专利名称：一种抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法及其应用，特别涉及使用单链 片段抗体-鱼精蛋白多肽的融合蛋白靶向输送肿瘤基因的SiRNA的方法及其应用。
背景技术：
传统的反义基因方法包括特异性的反义寡核苷酸和核糖酶(ribozyme)，但是由于 这些传统的反义基因方法抑制基因表达的效果较弱，因此不能满足临床应用的需求。2001年，Tuchl等把长度约为19-23碱基对、人工合成的外源性siRNA导入哺乳 动物细胞内，能诱导出特异地抑制互补序列基因表达的RNA干扰(RNAi)效应。该报道发表 后，曾掀起了研究RNAi的热潮。从此，siRNA不仅被用作探讨细胞基因功能的工具，而且更 吸引人的是应用siRNA抑制致病基因的表达。与传统的抑制基因表达工具反义寡核苷酸和核糖酶比较，siRNA沉默基因表达的 效应要强大数十倍至数百倍，其抑制致病基因、治疗疾病的潜力也远远大于传统的逆基因 工具。应用Fas siRNA双链分子预防和治疗小鼠自身免疫的暴发性肝炎和肝硬化的研 究，是国际上首次使用siRNA治疗动物疾病模型的报道(见2003年度RNAi的“Nature Review’)。此后，RNAi应用于动物疾病模型的研究陆续出现，主要包括自身免疫和病毒性 肝炎、各种恶性肿瘤和神经系统疾病模型等。在体外细胞培养或裸鼠移植肿瘤模型的实验中，应用RNAi成功地抑制了癌基因 如k-ras和cyclin E的表达、肿瘤抗凋亡基因BCL-2的表达和肿瘤耐药基因mdrl的表达， 并有效地减少了癌细胞增殖，增加了其对化疗药物的敏感性。沉默Her2基因表达的RNAi 也成功地抑制体外培养的乳腺癌细胞增殖。这些初步的实验充分证明了武装RNAi成为新 一代抗肿瘤药物的潜力很大。但是，目前RNAi抗肿瘤的实验研究都是在体外培养的肿瘤细 胞中直接转染或转导RNAi或在裸鼠移植肿瘤组织内直接注入RNAi，虽然这些实验获得一 定的成功，但是距离在临床上真正使用RNAi治疗肿瘤还相差很远。其中主要障碍在于如何 在临床应用时把特异的RNAi导入目标细胞胞浆内起作用，特别是导入过量表达目标基因 的肿瘤细胞内。我们设想用RNAi抑制乳腺癌细胞中PLKl基因的表达，从而控制其增殖、扩散和诱 导癌细胞凋亡。其中关键的技术障碍是如何把RNAi选择性地导入在体内生长或转移的乳 腺癌细胞，这也是RNAi技术是否最终能安全有效地推向临床使用的主要问题。只有特异性 地导入siRNA，才能使它们集中到靶细胞内，充分发挥基因沉默效应，同时可避免非特异地 在正常组织细胞中抑制正常基因表达所产生的副作用。目前针对肿瘤的靶向治疗要求把抗癌药物或基因物质高效特异地输送到癌细胞 内，需要具备以下几个条件(1)肿瘤细胞表面表达特异性的分子/受体，这些受体只在癌 细胞大量表达，而在正常组织细胞基本不表达或表达极少；(2)受体与相应的配基或抗体 结合后可通过细胞内吞作用(endocytosis)把相应的受体/抗体或受体/配基复合物导入细胞内；(3)细胞吞入复合物后，可以通过细胞内的消化系统，如溶酶体等分离复合物，把 配基或抗体连接的药物释放到胞浆中。目前用来携带基因物质导入细胞的载体分为非病毒和病毒类，病毒载体由于其免 疫源性引起剧烈的免疫反应和随机插入基因组导致细胞癌变，都会导致严重的后果，暂不 适合于临床应用。非病毒载体主要包括多肽物质和脂质体，前者主要包括TAT，MPG和鱼精 蛋白多肽等，后者如脂质体微球囊等(liposomes)，常用的基因转染媒介，也主要是由各种 脂质体组成。但是，这些物质都不能选择性地把基因物质靶向导入乳腺癌细胞内。针对乳腺癌来说，什么才是既能与乳腺癌细胞表面Her2受体结合，又能携带 RNAi的理想生物导弹？ Her2配基虽然能与其受体结合，但是结合后它激活受体，传导增殖 信号，刺激癌细胞分裂转移，故不是理想的生物导弹。抗Her2的单克隆抗体则不会激活受 体，但它属于大分子蛋白，很难与抗癌药物或基因物质复合，而且具有很强的免疫原性，引 起针对抗体本身的免疫反应，影响治疗效果，故也不宜用作生物导弹。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明的主要目的在于提供一种抑制癌细胞的增殖和 诱导其凋亡的方法，使用单链片段抗体-鱼精蛋白多肽的融合蛋白靶向输送肿瘤基因的 SiRNA，从而抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡。优选的，所述的单链片段抗体为Her2-ScFV。所述的单链片段抗体-鱼精蛋白多肽的融合蛋白的编码核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。优选的，所述单链片段抗体-鱼精蛋白多肽的融合蛋白为靶向输送工具，HER-2为 靶标，输送针对肿瘤恶性基因PLKl的siRNA。所述癌细胞包括Her2阳性乳腺癌细胞。本发明还提供了一种单链片段抗体-多肽融合蛋白，该融合蛋白能用来抑制癌细 胞的增殖和诱导其凋亡。所述的单链片段抗体为Her2-ScFV，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。单链 片段抗体还可以为EGFR-ScFv或CD44_ScFv。所述的多肽为鱼精蛋白片段多肽，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明的第三个目的在于提供一种能抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的药物，该 药物包含有效量的上述所说的融合蛋白以及针对肿瘤基因的siRNA。优选的，所述针对肿瘤基因的siRNA包括针对肿瘤恶性基因PLKl的siRNA。本发明的技术方案能把针对肿瘤基因的siRNA导入需要进行基因沉默的特定的 细胞群内，以加强其治疗效果，减少对“无辜’’细胞基因表达的影响，使RNAi更有针对性， 提高其基因沉默效应的同时减少副作用。Her2ScFv(F5)导向Her2的RNAi治疗，有望从基因水平阻断癌基因的表达，更彻底 地破坏癌细胞的增殖和转移信号传导机制，增强其对化疗药物的敏感性。在本发明中，需要说明以下几点所谓“单链抗体片段(ScFv) ”，是指通过基因重组技术，人工表达保留了与抗原特 异性结合的免疫球蛋白Fab片段中的简要部分，由一段重链和一段轻链组成，两链之间通过短多肽铰链连接。ScFv既保留了抗原识别和结合的特性，又去除了普通抗体中免疫原性 最强的Fc段，同时其分子小，可以与其他脂质体或多肽重组成融合蛋白，便于携带基因物 质。目前，多个实验室已经筛选合成出理想的抗Her2受体ScFv (又称F5)，不仅象其 前身单克隆抗体赫赛丁(Herceptin) —样能与癌细胞表面Her2受体结合并减少其表达，而 且已经被成功地用作导向抗癌药物和基因物质攻击Her2高表达癌细胞的生物导弹。本发 明中，我们筛选并构建F5与鱼精蛋白片段多肽的融合蛋白，应用于导向携带PLKl-siRNA双 链分子，特异性地投入Her2阳性乳腺癌细胞。