专利名称：一种可同时作为药物缓释体系的纳米人工硬脑膜及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种可同时作为药物缓释体系的纳米人工硬脑膜及其制备方 法，属于生物医学技术领域。
背景技术：
硬脑膜缺损在神经外科临床工作中常见，开放性颅脑损伤(工业、交通、 战争等)、肿瘤的侵蚀、先天性脑膜缺损及其它颅脑疾患原因均可引发硬脑膜 缺损。硬脑膜缺损需及时修补以防脑脊液外溢，防止脑的膨出和大气压的压迫， 否则将危及人体生命。硬脑膜缺损还能引发颅内感染、脑粘连、皮下积液等并 发症，经常会引起如癫痛、头痛、脑功能障碍等疾病。
目前硬脑膜的代用品虽有很多，修复硬脑膜的材料可分为自体筋膜、同 种异体材料、天然及人工合成材料、异种材料4类。目前市场上产品各有其优 缺点。
但这些材料在应用于临床时，都不可避免有临床感染率较高等缺陷。此外， 在因脑肿瘤侵蚀破坏脑膜而引起的脑膜修复手术中，尽管脑膜得到了修复，但 脑肿瘤复发率仍是居高不下。
感染可以用抗感染药物的预防应用控制，肿瘤的复发则可以用化疗药物治 疗，但这两者在应用于脑部时都面临一个问题，这就是血脉屏障的存在。
所谓血脑屏障，是由毛细血管形成的血浆与脑细胞外液间的屏障以及由脉 络膜形成的血浆与脑脊液间的屏障。此屏障对许多大分子或极性较高的药物是 不可通透的，难进入中枢神经系统。这种脑毛细血管阻止某些物质(多半是有 害的)进入脑循环血的结构，对血液中溶质进行选择性的通透，称为血脑屏障， 它可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环 境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。但 在临床上进行脑部疾病治疗时，也妨碍了许多药物到达脑部，或不能达到有效 的药物浓度，影响病程。
因此，针对脑部用药发展出多种给药方式。常见的注射给药方式有鞘内给药、静脉给药等。静脉给药由于血脑屏障的存在而难以达到预期效果；鞘内 给药是将药物溶液直接注入蛛网膜下腔，从而使药物在脑脊液中很快达到有效 和血药浓度，避免了血脑屏障对药物扩散至脑脊液中的影响。但很可能引起出 血、脊神经根损伤、感染等不良反应；进行相关研究较多的是鞘内用药和脑室 内给药，而脑室内给药由于其对脑组织的侵袭性操作，存在潜在的神经功能损 害的可能性，故在临床上很少应用。口服药物通常不能透过血脑屏障，难以达 到有效的浓度。
脑膜移植的感染率倍受关注，这是因为在颅脑敏感区，若有感染等并发症 出现，这些并发症可对中枢神经系统造成严重损害，因此通常都会采用预防用 药。由于脑膜移植手术复杂，目前脑膜移植手术，通常需要进行开颅手术，尽 管由于技术进步和积极预防，并采取了术前、术中、术后静脉预防性应用抗生 素及不断提高手术过程中的无菌条件等措施，但颅术后颅内感染目前在临床上 仍不少见，据我国一般统计，开颅手术的感染率为4%。且颅内感染一旦发生 较难控制，若处理不当可直接导致患者死亡，且病死率较高，占颅内感染的
20% 40%。因此，这一直是困扰神经外科医生的一个难题。已有的人工硬脑
膜在临床感染率等方面的表现不尽如人意。据文献报道以猪小肠黏膜为原料
制备的硬脑膜，其感染率在3.4%，而用胶原制备的脑膜，感染率在3.8%，也 另有文献报道在1.8%。因此，抗生素的预防性应用不可避免。而上述抗感染 药物，如抗生素等，正是对脑部组织用药，因血脑屏障的存在，静脉给药药物 难以在脑脊液中达到有效浓度，而鞘内给药则有引起出血、脊神经根损伤、感 染等不良反应的危险，这对于刚进行过脑膜移植手术的患者而言，无异于雪上 加霜。
