专利名称：反基因V－erbB寡核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及反基因V-erbB寡核苷酸，其多肽产物，包含其的药物组合物及其在诊断和治疗骨髓增生异常综合征、白血病和其他多种肿瘤中的应用。
基因治疗是近十多年来发展起来的疾病治疗新技术，它是通过纠正致病基因的异常或用新的基因进行替换的办法达到治疗疾病的目的。鉴于目前肿瘤治疗手段的局限性和不彻底性，乃至多数肿瘤患者治疗后若干年便复发和死亡，人们对肿瘤的基因治疗抱有很高的期望。然而现有技术中用病毒载体将正常基因导入体内的方法，虽有某些疗效，但面临一系列难题。而用反义寡核苷酸硫代磷酸酯作基因治疗则避免了因使用病毒载体而带来的一系列问题。硫代磷酸所带来的某些毒性是人体可接受和能克服的，因而十分安全。然而，由于反义寡核苷酸是针对癌细胞靶基因的mRNA而设计的，而癌细胞能源源不断地从细胞核内产生mRNA，因而不可能有巩固的疗效。而在此基础上发展起来的反基因寡核苷酸则针对癌基因的特定的突变位置而设计，使之进入细胞后能在细胞核内形成巩固的DNA三链结构而抑制该基因的表达和扩增，从而为肿瘤基因治疗带来新的希望。
骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)俗称白血病前期(preleukemia)，是一组恶性的骨髓造血干细胞病，多数病人骨髓增生过度但分化成熟障碍，因而其外周血中有形成分减少，出现贫血、出血、血细胞减少及头晕、乏力等症状。多数病人诊断后若干月或若干年发展为急性白血病，且无有效治疗方法。
已知V-erbB和V-erbA为鸡原始红细胞增多症(AvianErythroblastosis)病毒癌基因。前者同源于表皮生长因子受体(EGFR)基因，具有转化红系祖细胞的功能；后者具有阻断上述红系祖细胞分化成熟的作用。二者协同作用导致鸡原始红细胞增多症或称红白血病。
骨髓增生异常综合征(MDS)具有五个不同亚型，其中难治性贫血(Refractory Anemia，RA)是其基本型。它可以转化为原始粒细胞增多RA(即RAEB)和转化中的RAEB(即RAEBT)和急性白血病(Acute Leukemia，AL)。RAEBT患者骨髓中原始和早幼红细胞增多时还可以再诊断为红白血病而与上述鸡红白血病相同。RA患者骨髓单一红系统过度增生时亦可诊断为红血病。而红血病可以发展为红白血病。说明红血病—红白血病与MDS—RA和RAEB、RAEBT等并无本质区别。提示V—erbB和V—erbA之血细胞副本C—erbB和C—erbA异常可能在人MDS、白血病发病中起重要作用。
以往的研究业已证明，人外周血淋巴细胞染色体脆性部位(Fragile Site，FS)高表达提示肿瘤易感性。肿瘤患者FS往往与肿瘤细胞染色体断点以及癌基因位置相同或相近。本发明人发现一例白血病前期患者外周淋巴细胞表达Fra(7)(P11)和Fra(3)(P14)等。Fra(7)(P11)与C—erbB相毗邻，患者骨髓红系病态造血(Myelodysplasia)明显，因而高度怀疑C—erbB受累。于是，本发明人选用V—erbB和V—erbA作探针进行Southetn印迹杂交，证明MDS与C—erbB重排/扩增和C—erbA缺失/失活相关，杂交结果有诊断和治疗意义。在此基础上，本发明人应用V—erbB PCR和正基因寡核苷酸原位杂交方法，进而确定C-erbB重排位置，其PCR产物和原位杂交结果均有诊断和发病学意义。由此完成本发明。
因此，本发明的第一个目的在于提供应用反基因技术原理用于治疗MDS、白血病和其他多种肿瘤的反基因寡核苷酸及其较短的副本。所述的反基因寡核苷酸是针对V-erbB DNA序列中可疑的重排位置即原位杂交中所用正基因寡核苷酸而设计合成的反基因寡核苷酸。
