心拍干，每孔依次加入显色剂各50y1，小心混匀，封板，37°C孵育显色液15分钟。然后， 每孔加入终止液50iil，混匀。使用酶标仪检测450nm(参比波长630nm)的吸光度值（终 止反应后l〇min内读数），用空白对照孔校零。计算阴性对照平均吸光度值NCX，临界值= 阴性对照的平均吸光度值NCXX2. 1 (阴性对照吸光度值低于0. 05时按照0. 05计算，高于 〇. 05按实际吸光度计算）。将每个孔的吸光度值与临界值比较，不小于该临界值的样品判 定为阳性。根据每个稀释度的阳性数和阴性数，计算抗体阳转率进一步计算H)5。值（半数 有效量）。
[0134] ED5。值=105〇%阳转率终点对数
[0135] 其中，50%阳转率终点对数=高于50%阳转率稀释度（含量）对数+距离比X稀 释系列对数
[0136]
[0137] 3. 3 结果:
[0138] 下表4提供本实施例的包含不同浓度的HBsAg、Al(0H)3和CpG-ODN的药物组合物 激活体液免疫应答的效果以及诱导抗-HBs阳转比例的结果。
[0139] 表 4
[0140]
[0142] 从上述结果可见，10#样品免疫的小鼠的ED5。值为0. 235,而1#样品至9#样品免疫 的小鼠的H)5。值均小于0. 2,与10#样品免疫的小鼠相比具有显著性差异（P< 0. 05)，这说 明氢氧化铝和CpG-ODN双佐剂配制的疫苗免疫小鼠抗体阳转率明显升高，证明了CpG-ODN 佐剂与氢氧化铝有协同作用，二者联合使用能提高疫苗的保护效果。
[0143] 实施例4 :不同浓度A1 (0H)2与不同浓度CdG-ODN联合诱导特异件细朐免疫应答
[0144] 使用实施例3中提供的包含不同浓度的乙肝表面抗原（HBsAg)、氢氧化铝以及CpG 寡核苷酸的药物组合物，通过如下所述的实验方法检测该药物组合物在诱导特异性细胞免 疫应答方面的作用。
[0145] 4. 1材料和试剂：
[0146] 实验动物：清洁级BALB/C雌性小鼠，4-6周龄（北京维通利华实验动物有限公 司），体重15-25g，每组8只。
[0147] HBsAg原液（不含铝佐剂，北京生物制品研究所）：用1mlPBS溶解lmgHBsAg蛋 白冻干粉配制待用。
[0148]CpG_0DN(5' -tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3'，SEQIDN0. 1，由北京迪纳兴科生物 科技公司合成）溶液：用无菌生理盐水作为溶剂，溶解不同量的CpG-ODN制备成不同浓度的 CpG0DN溶液。使用前一天配置，4 °C过夜放置待用。
[0149] A1 (0H)3溶液：用无菌生理盐水作为溶剂，溶解不同量的A1 (0H)3制备成不同浓度 的A1(0H)3溶液。
[0150] 4. 2 方法:
[0151] 取50ill含有不同浓度的CpG-ODN溶液、氢氧化铝溶液以及HBsAg溶液混匀，冰上 放置10分钟，然后稀释，分别将100Pi稀释的样品（含1Pg乙肝表面抗原）注射给4-5周 龄的雌性BALB/C小鼠（每组8只）的左前胫肌肉。在第0周和第4周进行两次免疫。第 5周处死小鼠。取脾，制备脾细胞。以抗IFN-Y抗体包被PVDF膜96-孔板，制备小鼠脾淋 巴细胞并计数，封闭后孵育细胞，洗板显色，将ELISPOT板放置于CTL免疫斑点影像分析仪 自动读板仪内，调节参数采集图像，进行计数。
[0152] 4. 3 结果：
[0153] 如图5所示，在氢氧化铝为300iig/ml且CpG-ODN为125iig/ml条件下，采集到 的图像中斑点最密集，即抗原抗体结合最多，其次是氢氧化铝为400yg/ml且CpG-ODN为 125iig/ml的条件，再次为氢氧化错为300iig/ml且CpG-ODN为250iig/ml的条件。而在不 含CpG-ODN的条件下，采集到的图像中几乎没有斑点，S卩，抗原抗体几乎没有结合。这说明， 在诱导IFN-y分泌方面，仅含有氢氧化铝的10#样品疫苗诱导产生IFN-y表达水平较之 含有氢氧化铝和CpG-ODN双佐剂的1#至9#样品疫苗低，氢氧化铝单佐剂疫苗能刺激Th2 类免疫应答，但诱导产生Thl细胞免疫反应并不理想。含有氢氧化铝和CpG-ODN双佐剂的 1#至9#样品疫苗诱导产生IFN-Y的水平均明显高于10#样品疫苗，而体液免疫应答研究 结果也显示含氢氧化铝和CpG-ODN双佐剂的疫苗刺激产生抗体水平明显高于氢氧化铝单 佐剂组，这说明乙型肝炎疫苗中联合使用氢氧化铝和CpG-ODN作为双佐剂协同起效，不但 能增强体液免疫，还能诱导IFN-y的表达，激活Thl细胞免疫应答。这种双佐剂制剂比传 统的仅含氢氧化铝的单佐剂乙型肝炎疫苗更具优势。因此，双佐剂疫苗同时具有治疗和预 防病毒性疾病的作用。具有实用潜力。
[0154]结论:
[0155] 本发明提供的包含（a) 1iig/ml-100iig/ml抗原，（b) 25iig/ml-500iig/ml含有序 列 5' -tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3' 的CpG寡核苷酸，和（c)25iig/ml-500iig/ml错佐剂 的药物组合物能够诱导针对乙肝表面抗原的免疫反应并且增强乙肝疫苗免疫效果。本发明 的含有双佐剂的药物组合物可作为疫苗使用，其比传统的仅含氢氧化铝的单佐剂疫苗更具 优势，两种佐剂协同起效，不但能增强体液免疫，还能激活Thl细胞免疫应答。由本发明的 药物组合物制备得到的疫苗不但能中和掉细胞外的病毒，而且还能彻底清除掉潜伏在感染 细胞中的病毒。
