诱导dna缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：诱导dna缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用。
技术背景 ，
DNA分子从伸展态到紧缩态的构象转变称为DNA缩合。在病毒和真核细 胞的细胞核内，高度缩合且高度有序排列的DNA结构保持了基因组的稳定性, 使复制得以顺利完成。细胞中聚胺(polyamine)通过静电相互作用与DNA结 合,促使了这种紧密堆积状态的形成。DNA缩合不仅是自然界常见的生理现 象，也是介导基因转染的关键步骤。病毒基因载体虽然是较有效的DNA传递 工具，传递效率一般在90%以上，约有75%的基因治疗应用了病毒载体介导系 统，但该系统存在局限性即病毒性和免疫原性限制其广泛应用，其次，该系 统的DNA装载量有限，载体组装难度大，花费高。和病毒载体相比，非病毒 载体具有安全、有效、无免疫原性等优点。从上世纪60年代中期开始，由多 价阳离子和聚阳离子诱发的DNA体外缩合就受到了广泛的关注。据报道,，聚 胺、阳离子脂质体、带正电的多肽、蛋白质、阳离子表面活性剂以及无机阳离 子都可以引起DNA缩合。迄今为止，多数化合物主要是通过所带正电荷与DNA 骨架上的负电荷之间的静电作用导致DNA缩合。近来研究发现，通过链接一 些具有刚性平面结构的有机基团到载体，利用基团与DNA双螺旋结构的嵌插 作用，可以有效地促进载体诱导DNA缩合的形成效率。但是已知的非病毒载 体如聚胺、阳离子脂质体和阳离子表面活性剂具有不易被吸收及难排泄等缺 点。

发明内容
本发明的目的是针对已有技术的不足，提供了高稳定性、低毒性、光物理 性质丰富、容易吸收并在体内能很快排泄的钌多吡啶配合物。 本发明的另 一 目的是提供上述配合物的制备方法。 本发明还有一个目的是提供上述配合物的应用。
i秀导DNA缩合的钌多吡啶配合物，是由钌与辅助配体和主配体配合而成，所述辅助配体为2，2-联吡啶(用英文表示为bpy)，所述主配体为1， 2-二(咪唑 并[4, 5-幻[1, 10-邻菲咯啉])苯(用英文表示为obpibH2 )或1, 2-二(咪唑并[4， 5-f][1, 10-邻菲咯啉])萘(用英文表示为obnibH2)。
本发明钌与bpy和obpibH2的配合物的阳离子部分的4匕学结构如式I所
示
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本发明钌与bpy和obnibH2的配合物的阳离子部分的化学结构如式II所
示
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本发明的配合物的阴离子部分优选为高氯酸根离子，也可以是不影响本发 明配合物化学性质的其他阴离子。
本发明的钌多吡啶配合物是含咪唑和1,10-邻菲咯啉基团的多吡啶类衍生 物配体的双核钉多吡啶配合物，和单核金属配合物相比，双核金属配合物具有更大的电荷数，构型和大小也更具可变性，可以进一步增强配合物对DNA的
亲和力和i秀导DNA缩合。
本发明还提供所述钌多吡啶配合物的制备方法，步骤如下 将钌和辅助配体的配合物二(2,2'-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体化合
物溶解于乙二醇，加热反应，冷却后加水稀释，再NaC104饱和溶液即产生沉
淀，过滤后沉淀依次用水、乙醚洗涤后干燥，即得。 干燥后的粗产品可经氧化铝柱色谱分离提纯。
所述加热反应的优选温度为120 160°C,同时用氩气保护更有利于配合物 的制备，反应时间8~12小时反应进行较为充分。
本发明的钌配合物能应用于新型基因药物载体的设计或制备领域中。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明的钌多吡啶配合物具有高稳定性、低毒性、光物理性质丰富、'容易 吸收并在体内很快排泄等特点，本发明提供的双核钌多吡啶配合物，通过静电 结合和嵌插结合共同作用导致DNA缩合，并且在较强的盐离子浓度(如人体 生理盐浓度150 mM NaCl)下依然能诱导DNA缩合，该类化合物目前在国 内外还未见相关文献报道，为设计、制备非病毒基因载体提供了一种新的方法 和途径。与现有技术中典型的无机阳离子[Co(NH3)6产相比，本发明的化合物 诱导DNA缩合的能力大大增强([Co(NH3)6产诱导DNA缩合的浓度大约为 lmM，本发明的化i合物诱导DNA缩合的浓度大约为lOpM)。
本发明的钌多吡啶配合物，合成简单，结构稳定，具有良好的光电性质和 强的DNA的亲和力，可以诱导DNA缩合成纳米粒子。本申请书中的化合物 属于首例能诱导DNA缩合的双核钌多吡啶配合物。与以往的经典的阳离子缩 合剂相比，该新型DNA缩合试剂具有更强的缩合能力，及生理盐浓度下(150 mM NaCl)该新型DNA缩合试剂缩合能力不受盐离子浓度效应影响。