此外，因脑肿瘤侵蚀破坏而进行脑膜移植修复手术是常见的脑膜修复原因 之一。脑肿瘤表现各异，但总体而言，其复发率较高，尤其是恶性脑肿瘤。手 术切除是脑肿瘤治疗的主要方式，而手术切除不全、肿瘤本身的侵袭性及肿瘤 内多生发中心等因素则是复发的主要原因。手术能否彻底切除病变是复发的关 键因素。脑肿瘤有一半以上不能彻底切除，因而手术之后通常还需要进行化疗 及放射治疗。但不同脑瘤对放射能的敏感度不同，有一定的适用范围。化学药 物治疗则因为许多化学药物毒性较大，尤其是由于血脑屏障的存在，化疗药物 不能通透血脑屏障，不能达到有效的浓度，因而影响治疗效果。而鞘内给药则有引起出血、脊神经根损伤、感染等不良反应的危险，这对于刚进行过脑膜移 植手术的患者而言，无异于雪上加霜。
己有的人工硬脑膜在临床感染率等方面的表现不尽如人意， 一般也不具有 抑制脑肿瘤复发的功能。据临床报道，人工脑膜的临床感染率在3%以上。针 对以上问题， 一个易于想到的解决方法就是在静电纺丝的过程中放药物。
目前的人工脑膜一般不含有治疗性药物。这主要是由于以下两个因素首 先根据人工脑膜来源的影响，自体筋膜根本不可能添加药物，同种或异体材料 亦不大可能，只有天然或人工合成材料才会进行此种加工。第二，受到药物添 加方式方法的限制。并非所有加工方式都可以顺利的固定于人工脑膜其材料 上，进而在脑膜移植后于体内释放，达到治疗的目的。目前这此天然或人工材 料制备人工脑膜的方法及加工步骤有喷涂，溶纺、高热处理、化学交联，等。 但这些方法都不可能将药物固定于其上。其抗感染药物的添加方法一般是用抗 感染药物浸泡，即在制备过程中将产品在抗生素溶液中浸泡，也是一种抗感染 药物的添加方法。但这种方法添加的药物绝大部分停留在人工脑膜基础材料的 表面，易于流失，也不能达到有效可控释放的目的。至于化疗药物，由于其毒 副作用比较大，药物剂量和时相控制严格，更不可能用上述方法添加。
但静电纺丝却可以有效的混合治疗药物，并可控释放。静电纺丝的最大优 势之一就是混纺，即将不同的材料混在一起制备成静电纺丝原液。静电纺丝原 液中不仅可以混合各种静电纺纳米纤维的支架材料——各种高分子聚合物，同 时还可以混有上述各种药物。这样通过混纺就可以将上述各种药物添加到人工 脑膜内，改善了人工脑膜的性能，取得更好的临床效果；而可降解的高分子聚 合物通过静电纺丝得到超细纤维同时也可作为药物缓释载体，调节其降解速 度，可对上述药物的释放速度进行调整。由于药物作用，可降低人工脑膜移植 的临床感染率，也对降低脑肿瘤的再发生率有重要意义。
应用静电混纺技术，不仅可以添加治疗性药物，也可以添加细胞因子，诸 如碱性成纤维细胞因子等，可加速硬膜化过程，促进脑膜完全修复。
总之，目前没有一种人工脑膜，可以在有效的混合药物的同时达到一般人 工脑膜要求的综合品质要求。这些综合品质要求包括可完全吸收、力学机械 性能好、生物组织相容性佳、防止脑粘连等。
发明内容
本发明的所要解决的技术问题是克服已有技术的不足，目的在于提供一种 不仅具有人工脑膜要求的一般综合品质要求，同时还能有效混合药物，可作为 药物释控体系、由于药物作用在临床上有降低脑膜移植手术感染发生率、脑肿 瘤复发率的纳米仿生人工硬脑膜。
本发明的另一目的是提供上述纳米仿生人工硬脑膜的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的-
一种可同时作为药物缓释体系的纳米人工硬脑膜，包含至少两层结构，面 向大脑的一层为疏水性的防粘连电纺层，背向大脑的一层为亲水性的纳米细胞 支架层；两层之间还可以有过渡层；所述人工硬脑膜的任何一层中还混纺有细 胞因子或药物；任意两个相邻层之间的连接方式优选通过电纺连接。
所述亲水性的纳米细胞支架层由静电纺制成，即背向大脑面的电纺层为细 胞支架层，是为了有效诱导干细胞及成纤维细胞的迁入，该层则采用采用生物 相容性好的亲水性材料，再者，通过静电纺丝参数调整，设计上将平均孔径达 到20 100)aM。这样有利于成纤维细胞的迁入、粘附、增殖和生长分化。
