专利名称：一种微生物杀菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物杀菌剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。
背景技术：
中国是农业大国，病虫草害的防治是农业生产中的重要环节。目前对农植物病害防治仍主要依靠化学杀菌剂。但随着科学技术发展，研究发现化学农药在防治病害的同时，对环境的污染越来越严重。同时化学农药往往毒性高，杀伤天敌，破坏生物多样性，为更严重的病虫害猖獗发生提供了条件，造成病虫害防治上的恶性循环。连续用药造成的农药残留对人体产生危害以及病原菌抗药性正引起人们极大的关注。据联合国粮农组织统计，100余种病原菌对1至数种化学农药产生了抗药性，而且分析预测今后将以每5年约10％的数量递增。农药还是癌症等许多疑难疾病的诱因之一，美国环境保护署对本国注册的360种化学农药进行评审，发现其中70多种有致癌作用，每年引起2万例癌症。农植物病虫害的化学防治与保护生态环境，保障人民健康形成的矛盾越来越引起关注。微生物农药对人畜安全，易于分解，与环境相容，被誉为“无公害”农药。此外，微生物农药还具有研究周期短、投入低、易于工业化和商品化开发的优势。自上个世纪90年代以来，微生物农药每年以20％的速度递增，已经成为农业生物技术产业中的研究开发热点之一。
镰刀菌和立枯丝核菌是两种重要的，广普性植物病原菌。前者几乎危害所有植物，引起各类植物的叶、茎、根部枯萎病。后者引起烟草、小麦、水稻、马铃薯、蔬菜、果树等植物立枯丝核病。凡是感染了上述两种病原菌的植物，不但产量锐减，质量也明显下降。镰刀菌、立枯丝核菌产生的枯萎病和立枯丝核病已经成为农业生产中重要限制因素，研究开发微生物杀菌剂已经成为农业可持续发展中的重要课题。
发明内容
本发明的目的是通过对筛选到的一株具有毒杀植物病原菌的侧孢短芽孢杆菌研究，开发微生物杀菌剂。
本发明筛选到一株对镰刀菌、立枯丝核菌具有很好毒杀功能的侧孢短芽孢杆菌Brevibacilius laterosporus G4，G4菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心；地址中国.武汉.武汉大学；保藏日期2003年5月26日；保藏登记入册的编号CCTCC NOM203045。
本发明Brevibacillus laterosporus G4菌株形态特征为长杆状，个体较大，两端钝圆，多以凝集形式存在。在YPD平板培上菌落呈圆形、隆起、边缘较整齐，表面无光泽、粗糙、类似细小粉末状，菌苔白色。在YPD培养基上培养36小时以上可见极少数的内生孢子形成或释放到胞外的芽孢，在NA或LB培养基培养12-16小时，便可见大量脱落的芽孢，芽孢为椭圆形呈独木舟状体。
本发明是这样实现的制备微生物杀菌剂，进行杀菌剂室内药效试验，确定其对镰刀菌和立枯丝核菌两种植物病原菌的杀菌作用。
制备微生物杀菌剂(以下为重量百分比)1、试管种培养将G4的菌体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为牛肉膏3克；蛋白胨8克；氯化钠4克；琼脂18克；水1000ml，pH7.5。于32-38℃下培养1-2天，获得试管种。
2、制备微生物杀菌剂采用500ml三角瓶摇瓶培养。方法是先配制液体培养基，液体培养基配方为0.2-0.4％牛肉膏；10-20％大豆饼粉；0.5-2％鱼粉；氯化钠0.3-0.5％；pH7-8，余下为水。在每个三角瓶中装入300ml液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的试管种，于37℃下，120rpm/min摇床培养2天，当活菌数增殖到最高峰，达到1010/ml时，即成为可供使用的微生物杀菌剂。
微生物杀菌剂室内药效试验1、制备试验用药剂按前述试管种培养方法培养试管种，按前述制备微生物杀菌剂方法制备试验用药剂。
2、制备对照用药剂对照1按前述制备杀菌剂方法制备好微生物杀菌剂后，用细菌过滤器过滤掉菌体，以不含菌体的发酵液为对照。
对照2前述2制备杀菌剂方法制备对照用药剂，但液体培养基中不接入G4菌株，用未接种的发酵液为对照。
对照3以清水作为对照。
2、制备试验用病原菌将镰刀病菌和立枯丝核病菌分别接种到试管固体培养基斜面上，培养基的配方为常用的PDA培养基，方法是取马铃薯200克去皮后切成小块，加水1500ml煮沸20分钟，过滤后得到1000ml滤液，然后加入葡萄糖20克，琼脂18克，pH自然。于25℃下培养2-3天，等菌丝长满并产孢后，用无菌水洗下待用。
3、试验方法制备混菌平板将直径9ml的培养皿灭菌后，倒入20m145℃的PDA培养基和0.1ml病原菌液体，充分混匀后制成镰刀病菌、立枯丝核病菌混菌平板。