从而通过RNAi从基因水平减少PLKlmRNA表 达，从而产生相应的治疗效应。F5-P融合蛋白(其中，F5表示Her2ScFV，P表示鱼精蛋白多肽)靶向输送 PLKl-siRNA到Her2阳性乳腺癌细胞，可在mRNA和蛋白水平下调PLKl基因的表达，并产生 抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡的强大效应。Her2受体只大量表达于癌细胞表面，在正常组织细胞中表达甚少，这也是癌细胞 具有恶性表型的机制。另外，Her2受体与配基或抗体结合后，可通过细胞内吞作用循环到 细胞内。Her2受体/抗体复合物被吞入细胞后，复合体会被分离，如果复合体同时结合了化 疗药物或基因物质，这些物质将会被吸收并释放到胞浆中。因此，Her2抗体或配基携带的 抗癌药物只攻击Her2高表达的癌细胞，并能顺利把药物带入细胞内。本发明基于Her2受 体作为攻击癌细胞的路标，探索了既能与该受体结合，又能输送抗癌siRNA的载体，并利用 该载体输送抗癌siRNA。因此，Her2基因的RNAi有希望突破以往反义寡核苷酸和核糖酶 不尽人意的基因抑制效果，成为抗Her2治疗乳腺癌的新型基因药物。Her2受体只是一个优选实施例而已，当然不能将本发明的方法局限于只利用 Her2受体作为攻击癌细胞的路标，攻击癌细胞的路标还可以为EGFR和⑶44等。因而可以 通过变换本发明的抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法中用到的单链片段抗体-鱼精 蛋白多肽的融合蛋白中的单链片段抗体而使该方法可以应用于很多癌细胞，包括EGFR和 CD44等的单链片段抗体。
图1是用F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA处理乳腺癌细胞，检测Her2阳性的乳腺癌 SKBR3细胞的增殖能力的实验结果图；图2是用F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA处理乳腺癌细胞，检测Her2阳性的乳腺癌 BT 474细胞的增殖能力的实验结果图；图3是用F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA处理乳腺癌细胞，设立Lipofectamine2000 组作为阳性对照，检测Her2阴性的乳腺癌细胞的增殖能力的实验结果图；图4是将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上共孵育后处理乳腺癌细胞，检测Her2 阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的增殖能力的实验结果图；图5是将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上共孵育后处理乳腺癌细胞，进行局部拍 照观察细胞克隆的密度和克隆的大小，检测Her2阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的增 殖能力的实验结果图；图6是将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上共孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后收集细胞进行固定和随后染色进行细胞周期测定；图7是以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl_siRNA进行冰上共 孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后收集细胞流式检测ArmexinV/PI ；图8是以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl_siRNA进行冰上 共孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后收集细胞流式检测ArmexinV/PI，并对凋 亡的细胞进行统计；图9是以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl_siRNA进行冰上共 孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后细胞做免疫细胞化学染色检测细胞凋亡，并 对凋亡细胞进行统计和比较；图10是以1 3，1 6禾Pl 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰 上共孵育后处理乳腺癌细胞，经过24小时处理后细胞提取总RNA进行RT-PCR对比评估 PLKlmRNA的表达水平；图11是以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上 共孵育后处理乳腺癌细胞，经过24小时处理后细胞提取总RNA进行实时定量PCR定量细胞 PLKlmRNA的表达水平；图12是以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上 共孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后细胞提取总蛋白做Westernblot对比细胞 PLKl蛋白的表达水平。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。实施例1 细胞复苏和传代培养细胞复苏按如下步骤操作1、从液氮或低温冰箱中取出保存的乳腺癌SKBR3、BT 474和MDA-MB 231细胞冻存 管直接投入37°C温水中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染并轻轻摇动令其内 容物尽快融化。2、从37 °C水浴中取出冻存管，离心SOOrpm X 2min，用酒精消毒后开启，用滴管 吸出上清液，注入基础培养液Iml充分混勻，转入刻度离心管制成细胞悬液后低速离心 800rpmX2min,除去上清液，必要时再重复用培养液洗一次。3、再用含10% FBS的RPMI 1640、L15和DMEM/F12培养液适当稀释后，转移接种 细胞培养瓶，放入37°C、5% CO2培养箱静置培养，瓶盖入箱后稍为拧松透气。4、用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀 释至适宜浓度。细胞传代培养的操作步骤如下1、人乳腺癌细胞SKBR3、BT 474和MDA-MB 231用含10%小牛血清的RPMI1640培 养基，于37°C、饱和湿度下5% CO2的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长。2、当细胞长满瓶底90%后用0. 25%胰酶消化，倒置显微镜下见细胞间隙增大、胞 质回缩时消化终止，倒转培养瓶，吸尽弃去胰酶液。3、加入少量血清培养液轻轻吹打冲洗掉消化液，弃去上清液。