所述防粘连层是采用疏水性材料，不利于细胞的迁入，从而达到防粘连的 目的；制备该层材料的静电纺丝参数进行调整，其孔隙孔径在纳米以下，比细 胞小一到二个数量级，从而阻止细胞进入，防止脑粘连产生。因为人体细胞直 径平均在10 20一， 一般成纤维细胞直径在20 30pM之间。脑膜主要分布成 纤维细胞及其分泌的胶原纤维。平均孔径在3pM以下，已经可以有效的防止 脑粘连的产生。静电纺纤维得到的孔隙大小分布很大程度上依赖于纤维直径， 已知纤维直径减小时，孔径也在同时减小。据已发表的文献，纤维直径在 4 10pM时，孔径从20~45一。文献报道，静电纺再生丝素纤维非织造织物的 平均孔径可达到2piM。
所述细胞因子是对成纤维细胞的粘附、迁移、增殖、分化起作用的因子， 如碱性成纤维细胞生长因子。由于人工脑膜的主要作用是在硬膜再生之前起到 密封脑、防止脑脊液漏、保护脑的作用，纳米仿生支架已经为成纤维细胞的粘 附、迁移、增殖、分化提供了良好的支架，同时由于细胞因子的作用，加以加 速硬膜化的过程。本发明选用对硬膜化过程有促进作用的因子，如碱性成纤维 细胞因子。
所述药物可以依据具体情况选择抗生素或止血或防粘连药物，在因脑肿瘤侵蚀而引起脑膜移植中，可采用针对脑肿瘤的化疗药物。
所述的抗生素选自头孢类、苄氨西林，螺旋霉素，磺胺，喹诺酮类抗生素 等。首选为头孢曲松钠。因脑膜手术通常需要开颅，目前绝大多数的开颅术后 颅内感染是细菌性的，主要致病菌包括金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、 大肠杆菌、沙门菌属及绿脓杆菌等。其中金黄色葡萄球菌最常见，有报道为 70.6%。根据临床报道，多认为头孢曲松钠的临床治疗效果比较好。
所述抗肿瘤药物，可以选自多种抗肿瘤药物，如尼莫司汀、司莫司丁、脂 质体阿霉素、放线菌素D、长春新碱等。首选为长春新碱。
所述止血或防粘连药物，可加速创伤愈合，防止粘连产生。如止血因子 (可使材料同时具备止血功能)、胶原合成酶的抑制剂(如曲尼斯特和毗嗜司 特，可以抑制胶原合成酶组胺和前列腺素的释放，抑制胶原再生)、抗凝血药 (如双香豆素、肝素钠、水蛭素等)、消炎药(如异丙嗪、地塞米松、氢化可 的松、泼尼松龙、布洛芬、羟基保泰松等)、钙通道阻滞剂(如盐酸地尔硫卓、 硝苯地平、盐酸维拉帕米等)、细胞生长抑制剂(如氟尿嘧啶)、水解酶(如玻 璃酸酶、链激酶、尿激酶、胃蛋白酶、tPA)、氧化还原剂(如亚甲蓝)等等。
上述纳米仿生人工硬脑膜的制备方法包括以下步骤
(1) 制备含有细胞因子或药物的疏水性聚合物的电纺溶液；制备含有细 胞因子或药物的亲水性聚合物的电纺溶液；
(2) 用制得的疏水性聚合物的电纺溶液通过静电纺制成疏水性的防粘连 电纺层；
(3) 用制得的亲水性聚合物的电纺溶液在所述防粘连电纺层上通过静电 纺制备疏水性的细胞支架层，接收为膜状结构得到纳米仿生人工硬脑膜。
上述步骤(1)中所述制备含有细胞因子或药物的亲水性聚合物的电纺溶 液也可以在步骤(2)和步骤(3)之间进行；
所述(2)、 (3)可重复若干次以得到合适的厚度。
所述防粘连层的静电纺的工艺参数为微量注射泵的速率为0.1~5.0毫升 /小时，高压发生器的电压为5 40KV,接收距离为5.0 30.0厘米。细胞支架 层的静电纺的工艺参数为0.5-20.0毫升/小时，调节高压发生器的电压为 10 45KV，调节接收装置的接收距离为5.0 30.0厘米。 ■制得的人工硬脑膜经清洗、灭菌、包装后贮存。所述疏水性的电纺溶液可选择疏水性的L-聚乳酸和S-己内酯，两者重量比
为50: 50或30:70或70:30，作为共聚高分子材料，数均分子量是 150000-500000，溶于六氟异丙醇或二氯甲烷；可甩8 14%的聚己内酯的氯仿/ 甲醇混合溶液；或者其他合适的聚合物及溶剂。
上述电纺溶液中可以加入0.01~3%抗生素溶液，或/和0.001 3%止血和防 粘连药物，与L-聚乳酸和s-己内酯溶液混合，得到均一溶液。
将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.1-10 毫升/小时，调节高压发生器的电压为10 45 KV，调节接收装置的接收距离 为10 40厘米，并将纤维接收为膜状结构。