本发明的第二个目的在于提供一种药物组合物，其包括本发明的寡核苷酸及一种药物学可接受的载体，用于治疗MDS、白血病和其他多种肿瘤。
本发明的第三个目的在于提供一种反基因寡核苷酸组合(配方)，其包括本发明的寡核苷酸和与癌症发病相关基因的反基因寡核苷酸。
本发明的第四个目的在于提供与所述反基因寡核苷酸相对应的正基因寡核苷酸，其能用于诊断MDS、白血病和其他多种肿瘤。
本发明的第五个目的在于由本发明的反基因或正基因寡核苷酸转录得到的mRNA，及所述mRNA表达的多肽，包含该多肽的疫苗。
具体地说，首先本发明涉及反基因V-erbB寡核苷酸，其能用于治疗MDS、白血病和其他多种肿瘤。所述的寡核苷酸具有如下核苷酸序列5′ATGGCAGAGCTGGCAAAC(SEQ ID NO1)5′AATTCTCAGGTGGGCCTG(SEQ ID NO2)本发明的反基因V—erbB寡核苷酸是朝着C-erbB的重排部位而设计合成的，因其与正基因C—erbB重排部位碱基互补而能靶向地结合并抑制正基因C—erbB的异常表达或转录，或者同正基因C—erbB mRNA结合而阻断其翻译为致癌性蛋白。因此，运用本领域人员公知的反基因技术，本发明的寡核苷酸可用于治疗C—erbB重排/扩增和C—erbA缺失/失活相关的MDS、白血病及其他多种肿瘤。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸经硫代磷酸修饰，这种修饰后的产物具有抑制核酸酶的作用并使其达到细胞内的靶位置。
因此，本发明的另一方面涉及包含SEQ ID NO1和/或SEQ IDNO2的寡核苷酸及药物学可接受的载体的药物组合物，所述的药物组合物可给予MDS、白血病及其他多种肿瘤患者，药物组合物中包含的载体可以是本领域熟知的载体或赋形剂。一种反基因寡核苷酸组合(配方)，其包括本发明的寡核苷酸和与癌症发病相关基因的反基因寡核苷酸。
已知骨髓中原始和早幼粒细胞比例的增加，不仅是MDS转白血病，也是慢性粒细胞白血病急性转变的集中表现，同时也是白血病原发和复发的集中表现。从以下实施例可知运用本发明的反基因V—erbB寡核苷酸能快速而有效地使MDS模型大鼠骨髓中原始和早幼粒细胞降低到正常水平(≤5％)，从而为基因治疗MDS等恶性肿瘤疾病提供了一种途径。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及与所述的反基因寡核苷酸相对应的正基因寡核苷酸，所述的正基因寡核苷酸经标记后例如可以用作诊断探针，与骨髓细胞样品进行原位杂交以判断个体是否患有MDS等恶性肿瘤。或者应用本发明人发明的引物，经V-erbBPCR方法检测患者骨髓的C—erbB基因异常与否，从而诊断MDS等恶性肿瘤。所述的正基因寡核苷酸可以以本领域已知的任何方法进行标记，如生物素、地高辛等。
与病毒介导的基因治疗相比，用本发明的反基因寡核苷酸作基因治疗有许多优点。除了作用快速，操作简便外，没有因载体(如逆病毒或腺病毒)DNA或RNA的导入细胞而带来一系列难以评估的不良后果是最大的优点。本发明的寡核苷酸的作用特点是癌基因重排位置的原位修复，而非导入外源基因，因而它不同于一般的反义基因治疗。后者是针对癌基因mRNA而设计合成反义寡核苷酸，而由于癌细胞能源源不断地从细胞核内产生mRNA，所以有限的反义寡核苷酸的治疗作用是有限和短暂的。
以下将参照附图和实施例详细描述本发明。
图1显示实施例2中用本发明的反基因V—erbB寡核苷酸治疗后大鼠MDS的效果。
图2显示实施例2中用本发明的反基因V—erbB寡核苷酸治疗后，大鼠MDS血象恢复正常。
图3显示实施例2中用本发明的反基因V—erbB寡核苷酸治疗过程中大鼠MDS体重增加。