4、加入含10% FBS的培养液，轻轻吹打混勻使其脱壁分散，制成细胞悬液，然后分 瓶再培养；待进入对数生长期(细胞贴壁，胞浆延展)约为传代后24h时，弃去原培养液，用 PBS冲洗后用于实验。实验均取对数生长期的细胞，细胞数为0.5X IO4个/ml IX IO6个 /ml。实施例2 细胞种板转染做MTT实验细胞种板转染做MTT实验步骤如下1、人乳腺癌细胞SKBR3、BT 474和MDA-MB 231长满瓶底95%后用0. 25%胰酶消 化；2、将细胞悬液吹打均勻后进行计数，计算出每毫升悬液的细胞数；3、于96孔板中种好细胞，每孔细胞数约为7000个MDA-MB 231细胞10000个 BT-474 和 SKBR3 细胞；4、24小时后进行转染实验；5、换用含10% FBS (胎牛血清)的RPMI 1640、L15和DMEM/F12新鲜培养基；6、设定各处理因素并加入相应试剂；对照(优化培养基)、脂质体Lipofectamine 2000+PLKlsiRNA、F5_Pl+PLKlsiRNA、 F5-P2+PLKlsiRNA、F5_P3+PLKlsiRNA、F5-P3、PLKsiRNA 和 F5_P3+NC_siRNA其中，优化培养基具体是指在DMEM的基础上添加了 1 % (ν/ν)非必需氨基酸和 4. 5mg/ml葡萄糖。PLKlsiRNA 的序列为 5' -UgAAgAAgAUCACCCUCCUUAdTdT-3‘5 ‘ -UAAggAgggUgAUCUUCUUCAdTdT-3 ；F5-PLF5-P2和F5-P3表示不同的组别，均用浓度相同的Her2单链片段抗体鱼精 多肽融合蛋白，并以1/3，1/6和1/10的摩尔比加入PLKl-siRNA，NC-siRNA表示阴性对照的 siRNA(Negative-control, NC-siRNA)。以下类同。7、各组加入相应试剂后混合液置冰上孵育30min ；8、把上述混合液加入相应的孔中；9、37°C培养6小时后换为普通培养基；10、继续培养分别观察时间点为0h、24h、48h、72h和96h ；11、各组在相应的观察点取出细胞培养板，每孔换成100 μ 1无血清培养基，然后 每孑 L 力口入 25μ1 5mg/ml MTT(四氮唑蓝，5」diphenyl tetrazolium bromide，MTT)，放入 细胞培养箱中。与MTT孵育2h后，每孔加入100 μ L细胞裂解液，放回细胞培养箱中过夜孵 育。12、第二天取出96孔板，酶标仪读数。13、数据处理。实施例3 细胞种板转染做3H胸腺嘧啶掺入实验操作步骤如下1、人乳腺癌细胞SKBR3、BT 474和MDA-MB 231长满瓶底95%后用0. 25%胰酶消 化；2、将细胞悬液吹打均勻后进行计数，计算出每毫升悬液的细胞数；
3、于96孔板中种好细胞，每孔细胞数约为7000个MDA-MB 231细胞和10000个 BT-474 和 SKBR3 细胞；4、24小时后进行转染实验；5、换用新鲜培养基；6、设定各处理因素并加入相应试剂；对照(优化培养基)、Lipofectamine2000+PLKlsiRNA、F5_Pl+PLKlsiRNA、 F5-P2+PLKlsiRNA、F5_P3+PLKlsiRNA、F5-P3、PLKlsiRNA 和 F5_P3+NC_siRNA7、各组加入相应试剂后混合液置冰上孵育30min ；8、把上述混合液加入相应的孔中；9、37°C培养6小时后换为普通培养基；10、继续培养至处理48h ；11、观察点前6-16小时每孔加入IuG3H胸腺嘧啶核苷，细胞放培养箱继续培养 6-16小时；12、用多头收集器将细胞连同培养基吸收于玻璃纤维滤纸上，抽气过滤并用蒸馏 水充分洗涤；13、取出玻璃滤纸置于80°C烘箱烘干1小时；14、将每个孔的玻璃滤纸取出放入闪烁杯中；15、加IOml脂溶性闪烁液至闪烁杯；16、置于液体闪烁计数器中；17、设定技术程序；18机读计数；19、数据导出处理。以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上共孵育后 处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后加入3H胸腺嘧啶核苷检测细胞的增殖情况，结果发 现Her2阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的增殖能力明显受到抑制，而且呈现明显的剂 量效应关系。阳性对照LipofectamindOOO组也可以看到的明显的增殖抑制，而Her2阴性 的乳腺癌细胞的增殖能力没有明显影响(图1-3)。图1为用F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA 处理乳腺癌细胞，显示Her2阳性的乳腺癌SKBR3。细胞的增殖能力明显受到抑制，而且 呈现明显的剂量效应关系，处理组和对照组相比有明显的统计学差异(*，P <0.01 ’#，P <0.001)。而Her2阴性的乳腺癌细胞的增殖能力没有明显影响。图2是用F5-P融合蛋 白和PLKl-siRNA处理乳腺癌细胞，显示Her2阳性的乳腺癌BT 474细胞的增殖能力明显 受到抑制，而且呈现明显的剂量效应关系，处理组和对照组相比有明显的统计学差异(#，P <0.001)。而Her2阴性的乳腺癌细胞的增殖能力没有明显影响。图3是用F5-P融合蛋白 和PLKl-siRNA处理乳腺癌细胞，除了作为阳性对照的LipofectamindOOO组有明显的增殖 抑制之外，其他组细胞的增殖没有收到明显影响，证明Her2阴性的乳腺癌细胞的增殖能力 没有明显影响。以上实验说明，F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA对Her2阳性乳腺癌细胞可产 生明显的增殖抑制作用。实施例4 细胞种板转染做克隆形成实验