此处通过静电纺制备得到纤维直径平均孔径在3pM或以下，纤维直径在 50-1000nM之间。
所述亲水性的电纺溶液选择的亲水性材料作制备细胞支架层，可以选用亲 水性聚氨酯或者天然明胶、纤维素、壳聚糖、硫酸软骨素等亲水性材料；优选 的方案亲水性聚氨酯，与/或天然明胶，硫酸软骨素、聚乙二醇，重量比20~80: 80~20，纺丝液为溶液总重量的3~15%;或者用亲水性聚氨酯与天然明胶，或 硫酸软骨素，重量比20 80: 80~20，纺丝液为溶液总重量的3~15%;也可选 用其他合适聚合物及溶剂。
上述亲水性聚合物电纺溶液中还可加入碱性成纤维细胞因子溶液，与上述 电纺液混合均匀，使细胞因子终浓度达为0.001 0.5%，接收距离从15 25cm， 电压15 45KV，亲水性的纳米细胞支架层孔径为20 200^iM。纳米细胞支架层 纤维直径介于5-200pM，在已纺好的防粘连层上继续纺细胞支架层。
所述电纺溶液是一种或两种以上聚合物混合的电纺溶液，亲水性聚合物材 料选自硫酸软骨素，肝素，琼脂，葡聚糖、褐藻酸、改性纤维素、海藻酸、淀 粉、纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、胶原蛋白、 壳聚糖、改性壳聚糖、亲水性聚氨酯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲 基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚乙烯醇或聚丙交酯； 疏水性聚合物材料选自疏水性聚氨酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚已内酯、聚乙交 酯或聚对苯二甲酸乙二酯。由于目前高分子材料改性研究在不断发展，原本亲 水性材料改性为疏水或疏水材料改性为亲水都越来越常见，范围也越来越广。
将上述材料溶于一定的溶剂，形成电纺液，就可以通过静电纺丝技术制得纳米仿生支架。
所述电纺溶液的溶剂可以为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二 甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲垸、三 氯甲垸、甲醇、乙醇、氯仿、二噁垸、三氟乙垸、三氟乙酸、水或它们的任意 混合物。上文所述的高分子材料和溶剂用于静电纺丝，这类报道在已有的文献 中有相当多的数量。
所述电纺溶液加入了细胞因子、抗生素或止血/防粘连药物。
所述细胞因子是对成纤维细胞的粘附、迁移、增殖、分化起作用的因子， 如碱性成纤维细胞生长因子。由于人工脑膜的主要作用是在硬膜再生之前起到 密封脑、防止脑脊液漏、保护脑的作用，纳米仿生支架己经为成纤维细胞的粘 附、迁移、增殖、分化提供了良好的支架，同时由于细胞因子的作用，加以加 速硬膜化的过程。碱性成纤维细胞因子是目前公认的可以诱导成纤维细胞生长 增殖并加速硬膜化过程的细胞因子，其它如白细胞介素，集落剌激因子，TNF、 血小板源生长因子等细胞因子也有文献报导，有加速脑硬膜化过程的作用。所 述止血或防粘连药物、抗感染药物或抗肿瘤药物，选自止血因子、曲尼斯特、 放线菌素D、尼莫司汀、长春新碱、氨苄西林等。止血药物可以起到迅速止血， 加快愈合，而防粘连药物则可进一步减少脑粘连的产生。因为硬脑膜的修复在 很多情况下是因为脑肿瘤而导致的，而脑肿瘤的复发将导致硬脑膜的再次损 伤。在静电纺电纺溶液中加入抗肿瘤药物如放线菌素D、尼莫司汀等都可以降 低脑肿瘤的复发率。在因脑肿瘤而导致的硬脑膜修复手术中，加入这类药物可 大大降低脑肿瘤的复发率。抗感染药物可选自抗生素，如氨苄西林，螺旋霉素， 磺胺，喹诺酮类抗生素等可防止细菌感染，在临床上可降低脑膜移植的感染率。
所述电纺溶液中添加药物或因子的优选方案是含有电纺溶液重量的