[0156] 上文对本发明的优选的实施例进行了描述，但是，显然，这些实施例仅仅用于举例 说明。本领域技术人员可在不背离本发明的实质的前提下对这些实施例作出多种改变、修 改和替换。本发明的范围由所附的权利要求来限定，并且本发明权利要求范围内的组合物 及其应用以及它们的等同物也被所附的权利要求涵盖。
【主权项】
1. 一种用于诱导受治者体内的免疫反应的药物组合物，其包含： (a) IIig/ml-100Iig/ml抗原， (b) 25iig/ml-500iig/ml含有序列 5'_tcgacgttcgtcgttcgtcgttc_3' 的CpG寡核苷酸， 和 (c) 25iig/ml-500iig/ml铝佐剂。2. 如权利要求I所述的药物组合物，其中，所述CpG寡核苷酸的序列为 Sj-Ixgacgttcgtcgttcgtcgttc-Sj03. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述铝佐剂包括氢氧化铝。4. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗原为与病毒相关的抗原。5. 如权利要求4所述的药物组合物，其中，所述病毒选自：重组人乙型肝炎病毒。6. 如权利要求4所述的药物组合物，其中，所述抗原为乙肝表面抗原。7. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述铝佐剂的浓度为：25iig/ml-125iig/ ml，或 125iig/ml-500iig/ml,或 125iig/ml-400iig/ml,或 125iig/ml-300iig/ml,或 250ug/ml-500ug/ml，或 300ug/ml-400ug/ml，或 400ug/ml-500ug/ml，或 300ug/ ml-500yg/ml〇8. 如权利要求I所述的药物组合物，其中，所述含有序列 5' -tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3' 的CpG寡核苷酸的浓度为：125iig/ml-500iig/ml，或 25ug/ml-125ug/ml，或 125ug/ml-250ug/ml，或 250ug/ml-500ug/ml〇9. 如权利要求I所述的药物组合物，其中，所述抗原的浓度为：20iig/mL。10. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗原浓度为20iig/mL，所述CpG寡核 苷酸的浓度为500iig/ml，所述铝佐剂的浓度为25iig/ml;或者 所述抗原的浓度为20iig/ml，所述铝佐剂的浓度为25iig/ml，所述CpG-ODN的浓度为 125iig/ml;或者 所述抗原的浓度为20iig/ml，所述铝佐剂的浓度为125iig/ml，所述CpG-ODN的浓度为 25iig/ml;或者 所述抗原的浓度为20iig/ml，所述铝佐剂的浓度为300iig/ml，所述CpG-ODN的浓度为 125iig/ml;或者 所述抗原的浓度为20iig/ml，所述铝佐剂的浓度为400iig/ml，所述CpG-ODN的浓度为 125iig/ml;或者 所述抗原的浓度为20iig/ml，所述铝佐剂的浓度为125iig/ml，所述CpG-ODN的浓度为 500ug/ml〇11. 如权利要求1至10任一项所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。12. 权利要求1至11任一项所述的药物组合物在制备用于诱导受治者体内针对抗原的 免疫反应的药物中的应用。13. 如权利要求12所述的应用，其中，所述药物为乙肝疫苗或丙肝疫苗。14. 如权利要求12所述的应用，其中，所述药物为基因工程乙肝疫苗。15. 如权利要求14所述的应用，其中，所述基因工程乙肝疫苗包括重组酵母乙肝疫苗 和重组CHO乙肝疫苗。16. 如权利要求12所述的应用，其中，所述药物被配制为用于肠胃外给药的剂型、用于 口服给药的剂型或用于透皮给药的剂型。17. 如权利要求14所述的应用，其中，所述用于肠胃外给药的剂型为注射剂型。18. 如权利要求14所述的应用，其中，所述用于口服给药的剂型为片剂、药丸、胶囊、凝 胶、糖浆、浆状物和悬浮液。19. 一种诱导受治者体内针对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括：将有效量的权 利要求1至11任一项所述的药物组合物给药于所述受治者。20. 如权利要求17所述的方法，其中，所述方法还包括将有效量的权利要求1至11任 一项所述的药物组合物再次给药于所述受治者。21. 如权利要求18所述的方法，其中，所述再次给药的时间间隔为2周至12周。22. 如权利要求19所述的方法，其中，所述再次给药的时间间隔为4周。
【专利摘要】本发明提供一种用于诱导受治者体内的免疫反应的药物组合物，其包含：(a)1μg/ml-100μg/ml抗原，(b)25μg/ml-500μg/ml含有序列5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’的CpG寡核苷酸，和(c)25μg/ml-500μg/ml铝佐剂。该药物组合物可诱导或增强受治者体内针对抗原的免疫反应。
【IPC分类】A61P31/14, A61K39/39, A61K39/29, A61P31/20
【公开号】CN105214083
【申请号】CN201410294142
【发明人】王立公, 钱大鹏
【申请人】长春华普生物技术有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年6月26日
【公告号】WO2015196935A1