图1为配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2广诱导pBR322DNA缩合的凝胶 电-泳实一险图2为配合物
4+诱导pBR322 DNA缩合的凝 胶电泳实验图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。 实施例1
1. 配体1, 2-二(咪唑并[4, 5-f][l, 10-邻菲咯啉])苯(obpibH2)的制备
将0.34 g, 2.0 mM计量摩尔比的1, 2-邻苯二曱酸(o-phthalic acid)和0.86 g, 4.1 mM的1, 10-菲咯淋-5, 6-二胺(1,10-phenanthroline-5,6-diamine)混合溶解于 多聚磷酸，在氩气保护条件下和200。C加热回流6小时。冷却到室温，用水稀 释并加25o/。氨水中和，得深绿色沉淀，收集沉淀，真空干燥，产率62%。元素 分析C32HuN8，实验值C, 74.54; H, 3.27; N, 22.24%;理论值C， 74.70; H， 3.53; N， 21.78。 FAB-MS:m/z = 516(M+l).
2. 配体1, 2-二(咪唑并[4, 5-幻[l, 10-邻菲咯啉])萘(obnibH2)的制备 方法如1,用0.43g， 2.0 mM的1， 2-邻萘二甲酸与0.86 g， 4.1 mM的1, 10-菲咯啉-5, 6-二胺反应 ， 得绿色固体，产率52%。元素分析C36H2oN8，实验值C, 76.82; H, 3.27; N, 19.62%。理论值C, 76.58; H, 3.57; N, 19.85。 FAB-MS:m/z = 566 (M+l).
3. 诱导DNA缩合的钌多吡咬配合物的制备
(1) [(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2的制备
钌和辅助配体的配合物二(2,2'-联吡啶)-二氯-二水合钌(11)(0.31 g, 0.58 mM) 和主配体obpibH2 (0.15g, 0.29 mM)溶解于乙二醇，加热至120。C氩气保护下反 应12小时后，得到暗红色清夜，冷却至室温，加水稀释后，加入NaC104饱和 溶液即产生大量红色沉淀，抽滤，用水，乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗 产品经氧化铝柱色谱分离提纯，产率及元素分析如下(C104)2:产率70%。
元素分析C72H50N16Cl4O16Ru2,实验值C, 50.05; H, 3.0; N， 12.60 %, 计 算值C, 49.72; H; 2.90; N, 12.89, NMR (DMSO-1/6): 9.18 (s， 2H)， 9.02 (d, 4H), 8.87 (d， 4H), 8.83 (d, 4H), 8.20 (t， 4H), 8.08 (t, 4H)， 7.98 (d, 4H)， 7.85 (d, 4H), 7.81 (t， 4H), 7.61 (d, 4H), 7.60 (t, 4H)， 7.52 (t, 2H), 7.38 (t， 4H), ES-MS [CH3CN, m/z〗 771.5 ([M - 2C104]2+), 480.7 ([M - 3C104]3+), 720.5 ([M - 3C104-H]2+)， 447.7([M -4C104-H]3+), 335.8 ([M - 4C104]4+)。
(2 ) [(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](C104)2的制备
钌和辅助配体的配合物二(2，2'-联吡啶)-二氯-二水合釘(II) (0.31 g, 0,58 mM)和主配体obnibH2 (0.16g， 0.29 mM)溶解于乙二醇，加热至120匸氩气{呆护下反 应]2小时后，得到暗红色清夜。冷却至室温，加水稀释后，加入NaC104饱和 溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水，乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗 产品经氧化铝柱色谱分离提纯，产率及元素分析如下 [(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](C104)2:产率68%。