0.001~0.05%的碱性成纤维细胞成长因子，电纺溶液重量的3%的节氨西林，电 纺溶液重量的0.001~0.05%的止血因子，在用于因脑肿瘤而导致的脑膜修复手 术中，可以包含有0.01-5%的尼莫司汀。
制得的产品经清洗、灭菌，包装后贮存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
(1)本发明不但具有用静电纺丝技术制备的人工硬脑膜的一般优点，，还 有单纯用静电纺丝所不具有的其它有益效果。用静电纺丝技术制备的人工硬脑膜的具有多种一般优点，这些优点包括a机械特性能满足适应症对抗拉伸强 度及柔韧性的要求。b双层设计，内侧面(即面向大脑的一面)光滑，能防粘 连，能起着很好地隔离头皮软组织与脑组织的作用，外侧面(即背向大脑的一 面)和侧边则为多孔结构，允许细胞长入；可促使脑膜早日修复。利于日后进 行颅骨修复手术;c能够在新生组织生成后被完全吸收的，避免了膜片致癌；d 不含活细胞成分，不使用外源细胞和蛋白，免除了因此而带来免疫排斥、病毒 传播、疾病传染的诸多风险；能杜绝疾病传播；e材料来源充分，成本较低， 贮存运输简单；f制备方法工艺步骤简化，生产时间短，能有效避免加工过程 中产品受到污染，产品质量易于控制，产品标准容易实现，产品可实现低成本、 高效率的产业化生产；临床应用简单。
(2) 本发明还利用将碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子等细 胞因子按设计要求混纺于电纺液中，细胞因子与纳米支架结合，纳米支架同时 作为细胞因子缓释控制体系，细胞因子可控释放，形成有利于成纤维细胞迁移、 聚集、分化的微环境，吸引成纤维细胞进入硬脑膜缺损部位，并聚集、分化， 加速了硬膜化过程；与没有加入细胞因子的人工脑膜相比，其过程大为縮短。
(3) 本发明也可以用混纺技术添加治疗药物。用混纺技术加入了药物的 人工脑膜，比单纯利用静电纺丝技术的人工脑膜，可有效防止感染、防粘连、 防脑肿瘤复发。此种效应与没有加入药物的人工脑膜相比，其感染率大为降低， 脑粘连发生率和脑肿瘤复发率大为降低。这种明显的区别是应用混纺技术比单 纯应用静电纺技术的优势所在。
图1为电紡混纺药物及生长因子的人工脑膜结构示意图，其中1为细胞支 架层，2为碱性成纤维细胞因子，3为止血和防粘连药物，4为抗生素，5为防 粘连层。
图2为电纺混纺药物的人工脑膜结构示意图，其中1为细胞支架层，3 为止血和防粘连药物，4为抗生素，5为防粘连层。
图3为电纺混纺生长因子的人工脑膜结构示意图，其中1为细胞支架层， 2为碱性成纤维细胞因子，5为防粘连层。
图4为电纺混纺化疗药物的人工脑膜结构示意图，其中1为细胞支架层， 5为防粘连层，6为化疗药物。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。所涉及到的浓度如 未特别注明均为重量百分比浓度。 实施例l
(1) 制备防粘连层选择疏水性的聚已内酯，氯仿/甲醇混合溶剂比例为 1: l，混合头孢曲松钠，浓度为1%。混合止血药物异丙嗪，至终浓度为10mg/ml。
得到均一溶液。
将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫 升/小时，调节高压发生器的电压为12 KV，调节接收装置的接收距离为15 厘米，并将纤维接收为膜状结构。得到纤维直径为600纳米。
关闭静电装置。
(2) 制备细胞支架层用亲水性丝素与天然明胶，比例20 80: 80~20， 纺丝液质量分数为9%。
配制碱性成纤维细胞因子溶液，与上述电纺液混合均匀，使细胞因子终浓 度达为0.001%，接收距离10cm，电压20KV，开启静电纺丝，在已纺好的防 粘连层上继续纺细胞支架层，纤维平均直径在微米级。制得的人工硬脑膜的结 构如图1所示，图1为电纺混纺药物及生长因子的人工脑膜结构示意图，其中 l为细胞支架层，2为碱性成纤维细胞因子，3为止血和防粘连药物，4为抗生 素，5为防粘连层。