实施例1反基因和正基因V—erbB寡核苷酸的合成在DNA合成仪(型号394型，来源PE公司)上自动合成如下的寡核苷酸5′ATGGCAGAGCTGGCAAAC(SEQ ID NO1)5′AATTCTCAGGTGGGCCTG(SEQ ID NO2)实施例2反基因V-erbB寡核苷酸治疗MDS的效果选择幼年天津大鼠(TR，来自天津医科大学动物室)和Wistar大鼠(WR，来自军事医学科学院营养所动物室)各10只，分为4组，每组5只。按以往的方法(冯宝章等，中国实验血液学杂志，1996，4(3)309)，经尾静脉注射二甲基苯蒽(DMBA)。TR二组中一组为空白对照，另一组为实验组，每只动物每周注射1次，连续注射4次。WR二组中第一组和第二组分别注射1次和3次。而后观察各组动物发病情况。
根据以往的工作，3次注射DMBA的大鼠有9/14发生MDS。注射后2个月发病，并有3-4个月MDS期。选择3次注射DMBA的Wistar大鼠作基因治疗模型。
将实施例1合成的2条反基因V—erbB寡核苷酸，经磷酸硫代修饰。使用之前用生理盐水溶解，浓度为10.0OD/ml,MDS大鼠每天尾静脉注射1次，连续注射3天。剂量为0.56mg/kg体重。
在对3次给药组(5只)进行观察过程中，发现2只WR几乎同时发病并诊断为MDS—RA(即难治性贫血)。当它们从RA发展到RAEB(原始细胞增多型RA)阶段时，将其中1只(WR1)选作基因治疗实验鼠，另一只(WR2)作为对照鼠。实验鼠经尾静脉注射V—erbB反基因寡核苷酸，每天1次，连续3天为一个疗程。而后进行观察。注射反基因寡核苷酸后1个月左右，发现对照鼠精神萎摩不振，且见尾根部生长3—4公分大小的瘤子(病理检查确认为肉瘤)。骨髓检查确诊为红白血病，并死于尿路受肉瘤压迫而致的尿潴留。而实验鼠不仅精神好，而且骨髓检查发现实验鼠的原始和早幼粒细胞从V—erbB反基因寡核苷酸治疗前的13.0％下降为3.0％。血象和骨髓象明显改善。反基因治疗后3个月再作骨髓象和血象检查时发现二者均正常。详见图1、2。初步结果说明，本发明的反基因寡核苷酸对大鼠MDS有良好的疗效，而治疗前后体重检查结果说明此反基因寡核苷酸毒性不明显(图3)。将此只雄性实验鼠与1只未孕的雌性Wistar大鼠同窝喂养48天后，雌鼠生育一胎14只健康活泼的幼仔，进一步说明本发明的反基因寡核苷酸虽经硫代但毒性不显且安全性能好。
本发明的反基因V—erbB寡核苷酸不同给药次数和方案对大鼠MDS骨髓的影响见表1。从表1可见，进行治疗的16只大鼠原始和早幼粒细胞均有明显下降，其中15只大鼠的骨髓象恢复正常。并且本发明的两种寡核苷酸单独给药或联合给药均有疗效。而对照鼠(0—0，B—7)骨髓原始和早幼粒细胞百分比上升，提示疾病在进展。随后应用相同的剂量，1—3个疗程对8只MDS—RAEB大鼠进行口服治疗，取得与上述相同的结果。局部用药治疗3例食管癌和2例宫颈癌早期病人均有效，使重度增生逆转为正常。表1 16只大鼠MDS注射本发明的反基因寡核苷酸(B1和B2)后骨髓变化的观察MDS MDS注 射后 骨髓原始＋早幼粒细胞％给药方法大鼠 亚型 观察时间(月) 治疗前治疗后(变量)WR 0-0 RAEB 3.0 10.021.0(-11.0) 0B-0 RAEB 3.0 13.53.0(10.5) B1，B2×3B-1*RAEB 2.5 15.0无恶性细胞 B1，B2×3B-4 RAEB 2.5 11.06.0(5.0)B1，B2×2B-7 RAEB 2.5 11.516.0(-5.5) 0A-4 RAEB 3.0 17.012.0(5.0) B1，B2×2C-2 RAEB 3.5 9.0 5.0(4.0)B1，B2×3C-8 RAEB 3.5 8.5 4.5(4.0)B1，B2×3D-3 RAEB 3.0 13.06.0(7.0)B1，B2×1D-5 RAEB 3.0 9.5 2.5(7.0)B1，B2×1E-2 RAEB 