实验步骤如下1、人乳腺癌细胞SKBR3、BT 474和MDA-MB 231长满瓶底95%后用0. 25%胰酶消 化；2、将细胞悬液吹打均勻后进行计数，计算出每毫升悬液的细胞数；3、于24孔板中种好细胞，每孔细胞数约为70000个MDA-MB 231细胞100000个 BT-474 和 SKBR3 细胞；4、24小时后进行转染实验；5、换用新鲜培养基；6、设定各处理因素并加入相应试剂；对照(优化培养基)、Lipofectamine2000+PLKlsiRNA、F5_Pl+PLKlsiRNA、 F5-P2+PLKlsiRNA、F5_P3+PLKlsiRNA、F5-P3、PLKlsiRNA 和 F5_P3+NC_siRNA7、各组混合液置冰上孵育30min ；8、把上述混合液加入相应的孔中；9、37°C培养6小时后换为普通培养基；10、细胞继续培养48h ；11、在接近处理时间点约1小时于35mm的培养皿内铺好底层琼脂备用；12、将之前已配好高压灭菌的1. 6%和0. 7%琼脂置于微波炉内加热溶化；13、将1. 6%和0. 7%琼脂液和相应的2XMedium置于恒温水浴箱中平衡至40°C至 少 30min ；14、计算好总量后各取的1. 6%琼脂液和2XMedium充分混合；15、以每皿2ml的量加入底层琼脂；16、将已到观察时间点的细胞消化，不能消化过度；17、将细胞悬液吹打均勻后进行计数，计算出每毫升悬液的细胞数；18、以每皿10000个细胞的量种板；19、取等量的0. 7%琼脂液和相应的2XMedium混合后加入加入所需的总细胞数；20、取相应细胞数的琼脂液，培养基和细胞混合液加入各个培养皿，最好是每皿 Iml的体积；21、待上层琼脂液，培养基和细胞混合液凝结后各加Iml相应培养基；22、在 37°C孵箱中孵育 10_14d ；23、显微镜下观察并计数克隆；24、计算完克隆后可将整个培养皿染色拍照；25、弃培养皿内培养基；26、用 PBS 洗两遍；27、加入2ml 4%多聚甲醛固定30min ；28、用 PBS 洗一遍；29、加入0. 5ml 0. 结晶紫至各皿染色30min ；30、用PBS冲洗至能清楚的看到克隆；31、用相机拍照。以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上共孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后消化细胞种板做Soft agar assay以观察克隆形成 的能力，结果发现Her2阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的增殖能力明显受到抑制，而 且呈现明显的剂量效应关系。阳性对照LipofectamindOOO组也可以看到有明显的增殖抑 制，而Her2阴性的乳腺癌细胞的增殖能力没有明显影响。我们首先通过整个培养皿的细胞 计数进行检测，显示融合蛋白和PLKl-siRNA转染细胞之后可以抑制克隆的形成能力，克隆 形成率与对照组相比有明显大下降(图4)。接着，进行局部拍照可以更直观的看到细胞克 隆的密度和克隆的大小(图5)。图4是将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上共孵育后处理 乳腺癌细胞，显示Her2阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的克隆形成数量明显减少，而且 呈现明显的剂量效应关系，反映了增殖能力明显受到抑制，而Her2阴性的乳腺癌细胞的增 殖能力没有明显影响(*，P < 0.01 ；#, P < 0. 001)。图5是融合蛋白和PLKl-siRNA进行 冰上共孵育后处理乳腺癌细胞，进行局部拍照观察细胞克隆的密度和克隆的大小显示Her2 阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的克隆形成数量明显减少，形成的克隆也较小，证明细 胞的增殖能力明显受到抑制，而且呈现明显的剂量效应关系(*，P <0.01 ；#, P < 0. 001)， 但Her2阴性的乳腺癌细胞的增殖能力没有明显影响。由以上实验可见，F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA对Her2阳性乳腺癌细胞可 影响克隆的形成。实施例5 细胞种板转染做凋亡相关实验和细胞周期测定操作步骤如下1、人乳腺癌细胞SKBR3、BT 474和MDA-MB 231长满瓶底95%后用0. 25%胰酶消 化；2、将细胞悬液吹打均勻后进行计数，计算出每毫升悬液的细胞数；3、以每孔 70000 个 MDA-MB 231 细胞和 100000 个 SKBR3、BT 474 种入 24 孔板；4、细胞37°C培养24小时;5、吸去24孔板中培养液，PBS洗一次，加相应培养基500ul后继续培养；同时准备 转染物品。6、设定各处理因素并加入相应试剂；对照(优化培养基)、Lipofectamine2000+PLKlsiRNA、F5_Pl+PLKlsiRNA、 F5-P2+PLKlsiRNA、F5_P3+PLKlsiRNA、F5-P3、Free PLKlsiRNA 和 F5_P3+NC_siRNA7、各组混合液置冰上孵育30min ；8、把上述混合液加入相应的孔中；9、37°C培养6小时后换为普通培养基；10、细胞继续培养48h ；11、把细胞消化和收集到流式管中；12、PBS 洗两遍；13、将细胞悬液过50钼滤网；14、收集细胞做Armexin V/PI，实验方法按生产商提供标准方法；或收集细胞固定 于70%冰冻乙醇中过夜固定后性细胞周期检测。15、上机流式检测16、分析结果。
由于PLKl是细胞周期的一个关键的调控基因，该基因调控G2/M期的多个节点。因 此，实验设计研究导入PLKl-siRNA后细胞周期的改变和细胞的凋亡状况。以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上共孵育后 处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后收集细胞进行固定和随后染色进行细胞周期测定， 结果显示Her2阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞经过处理后细胞发生明显的G2/M期细 胞阻滞，而且随着融合蛋白的比例增多G2/M期的细胞有增多趋势(图6)，而Her2阴性的 乳腺癌细胞的增殖能力则没有受到明显影响。图6为将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上 共孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后收集细胞进行固定和随后染色进行细胞 周期测定，结果显示Her2阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞经过处理后细胞发生明显的 G2/M期细胞阻滞，而且呈现明显的剂量效应关系(*P < 0. 01)。接着，进一步检测Her2阳性的乳腺癌细胞的凋亡情况。以1 3，1 6和1 10 的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上共孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处 理后收集细胞进行Armexin V/PI流式检测的了解细胞的凋亡情况，结果发现Her2阳性的 乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的凋亡率明显升高，而且随着融合蛋白量加入比例的增加细胞 的凋亡率也有明显的增加趋势(*P < 0. 01)，而Her2阴性的乳腺癌细胞的凋亡率则与对照 组基本相同(图7-8)。