将制得的人工脑膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗5遍，经冻干后真空包 装，经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。 实施例2
(1) 制备防粘连层选择疏水性的聚已内酯，氯仿/甲醇混合溶剂比例为
1: l，混合头孢曲松钠，浓度为1%。混合止血药物异丙嗉，至终浓度为10mg/ml。 将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫 升/小时，调节高压发生器的电压为12 KV，调节接收装置的接收距离为15 厘米，并将纤维接收为膜状结构。得到纤维直径为600纳米。 关闭静电装置。
(2) 制备过渡层本实施例选用以下方案聚氨酯与透明质酸的质量比
为70:30,纺丝液质量分数为10%。混合氨苄西林，浓度为3°/。。得到均一溶液。开启静电纺丝，在已纺好的防粘连层上继续纺过渡层。
接收距离从llcm，电压20KV，纤维平均直径在5jim。 关闭静电纺。
(3)制备细胞支架层用亲水性丝素与天然明胶，比例20 80: 80 20， 纺丝液质量分数为9%。
配制长春新碱溶液，与上述电纺液混合均匀，使其终浓度为100ng/ml。得 到均一溶液。接收距离10cm，电压20KV,开启静电纺丝，在已纺好的过渡 层上继续纺细胞支架层，纤维平均直径在微米级。制得的人工硬脑膜结构如图 2所示，图2为电纺混纺药物的人工脑膜结构示意图，其中1为细胞支架层，3 为止血和防粘连药物，4为抗生素，5为防粘连层。
清洗、保存方式同实施例l。此人工脑膜应用于因脑肿瘤侵蚀而进行的脑 膜修复手术中。 实施例3
(1) 制备防粘连层选择疏水性的聚已内酯，氯仿/甲醇混合溶剂比例为 1: 1，混合头孢曲松钠和，浓度为1%。混合止血药物异丙嗪，至终浓度为 10mg/ml。 得到均一溶液。
将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫 升/小时，调节高压发生器的电压为12 KV，调节接收装置的接收距离为15 厘米，并将纤维接收为膜状结构。得到纤维直径为600纳米。
关闭静电装置。
(2) 制备细胞支架层用亲水性丝素与天然明胶，比例20 80: 80~20， 纺丝液质量分数为9%。
将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，接收距离10cm，电压20KV, 开启静电纺丝，在已纺好的防粘连层上继续纺细胞支架层，纤维平均直径在微 米级。制得的人工硬脑膜结构如图2所示。
将制得的人工脑膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗5遍，经冻干后真空包 装，经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。 实施例4
(1)制备防粘连层选择疏水性的聚已内酯，氯仿/甲醇混合溶剂比例为
h 1。将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫
升/小时，调节高压发生器的电压为12 KV，调节接收装置的接收距离为15 厘米，并将纤维接收为膜状结构。得到纤维直径为600纳米。 关闭静电装置。
(2)制备细胞支架层用亲水性丝素与天然明胶，比例20 80: 80 20， 纺丝液质量分数为9%。
配制碱性成纤维细胞因子溶液，与上述电纺液混合均匀，使细胞因子终浓 度达为0.001%，接收距离10cm，电压20KV，开启静电纺丝，在已纺好的防 粘连层上继续纺细胞支架层，纤维平均直径在微米级。制得的人工硬脑膜结构 如图3所示，图3为电纺混纺生长因子的人工脑膜结构示意图，其中1为细胞 支架层，2为碱性成纤维细胞因子，5为防粘连层。