元素分析C76H52N16Cl4016Ru2,实验值C, 51.25; H, 3.0; N， 12.20 %,计算 值C, 51.02; H, 2.93; N, 12.53，H NMR (DMSO-d6) :9.18 (s， 2H)， 9.02 (d， 4H)， 8.87 (d, 4H)， 8.83 (d， 4H), 8.20 (d， 4H), 8.08 (t, 4H), 7.98 (d, 4H)， 7.91 (t, 2H), 7.85 (d， 4H)， 7.83 (d, 4H), 7.61 (d, 4H),7.60 (t， 4H), 7.52 (t， 2H)， 7.38 (t, 4H)， ES-MS [CH3CN, m/z]: 795.2 ([M — 2C104f+)， 497.0 ([M — 3C104]3+), 744.9 ([M — 3C104-H产)，463.5 [M— 4C104-H]3+), 347.9 ([M — 4C104]4+)。 实施例2 钌多吡咬配合物诱导DNA缩合的表征 (1)琼脂糖凝胶电泳实验
向含有相同量的pBR322 DNA(5 ng/^L)的溶液中加入不同量的钌多吡啶配 合物的溶液(O， 9, 13， 18, 27, 36, 45， 54 or 63 ng/pL)，混合均匀，加入緩冲液(50 mM Tris, 18 mM NaCl buffer, pH 7.2)使反应液的最终体积保持在10|iL。将反应 混合物静置于黑暗的环境中30分钟，然后加入2iiL溴酚蓝緩冲终止液。上样 至1%琼脂糖凝胶板。在TBE中以卯V电泳1.5小时。以l叫/mL的EB染色 液染色30分钟，用Alpha Innotech IS-5500化学荧光成l象分析系统记录电泳图 片，见图1、图2。
图1和图2分别为配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+诱导pBR322 DNA 缩合的凝胶电泳实验图和[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2广诱导pBR322 DNA缩 合的凝胶电泳实验图。图1和图2中附图标记均表示为0泳道DNA空白， 1-8泳道DNA+Ru酉己合物。每个泳道DNA的浓度是5 ng/(iL，从第1泳道到 第8泳道配合物的浓度依次分别为9, 13， 18, 27， 36， 45， 54 and 63 ng/^L。从电 泳图片中得出[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2诱导DNA缩合的浓度为36 ng L, [(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2诱导DNA缩合的浓度为27 ng/|iL。
(2)原子力显微镜(AFM)实验
①云母片(1 cm x l cm)新鲜解离后，滴加20|iL的二次水溶液于其上，10 秒钟后，移去溶液。②滴力口 20|iL 1 mMMgCl2溶液于云母片，10秒钟后，移去溶液。③将DNA溶液(5ixL)或DNA和钌多吡啶配合物的混合溶液滴在云母 片的基底上，IO分钟后，移去溶液，用二次水充分淋洗，进行AFM扫描。AFM 扫描结果表明
不加入本发明诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物的单纯DNA呈现的是松弛 的环形；当加入本发明诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物时，环形的DNA均 呈现出不同大小纳米颗粒。加入的[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2的浓度为 140ng4iL,颗粒直径为176 nm;加入的[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](C104)2的 浓度为140ng/|iL，颗粒直径为128 nm。
(3)激光动态光散射(DLS)实验
含有相同量的pBR322 DNA(l ng/)LiL)的溶液中加入不同量的Ru(II)配合 物的溶液，混合均匀，加入緩沖液(50 mM Tris, 18 mM NaCl buffer, pH 7.2)使反 应液的最终体积保持在50(iL。样品溶液被转移到石英池中，在测量前静置2 分钟。设定激光角度为90。，激发波长为660nm。每份样品平行测量三次，取 其平均值。测量条件为配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2广浓度为140 ng/pL,配合物[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2广浓度为140 ng/|iL;激光角度为90°, DNA的浓度是1 ng/|iL;测得的诱导pBR322 DNA缩合形成的纳米颗粒直径分 布结果为当[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2的浓度为140ng/pL时，诱导 pBR322 DNA缩合纳米颗冲立直径为261nm, [(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](C104)2 的浓度为140 ng/pL时，诱导pBR322 DNA缩合纳米颗粒直径分别为216 nm。 实施例3 钌多吡啶配合物介导的基因转染实验