图7为以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA 进行冰上共孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后收集细胞流式检测Armexin V/ PI，结果发现Her2阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的凋亡率明显升高，而且随着融合 蛋白量加入比例的增加细胞的凋亡率也有明显的增加趋势，而Her2阴性的乳腺癌细胞的 凋亡率与对照组比较基本相同。图8为以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和 PLKl-siRNA进行冰上共孵育后处理乳腺癌细胞，经过48小时的处理后收集细胞流式检测 Annexin V/PI，并对凋亡的细胞进行统计，结果发现Her2阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细 胞的凋亡率明显升高，而且随着融合蛋白量加入比例的增加细胞的凋亡率也有明显的增加 (*P < 0. 01)，而Her2阴性的乳腺癌细胞的凋亡率与对照组相比无明显差别。以上实验说明，F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA对Her2阳性乳腺癌细胞可产 生明显的细胞周期G2/M期阻滞和诱导细胞凋亡的作用。实施例6 细胞种板转染做免疫细胞化学TUNEL-P0D检测操作步骤如下1、人乳腺癌细胞SKBR3、BT 474和MDA-MB 231长满瓶底95%后用0. 25%胰酶消 化；2、将细胞悬液吹打均勻后进行计数，计算出每毫升悬液的细胞数；3、以每孔70000个的细胞数量种入已铺好预先用多聚赖氨酸处理盖玻片的24孔 板；4、细胞37°C培养24小时;5、弃掉24孔板中培养液，PBS洗一次，加含血清相应培养基500ul后继续放于孵 箱孵育；同时准备转染物品。6、设定各处理因素并加入相应试剂；对照(优化培养基)、Lipofectamine2000+PLKlsiRNA、F5_Pl+PLKlsiRNA、 F5-P2+PLKlsiRNA、F5_P3+PLKlsiRNA、F5-P3、PLKlsiRNA 和 F5_P3+NC_siRNA
7、冰上孵育30分钟。8、将相应的混合液加入24孔板各相应的孔中；9、37°C继续培养4-6小时；10、换用新鲜培养基；11、37°C继续培养至48小时；12、PBS 洗两次;13、加入4%多聚甲醛到准备处理的孔中固定20-30min ；14、PBS 洗两次；15,3% H2O2 室温下作用 IOmin ；16、PBS 洗两次；17,0. 1% Triton X-100 室温下处理 5min ；18、PBS 洗两次；19、加入TUNEL反应液；20、37 °C 下作用 60min ；21、PBS 洗两次；22、加入 TUNEL-P0D 在 37°C下作用 30min 液；23、PBS 洗两次；24、加入免疫组化DAB液显色2min ；25、流水冲洗；26、加入苏木素作用Imin ；27、流水冲洗终止；28、梯度酒精和二甲苯脱水透明；29、中性树胶封片；30显微镜下观察拍照。进行细胞爬片做免疫细胞化学检测TUNEL-P0D，进一步验证流式检测到的凋亡状 况。F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA处理乳腺癌细胞48小时后，将细胞固定后行免疫细胞化 学染色染色，结果与流式检测Armexin V/PI较为相似，同样显示Her2阳性的乳腺癌SKBR3 和BT 474细胞经过处理后细胞发生明显的凋亡，而且随着融合蛋白的比例增多凋亡细胞 明显增多(图9)，而Her2阴性的乳腺癌细胞的增殖能力则没有受到明显影响。图9为以 1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA进行冰上共孵育后处理乳腺癌 细胞，经过48小时的处理后收集细胞凋亡的细胞进行统计，结果发现Her2阳性的乳腺癌 SKBR3和BT 474细胞的凋亡率明显升高，而且随着融合蛋白量加入比例的增加细胞的凋亡 率也有明显的增加(*P < 0. 01)，而Her2阴性的乳腺癌细胞的凋亡率与对照组相比无明显 差别。实施例7 半定量 RT-PCR 法测定 SKBR3，BT 474 和 MDA-MB 231 细胞 PLKlmRNA 表 达情况实验步骤如下总RNA抽提1、人乳腺癌细胞SKBR3、BT 474和MDA-MB 231长满瓶底95%后用0. 25%胰酶消 化；
2、将细胞悬液吹打均勻后进行计数，计算出每毫升悬液的细胞数；3、以每孔500000个的细胞数量种入6孔板；4、细胞37°C培养24小时;5、弃掉6孔板中培养液，PBS洗一次，加含血清相应培养基2000ul后继续放于孵 箱孵育；同时准备转染物品。6、设定各处理因素并加入相应试剂；对照(优化培养基)、Lipofectamine2000+PLKlsiRNA、F5_Pl+PLKlsiRNA、 F5-P2+PLKlsiRNA、F5_P3+PLKlsiRNA、F5_P3alone、Free PLKlsiRNA 和 F5_P3+NC_siRNA7、冰上孵育30分钟。8、将相应的混合液加入6孔板各相应的孔中；9、37 °C继续培养4-6小时；10、换用新鲜培养基；11、37°C继续培养至24小时；12、将各组细胞培养液吸去，加Iml Trizol，用移液器反复吹打使贴壁细胞充分裂 解，移入1. 5ml离心管，冰上静止IOmin ；13、加 200 μ 1 氯仿，混勻，室温放置 5min, 12000rpm，4°C离心 15min ；14、可见上层水相，中间混合相，下层酚相。吸取水相，转至新Eppendorf管中，约 0. 5ml ；15、加等体积(0. 5ml)异丙醇，颠倒混勻，室温放置lOmin，12000rpm，4 °C离心 IOmin ；16、弃上清，可见白色沉淀，加入70%乙醇1ml，剧烈混勻，9000rpm，4°C离心5min， 洗涤2次；17、弃上清，RNA沉淀于空气中干燥5min ；18、将干燥后RNA溶解于DEPC处理水中，约20 μ 1 ；19、将总RNA作适当稀释后，分光光度计测0D. 260-0D. 280比值，并定量。20、定量公式RNA 浓度(μ g/mL) = 0D. 260 X 40 X 稀释倍数。逆转录反应1、各取2 μ g RNA经M-MLV逆转录酶系统合成cDNA第一链，反应总体积20 μ L，按 下列顺序在1. 5mL离心管中加入下列反应物(体积为12. 5 μ L):RNA 力口 DEPC 处理 /K 至-----------11 μ 1 Oligo (dT20) (ΙΟρΜ/
μ L)------------1 μ 1①在PCR仪70°C处理5min，迅速转移至冰上Imin ；②简短离心收集液体；③按下列顺序在1. 5mL离心管内加入下列反应物(加后总体积为20 μ L):RNA 抑制酶-------1 μ 15XRT 缓冲液----------4μ 1dNTP-----------------2 μ 1M-MLV---------------1 μ 1④PCR 仪 42 °C 反应 Ih ；