将制得的人工脑膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗5遍，经冻干后真空包 装，经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。 实施例5
(1) 制备防粘连层选择疏水性的聚已内酯，氯仿/甲醇混合溶剂比例为
h 1。
将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫 升/小时，调节高压发生器的电压为12 KV，调节接收装置的接收距离为15 厘米，并将纤维接收为膜状结构。得到纤维直径为600纳米。
关闭静电装置。 '
(2) 制备细胞支架层用亲水性丝素与天然明胶，比例20 80: 80 20， 纺丝液质量分数为9%。
配制长春新碱溶液，与上述电纺液混合均匀，使其终浓度为100ng/ml。得 到均一溶液。接收距离10cm，电压20KV，开启静电纺丝，在已纺好的过渡 层上继续纺细胞支架层，纤维平均直径在微米级。制得的人工硬脑膜结构如图 4所示，图4为电纺混纺化疗药物的人工脑膜结构示意图，其中l为细胞支架 层，5为防粘连层,6为化疗药物。
将制得的人工脑膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗5遍，经冻干后真空包 装，经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。 实施例6用实施例1制备的硬脑膜进行犬动物实验
实验犬体重15 20KG,年龄1.5 2岁，雌雄不拘，共5只。以氯胺酮肌 肉注射全麻，麻醉剃毛后，将动物置于专用手术台上，腹卧位。用2%碘酒和 75%酒精消毒。动物头顶正中，纵向切开。用剥离器分离骨膜，暴露双顶部颅 骨板，用高速磨钻磨开颅骨，双顶部形成骨窗。用小剪刀剪掉双侧顶部3 cmx3cm大小的矩形硬脑膜，制造出顶部的硬脑膜缺损。在暴露的脑表面电灼， 造成6个1 mmxl mm大小的损伤点。将用本发明实施例1所制备的人工脑膜 修剪成相应形状及尺寸的修补材料，防粘连层向脑表面，用4/0无损伤丝线 间断缝合，针距4mm，修补于犬顶部的缺损。用圆针4号丝线缝合肌肉。术 后对动物进行常规的喂养及观察。术后动物恢复良好，切口愈合良好，无脑脊 液漏，无癫痫发生。术后进食进水正常，动物的户外活动正常，没有发现运动 障碍，存活至预定期限。
术后15个月，动物以手术部位为中心，在大于手术部位lcm范围切取标 本，使其包括人工脑膜及周边硬脑膜及内面的脑组织。切取出标本后，可见人 工脑膜与硬脑膜的连接处对合平整，无分界，已完全愈合，仅见缝合的丝线。 原生硬脑膜之间未见明显充血，出血等排异反应。 实施例7
用实施例2制得的硬脑膜进行新西兰兔动物实验
实验的动物施行顶部开颅，人为制造部分硬脑膜缺损及脑组织损伤，然后 以人工脑膜分别实施硬脑膜修补术。术后对动物进行常规的喂养及观察。术后
动物恢复良好。术后15个月，动物以手术部位为中心，在大于手术部位lcm 范围切取标本，使其包括人工脑膜及周边硬脑膜及内面的脑组织。切取出标本 后，可见内侧表面可见上皮细胞覆盖，上皮下可见纤维组织增生，纤维母细胞 增生，胶原纤维增多，致使材料内带血运的新生组织增生，宿主新生组织侵入， 材料降解，总量明显减少，内部可见毛细血管。新老组织界面无中性粒细胞， 淋巴细胞等炎症细胞反应，界面处无囊壁形成。蛛网膜及脑组织正常。 实施例8
用实施例2制得的硬脑膜进行新西兰兔分组动物实验。取200只新西兰兔 分为两组，每组各100只。如实施例4进行人工脑膜移植实验。第一组修补所 用的人工脑膜为仅用高分子材料静电纺丝所得，没有混入药物或细胞因子。第二组用本发明所制备的、混纺了抗生素药物和细胞因子的人工脑膜。