3.0 7.0 4.5(2.5)B2×3E-5 RAEB 3.0 6.5 3.0(3.5)B2×1D-4 RAEB 2.5 6.5 2.5(4.0)B1，B2×1D-1 RAEB 2.5 9.5 2.0(7.5)B1×3D-2 RAEB 2.5 11.53.0(8.5)B1×3F-5 RA 2.5 5.0 1.0(4.0)**B1，B2×1F-1 RAEB 2.5 7.5 1.5(6.0)B1，B2×1TR G-2RAEB 1.0 10.05.0(5.0)B1，B2×3*该鼠观察期间死于炎症**该鼠在尾部发生肉瘤，转移至骨髓如上所述，我们建立的大鼠MDS模型同时也是肉瘤等其他肿瘤模型。本发明的V-erbB反基因寡核苷酸对MDS有良好疗效，对其他肿瘤看来也有疗效。鉴于脑胶质瘤有C-erbB基因扩增，应用本发明的V-erbB反基因寡核苷酸治疗其早期病变可能也有相似的疗效。常见恶性肿瘤如食管癌、胃癌、肺癌和宫颈癌等的早期病变看来也有疗效，因为它们均有与MDS相同的C-erbB重排/扩增。
实施例3用V—erbB正基因寡核苷酸诊断MDS的效果1.原位杂交法检测如实施例1所述合成对应于SEQ ID NO1的V—erbB正基因寡核苷酸，并用地高辛(DIG)标记该寡核苷酸，采用该标记的寡核苷酸作为探针，经原位杂交方法检测了33例MDS和19例对照及3例可疑MDS的C—erbB基因的扩增情况，结果显示全部33例MDS的原位杂交均呈阳性，19例对照组中有1例呈阳性，3例可疑MDS均为阳性。
2.PCR方法A.按常规方法提取骨髓细胞模板DNA。
B.以5’CACTGTGTGAAGGCCTGC(P1)和5’CTTATAAATAGTGCCAAAAGC(P2)为引物，97℃7分钟进行模板变性，然后进行32个循环，每个循环中变性条件为94℃0.5分钟，退火条件为52℃1分钟和延伸条件为72℃2分钟。最后一次循环后72℃延伸5分钟。PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶上电泳检测。根据电泳带型作基因诊断。
依照上述方法检测了23例MDS和25例对照及3例可疑MDS的C-erbB基因的重排情况，结果23例MDS中有18例PCR结果呈阳性，25例对照中有1例为阳性，3例可疑MDS中有2例为阳性。
权利要求
1一种反基因寡核苷酸，具有如下核苷酸序列5′ATGGCAGAGCTGGCAAAC(SEQID NO1)5′AATTCTCAGGTGGGCCTG(SEQ ID NO2)。
2如权利要求1所述的反基因寡核苷酸，其特征在于包括所述的寡核苷酸特异的mRNA。
3一种与权利要求1所述的反基因寡核苷酸互补的正基因寡核苷酸。
4一种经权利要求2所述的寡核苷酸制备的多肽疫苗。
5一种药物组合物，它含有权利要求1所述的反基因寡核苷酸以及药物学上可以接受的载体。
6一种反基因寡核苷酸组合(配方)，它含有权利要求1所述的寡核苷酸和癌症发病相关基因的反基因寡核苷酸。
7一种诊断试剂盒，它含有权利要求3中所述的寡核苷酸。
8权利要求1中所述的反基因寡核苷酸在制备治疗骨髓异常增生综合征、白血病和其他多种肿瘤药物中的应用。
9权利要求3中所述的寡聚核苷酸在制备用于诊断骨髓异常增生综合征基因诊断试剂中的应用。
10一对PCR引物序列，具有如下核苷酸序列5’-CACTGTGTGAAGGCCTGC-3’，和5’-CTTATAAATAGTGCCAAAAGC-3’。
全文摘要
本发明涉及反基因V－erbB寡核苷酸,其多肽产物,包含其的药物组合物及其在诊断和治疗骨髓增生异常综合征、白血病和其他多种肿瘤中的应用。
文档编号C07K14/435GK1326938SQ0010902
公开日2001年12月19日 申请日期2000年6月1日 优先权日2000年6月1日
发明者冯宝章 申请人:冯宝章