药效试验采用常规的牛津杯抑菌实验法，即在每个混菌平板上放置牛津杯，在牛津杯内加入0.1ml的试验用药剂和对照用药剂，于25℃下培养72小时，测量抑菌圈直径(扣除牛津杯直径)，重复三个样品。
4、试验结果表1微生物杀菌剂对镰刀病菌室内药效
表2微生物杀菌剂对立枯丝核病菌室内药效
结果表明，本发明微生物杀菌剂对镰刀菌、立枯丝核菌两种植物病原菌有较好的杀菌作用，平均抑菌圈直径分别达到2.1和3.73cm，对立枯丝核病菌效果优于对镰刀病菌效果。但其平均抑菌圈都在2cm以上，显示了较好的应用前景。
对照1的毫无抑菌作用，表明杀菌作用是由活菌体产生的，不是常规的菌体代谢产物，在产业化生产中重点考虑增加活菌体含量。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一
将Brevibacillus laterosporus G4菌体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为牛肉膏3克；蛋白胨8克；氯化钠4克；琼脂18克；水1000ml，pH7.5；于32℃下培养2天，获得试管种；用500ml三角瓶扩大培养，液体培养基配方为0.3％牛肉膏；15％大豆饼粉；1％鱼粉；氯化钠0.4％；pH7.5；余下为水。在每个三角瓶中装入300ml液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1平方ml大小的试管种，于37℃下，120rpm/min培养2天，当活菌数增殖到最高峰，达到1010/ml时，即成为可供使用的微生物杀菌剂。
实施例二基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方为0.2％牛肉膏、10％大豆饼粉、0.5％鱼粉、氯化钠0.3％、pH7、余下为水；试管种培养于温度为35℃、培养时间为1.5天。
实施例三基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方为0.4％牛肉膏、20％大豆饼粉、2％鱼粉、氯化钠0.5％、pH8、余下为水；试管种培养于温度为38℃、培养时间为1天。
权利要求
1.一种微生物杀菌剂，其特征在于该菌剂的生产菌株为侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus G4，G4菌株已于2003年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NOM203045。
2.权利要求1所述微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于(1)试管种培养为将Brevibacillus laterosporus G4的菌体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为牛肉膏3克、蛋白胨8克、氯化钠4克、琼脂18克、水1000ml、pH7.5；于32-38℃下培养1-2天，获得试管种；(2)制备微生物杀菌剂采用三角瓶摇瓶培养，即先配制液体培养基，液体培养基配方为0.2-0.4％牛肉膏；10-20％大豆饼粉；0.5-2％鱼粉；氯化钠0.3-0.5％；pH7-8，余下为水；在每个三角瓶中装入300ml液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1平方ml大小的试管种，于37℃下，120rpm/min摇床培养48小时，当活菌数增直到最高峰，达到1010/ml时，即成为可供使用的微生物杀菌剂。
3.权利要求1所述的微生物杀菌剂，其特征在于该杀菌剂对对镰刀菌和立枯丝核菌两种植物病原菌具有杀菌作用，可用于植物病害生物防治。
全文摘要
本发明涉及一种微生物杀菌剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。本发明的生产菌株为Brevibacillus laterosporus G4，该菌株已于2003年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NOM203045。本发明的微生物杀菌剂采用常规摇瓶发酵方法制备，其固体培养基配方为牛肉膏3克；蛋白胨8克；氯化钠4克；琼脂18克；水1000ml，pH7.5。液体发酵培养基配方为0.2－0.4％牛肉膏；10－20％大豆饼粉；0.5－2％鱼粉；氯化钠0.3－0.5％；pH7－8，余下为水。当活菌数增殖达到1010/ml时，即成为可供使用的微生物杀菌剂。本发明的杀菌剂对镰刀菌和立枯丝核菌两种植物病原菌具有较好的杀菌作用，可用于植物病害生物防治，具有较好应用前景。
文档编号A01N63/02GK1640266SQ20041004079
公开日2005年7月20日 申请日期2004年9月30日 优先权日2004年9月30日
发明者张楹, 周薇 申请人:云南大学