⑤99°C 处理 5min;⑥冰浴 5min ；⑦简短离心；⑧-20°C保存。PCR 反应PCR反应体系(总体积为50ul)灭菌水-----------------------41.5μ110XPCR------------------------5μ 1Taq 酶--------------------------0. 5 μ 1上游引物(up,10 μ mol/L)------0. 5 μ 1下游引物(down,10 μ mol/L)0. 5 μ 1模板(cDNA)--------------2 μ 11、扩增基因引物见材料和方法；PCR相关引物序列由TaKaRa合成GAPDH 的序列5' -TCCCATCACCATCTTCCA-3‘5 ‘ -CCATCACGCCACAGTTTCC-3PLKl 的序列5, -AAgAgATCCCggAggTCCTA-35 ‘ -TCATTCAggAAAAggTTgCC-3 ；2、温度条件以看家基因GAPDH作为内对照，GAPDH退火温度为56°C ；PLKl退火温 度为57°C ；a. 94°C--------------------3minb 94°C--------------------30sc. 57°C---------------------30sd. 72°C---------------------30se. 72 °C--------------------5min其中b、c、d三个步骤，GAPDH持续25个循环，PLK130个循环；3、上样取PCR扩增产物10μ 1+上样缓中液(6Χ)2μ 1，上样于1.0%琼脂糖凝胶 (内含0. 5 μ g/ml溴化乙锭)，在TAE缓冲液中，电泳时间20min，电压100V ；4、凝胶成像系统观察电泳结果并照相。实施例8 实时定量PCR法测定SKBR3，BT 474和MDA-MB 231细胞PLKlmRNA表达 情况总RNA的提取和反转录同上。PCR 反应PLK1PCR反应体系(总体积为20ul)灭菌水---------------------------------7. 2 μ 12 X SYBR Premix Ex Taq-----------10 μ 1PLKl-f (up,10ymol/l)--------------0. 4 μ 1PLKl-b (down, 10 μ mol/1)----------0. 4 μ 1模板(cDNA)----------------------2 μ 1
Beta-Actin PCR 反应体系(总体积为 20ul)灭菌水--------------------------------
7. 2 μ 12 X SYBR Premix Ex Taq-------Beta-Actin-f (up, 10μ mol/1) —Beta-Actin-b(down,10 μ mol/1)模板(cDNA)------------------
. 4 μ 1 —2 μ 1
10 μ 1 -0. 4 μ 11、扩增基因引物见材料和方法体外实验实时定量PCR引物序列由TaKaRa合成PLKISYBR green qRT-PCR 引物序列PLKl-f SYB 5' -AgCCTgAggCCCgATACTACCTAC-3‘PLKl-b SYB 5' -ATTAggAgTCCCACACAgggTCTTC—3‘Beta-Actin-f 5' -TGCTATCCAGGCTGTGCTA-3，；Beta-Actin-b :5， -ATGGAGTTGAAGGTAGTTT-3，.标准品引物序列PLK1-f 5' -TgCTCAAgCCgCACCAgA-3‘PLKl-b 5' -gggAgACgggCAgggATA-3‘2、温度条件以看家基因Beta-Actin PCR作为内对照，Beta-Actin PCR和PLKl 退火温度为60°C 采用两步法步骤I 预变性循环次数195 "C Imin步骤II:PCR反应循环次数4094 "C 15sec60 °C 3 Isec3、验结果分析反应结束后确认实时PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线。实施例9Western blot检测PLKl蛋白表达1、乳腺癌细胞SKBR3、BT 474和MDA-MB 231长满瓶底95%后用0. 25%胰酶消化；2、细胞悬液吹打均勻后进行计数，计算出每毫升悬液的细胞数；3、每孔500000个的细胞数量种入6孔板；4、胞37°C培养24小时；5、掉6孔板中培养液，PBS洗一次，加含血清相应培养基2000ul后继续放于孵箱 孵育；同时准备转染物品。6、定各处理因素并加入相应试剂；对照(优化培养基)、Lipofectamine2000+PLKlsiRNA、F5_Pl+PLKlsiRNA、 F5-P2+PLKlsiRNA、F5_P3+PLKlsiRNA、F5-P3、Free PLKlsiRNA 和 F5_P3+NC_siRNA7、冰上孵育30分钟。8、将相应的混合液加入6孔板各相应的孔中；
15
9、37°C继续培养4-6小时；10、换用新鲜培养基；11、37°C继续培养至48小时；12、将实验组和对照组准备处理的6孔板，PBS洗涤，加入50 μ 1的裂解buffer，超
声粉碎裂解；13、12000rpm 离心 IOmin ；14、把上清转移至新的EP管中，并取出少许进行蛋白浓度测定；15、根据测定的蛋白浓度决定上样量，以50ug为一个样品的上样量；16、吸取相应量的蛋白裂解液，加入5 X的Loading buffer变性液，PCR仪上变性 5分钟后上样；17、电泳用10% SDS-PAGE电泳，BIORAD电泳板，8 %浓缩胶80v，10 %分离胶 120v，约 2h ；18、转印硝酸纤维素膜和滤纸在转印液中平衡15min，然后遵循胶在负极，膜在 正极的原则，经45min 300ma的转印后；TBST洗2次，每次5分钟。封闭含2 % BSA封闭过夜。19、一抗孵育封闭后，转到含 β-actind 5000), PLKl (1 1000)—抗中过夜。20、二抗孵育TBST中洗3次，每次5分钟，转到HRP-标记的羊抗兔(或鼠) (1 5000)的二抗中，孵育1小时。21、TBS中洗3次后，PVDF膜平放在保鲜膜上，蛋白面向上。22、检测用ECL化学发光检测X-光片感光。混合A和B液。暗盒中X光片曝光， 显影5分钟，定影2分钟。23、凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照。统计分析均数间的比较用t检验，卡方检验比较率的差异。所有统计为双侧检验，P < 0. 05 为差异有显著意义。SPSS 12.0软件进行统计分析。