N1/04
【公开号】CN105219645
【申请号】CN201510755543
【发明人】陈志刚, 乔颖, 黄瑶, 冯芳, 吴涛
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月6日