将生长良好的HeLa细胞接种到24孔培养板中，在37 。C, 5%002条件下孵育 18~24 11后至细胞融合度为60%口80%，转染质粒pEGFP。转染前2 h，将完全培 养基吸去，用无血清培养基洗涤两次，加入不同比例的钌配合物/DNA复合物 (每孔含l |ig DNA)孵育5 h后，将无血清培养基换成完全培养基.48 h后检验转 染结果。采用倒置荧光显微镜进行观察拍照，采用流式细胞仪进行定量分析。 基因转染实验证实，以配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+和 [(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2]4+为载体，成功介导了质粒pEGFP在HeLa细胞中的 基因转染。
权利要求
1.诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物，其特征在于由钌与辅助配体和主配体配合而成，所述辅助配体为2，2-联吡啶，所述主配体为1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])苯或1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])萘；所述配合物中的阴离子部分为高氯酸根离子；所述钌与辅助配体2，2-联吡啶和主配体1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])苯的配合物的阳离子部分的化学结构如式I所示所述钌与辅助配体2，2-联吡啶和主配体1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])萘的配合物的阳离子部分的化学结构如式II所示
2.权利要求1所述配合物的制备方法，其特征在于步骤如下:将钌和辅助配体的配合物二(2,2'-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体化合物溶解于乙二醇，加热反应，冷却后加水稀释，再NaC104饱和溶液即产生沉 淀，过滤后沉淀依次用水、乙醚洗涤后干燥，即得。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于干燥后的粗产品采用氧化 铝柱色谱分离提纯。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述加热反应的温度为 120 160°C,同时用氩气保护；反应时间为8 12小时。
5. 权利要求1所述配合物在基因药物载体制备中的应用。
全文摘要
本发明提供了诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法与应用，所述配合物是由钌与辅助配体和主配体配合而成，所述辅助配体为2，2-联吡啶，所述主配体为1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])苯或1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])萘；所述配合物中的阴离子部分为高氯酸根离子；所述制备方法是将钌和辅助配体的配合物二(2，2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体化合物溶解于乙二醇，加热反应，冷却后加水稀释，再NaClO₄饱和溶液即产生沉淀，过滤后沉淀依次用水、乙醚洗涤后干燥，即得。本发明还提供所述配合物在基因药物载体制备中的应用。本发明的钌多吡啶配合物具有高稳定性、低毒性、光物理性质丰富、容易吸收并在体内很快排泄等特点，应用前景广阔。
文档编号A61K48/00GK101555253SQ20091003933
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者刘朋昕, 晖 巢, 廖国亮, 丽 徐, 计亮年, 相 陈 申请人:中山大学