由实施例7-9的结果，可知，F5-P融合蛋白靶向输送PLKl_siRNA对Her2阳性乳 腺癌细胞可在mRNA和蛋白水平下调PLKl基因的表达以1 3，1 6和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA冰上共孵育后处理 乳腺癌细胞，分别经过24小时和48小时的处理后收集细胞提取总RNA进行反转录和PCR， 并同时提取蛋白进行Western blot检测。检测结果显示融合蛋白和PLKl-siRNA共处理组 Her2阳性的乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的PLKl基因mRNA和蛋白表达水平明显低于对照 组，而且呈现明显的剂量效应关系。阳性对照Lipofectamine 2000组PLKl基因的mRNA和 蛋白表达水平也明显低于对照组，而Her2阴性的乳腺癌细胞的PLKl基因的表达则没有受 到明显影响(图10)。进一步用实时定量PCR的方法检测F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA到Her2阳 性乳腺癌细胞后PLKl基因mRNA表达改变，以证实RT-PCR和Westernblot检测的结果。在 实时定量PCR实验之前，我们先构建PLKl的标准品用标准品的引物PCR后，将产物与T载 体连接，最后行酶切和测序验证PLKl的标准品序列的正确性。接着我们仍以1 3，1 6 和1 10的摩尔比将融合蛋白和PLKl-siRNA冰上共孵育后处理乳腺癌细胞，经过24小时的处理后收集细胞提取总RNA进行反转录和第一链合成后行Real time PCR检测，结果显 示融合蛋白和PLKl-siRNA共处理组的Her2阳性乳腺癌SKBR3和BT 474细胞的PLKl基因 mRNA表达水平明显低于对照组，而且呈现明显的剂量效应关系。阳性对照Lipofectamine 2000组PLKl基因的mRNA和蛋白表达水平也明显低于对照组，而Her2阴性的乳腺癌细胞的 PLKl基因的表达则没有受到明显影响(图11-12)。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明 保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应 当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实 质和范围。序列表SEQ ID NO. 1<110>中山大学<120> 一种抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法及其应用<160>15<170><210>1<211>960<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). · · (960)<223>n = a 或 g 或 c 或 t<400>1atggcccaggtgcagctggtgcagtctggggcagaggtgaaaaagcccggggagtctctg60
aagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcgcctgggtgcgc120
cagatgcccgggaaaggcctggagtacatggggctcatctatcctggtgactctgacacc180
aaatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagtcgacaagtccgtcagcact240
gcctacttgcaatggagcagtctgaagccctcggacagcgccgtgtatttttgtgcgaga300
catgacgtgggatattgcagtagttccaactgcgcaaagtggcctgaatacttccagcat360
tggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggc420
tctggcggtggcggatcgcagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggcccca480
ggacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattatgta540
tcctggtaccagcagctcccaggaacagcccccaaactcctcatctatgatcacaccaat600
cggcccgcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctg660
gccatcagtgggttccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcctcctgggactac720
accctctcgggctgggtgttcggcggaggaaccaagctgaccgtcctaggtgcggccgca780
atggccaggtacagatgctgtcgcagccagagccggagcagatattaccgccagagacaa840
agaagtcgcagacgaaggaggcggagctgccagacacggaggagagccatgaggtgttgt900
cgccccaggt acagaccgag atgtagaaga cacagatctc atcatcacca ccaccattaa 960SEQ ID NO. 2<110>中山大学<120> 一种抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法及其应用<160>15<170><210>1<211>780<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . . (780)<223>n = a 或 g 或 c 或 t<400>2atggcccaggaagatctcctcagatgcccgaaatacagccgcctacttgccatgacgtggtggggccaggtctggcggtgggacagaaggtcctggtacccggcccgcaggccatcagtgaccctctcggSEQ ID NO. 3<110>中山大学<120> 一种抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法及其应用<160>15<170><210>1<211>153<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature
tgcagctggtgcagtctggggcagaggtgaaaaagcccggggagtctctg60gtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcgcctgggtgcgc120ggaaaggcctggagtacatggggctcatctatcctggtgactctgacacc180cgtccttccaaggccaggtcaccatctcagtcgacaagtccgtcagcact240aatggagcagtctgaagccctcggacagcgccgtgtatttttgtgcgaga300gatattgcagtagttccaactgcgcaaagtggcctgaatacttccagcat360gcaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggc420gcggatcgcagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggcccca480tcaccatctcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattatgta540agcagctcccaggaacagcccccaaactcctcatctatgatcacaccaat600gggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctg660ggttccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcctcctgggactac720gctgggtgttcggcggaggaaccaagctgaccgtcctaggtgcggccgca780<222>(1). . . (153) <223>n = a 或 g 或 c 或 t <400>3
ccagagacaa 60 gaggtgttgt 120
atggccaggt acagatgctg tcgcagccag agccggagca gatattaccg agaagtcgca gacgaaggag gcggagctgc cagacacgga ggagagccat cgccccBggt acagaccgag atgtagaaga cac153
<210>1 <211>23 <212>DNA
<213> 人工序列 PLKlsiRNA <222>(1). . . (23) <400>4
ugaagaagau cacccuccuu att23
<210>1 <211>23 <212>DNA
<213> 人工序列 PLKl siRNA <222〉(1)... (23) <400>5
Uaaggagggu gaucuucuuc att23
<210>1 <211>18 <212>DNA
<213>人工序列GAPDH <222>(1). . . (18) <400>6
tcccatcacc atcttcca18
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列GAPDH <222>(1). . . (19) <400>7
ccatcacgcc acagtttcc19
<210>1 <211>20 <212>DNA
<213>人工序列PLKl <222>(1). . . (20)
19
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权利要求
一种抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法，其特征在于，使用单链片段抗体 鱼精蛋白多肽的融合蛋白靶向输送肿瘤基因的siRNA，从而抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡。
2.根据权利要求1所述的抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法，其特征在于，所述 的单链片段抗体为Herf-ScFv。
3.根据权利要求2所述的抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法，其特征在于，所述 的单链片段抗体-鱼精蛋白多肽的融合蛋白的编码核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
4.根据权利要求2所述的抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法，其特征在于，所述 单链片段抗体-鱼精蛋白多肽的融合蛋白为靶向输送工具，以HER-2为靶标，输送针对肿瘤 恶性基因PLKl的siRNA。
5.根据权利要求1所述的抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法，其特征在于，所述 癌细胞包括Her2阳性乳腺癌细胞。
6.一种单链片段抗体_多肽融合蛋白，其特征在于，能用来抑制癌细胞的增殖和诱导 其凋亡。
7.根据权利要求6所述的单链片段抗体_多肽融合蛋白，其特征在于，所述的单链片段 抗体为 Her2-ScFv、EGFR-ScFv 或 CD44_ScFv。
8.根据权利要求6所述的单链片段抗体_多肽融合蛋白，其特征在于，所述的多肽为鱼 精蛋白片段多肽，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
9.一种能抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的药物，其特征在于，所述药物包含有效量 的权利要求6-8之一所述的融合蛋白和针对肿瘤基因的siRNA。
10.根据权利要求9所述的一种能抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的药物，其特征在 于，所述针对肿瘤基因的siRNA包括针对肿瘤恶性基因PLKl的siRNA。
全文摘要
本发明提供了一种抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法，使用单链片段抗体-鱼精蛋白多肽的融合蛋白靶向输送肿瘤基因的siRNA，从而抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡。本发明还提供了一种单链片段抗体-多肽融合蛋白和一种能抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的药物，该融合蛋白能抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡。该药物包含有效量的上述融合蛋白以及针对肿瘤基因的siRNA。本发明能把针对肿瘤基因的siRNA导入需要进行基因沉默的特定的细胞群内，加强治疗效果，使RNAi更有针对性，提高其基因沉默效应的同时减少副作用。有望从基因水平阻断癌基因的表达，更彻底地破坏癌细胞的增殖和转移信号传导机制，增强其对化疗药物的敏感性。
文档编号A61K47/42GK101897981SQ20091003980
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者姚燕丹, 宋尔卫, 张佩琢, 王均 申请人:中山大学;中国科学技术大学;上海吉玛制药技术有限公司