术后观察。第一组术后四周内，有2只动物出现感染，有局部红肿和积液 现象。经抗菌素治疗后痊愈。第二组实验动物术后四周内无感染现象出现。 术后15个月解剖结果如下第一组实验动物的人工硬脑膜开始胶原化，不与 脑组织粘连。内部尚无毛细血管生成。第二组实验动物人工硬膜与脑组织接触 面胶原化，不与脑组织粘连。内表面被上皮覆盖。内部可见毛细血管。无炎症 类细胞反应。厚度减小。
权利要求
1.一种可同时作为药物缓释体系的纳米人工硬脑膜，其特征在于包含至少两层结构，面向大脑的一层为疏水性的防粘连电纺层，背向大脑的一层为亲水性的纳米细胞支架层；所述人工硬脑膜的任一层中还混纺有细胞因子和/或药物。
2. 如权利要求1所述的纳米仿生人工硬脑膜，其特征在于所述防粘连电 纺层和亲水性的纳米细胞支架层还有过渡层。
3. 如权利要求1或2所述的纳米仿生人工硬脑膜，其特征在于所述亲水 性的纳米细胞支架层由静电纺制备得到，孔径为20 200^M，纤维直径在 5 200jiM之间，防粘连层纤维直接介于50~1000nM之间。
4. 如权利要求1或2所述的纳米仿生人工碗脑膜，其特征在于所述防粘 连电纺层孔径在3pM以下，纤维直径在50~1000nM之间。
5. 如权利要求1或2所述的纳米仿生人工硬脑膜，其特征在于所述细胞 因子选自对硬膜化过程有促进作用的细胞因子。
6. 如权利要求5所述的纳米仿生人工硬脑膜，其特征在于所述对硬膜化 过程有促进作用的细胞因子选自白细胞介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、 血小板源生长因子或碱性成纤维细胞因子中任一种或几种。
7. 如权利要求1或2所述的纳米仿生人工硬脑膜，其特征在于所述药物 是抗生素、止血药物、防粘连药物或抗肿瘤药物的一种或药学常规可混合使用 的几种药物的混合物。
8. —种权利要求1所述可同时作为药物缓释体系的纳米人工硬脑膜的制 备方法，包括以下步骤(1) 制备含有细胞因子或药物的疏水性聚合物的电纺溶液；制备含有细 胞因子或药物的亲水性聚合物的电纺溶液；(2) 用制得的疏水性聚合物的电纺溶液通过静电纺制成疏水性的防粘连 电纺层；(3) 用制得的亲水性聚合物的电纺溶液在所述防粘连电纺层上通过静电 纺制备疏水性的细胞支架层，接收为膜状结构得到纳米仿生人工硬脑膜。
9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述含有细胞 因子或药物的亲水性聚合物的电纺溶液的制备在步骤(2)和步骤(3)之间进行。
10.如权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于所述防粘连层的静电 纺的工艺参数为微量注射泵的速率为0.1~5.0毫升/小时，高压发生器的电压为5~40 KV，接收距离为5.0 30.0厘米；细胞支架层的静电纺的工艺参数为-0.5~20.0毫升/小时，调节高压发生器的电压为10~45 KV，调节接收装置的 接收距离为5.0-30.0厘米。
全文摘要
本发明提供了一种可同时作为药物缓释体系的纳米人工硬脑膜，包含至少两层结构，面向大脑的一层为疏水性的防粘连电纺层，背向大脑的一层为亲水性的纳米细胞支架层；所述人工硬脑膜的任一层中还混纺有细胞因子和/或药物。本发明还提供了所述纳米仿生人工硬脑膜的制备方法。本发明用混纺技术加入了药物和细胞因子的人工脑膜，比单纯利用静电纺丝技术的人工脑膜，可有效防止感染，更快的促进人工脑膜的再生过程。同时，本发明也为治疗脑部疾病提供了一种新型药物加载及释放方式，载入的药物可随着硬脑膜的植入而直接和高效输送进入脑颅腔并按要求进行释放，达到良好的治疗效果，应用前景十分广阔。
文档编号A61L27/56GK101559242SQ20091003968
公开日2009年10月21日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者弢 徐, 袁玉宇 申请人:广州迈普再生医学科技有限公司