一种靶向纳米药物载体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及纳米药物技术领域，更具体地，涉及一种靶向纳米药物载体及其制备方法和应用。

背景技术：

纳米药物是一种新型药物制剂，通过修饰靶向探针和药物，纳米颗粒可以有效改善生物分布，增加细胞摄取和药效。通过优化了纳米颗粒的尺寸和表面特征，可以增加血液循环寿命。最近，树枝状大分子已经被用于癌症的诊断和治疗，因为它们具有优异的水溶性，极大的药物递送潜力。聚酰胺-胺型(pamam)树枝状大分子是一类高度的具有精确结构的支化聚阳离子大分子和低分散性。pamam作为一种优良的纳米级单分子表面活性剂、具有良好的增溶和稳定的作用。在生物医药领域作为药物、基因、疫苗的载体，用于药物缓释、体外诊断、体外基因转移、基因治疗、核磁成像等应用。pamam的大小也可以在逐步合成过程中的很好的控制。此外，pamam还通过延长其循环时间来改善药物载体渗透到脉管系统和肿瘤细胞中。

her2是人类表皮生长因子受体-2，它的过度表达会过度传递信号，刺激癌细胞增殖。研究表明，her2在20-30％的乳腺癌中过度表达，her2过表达的乳腺癌浸润性强，无病生存期短，预后差。卵巢癌，胃癌和子宫颈癌等多种肿瘤中都有her2的过度表达，her2已经成为治疗癌症的重要靶标。

目前，针对her2胞外区的抗体药物研究比较深入，部分药物已经市场化，如赫赛汀和西妥昔单抗等。赫赛汀是一种人源化单克隆抗体，选择性地作用于her2的胞外部位，1998年被fda批准上市用于转移性乳腺癌的治疗，治疗效果明显好于现有的抗乳腺癌药物，现在已成her2阳性乳腺癌患者的首选治疗药物。

然而抗体药物存在着制备繁琐、稳定性较差、费用昂贵、穿透力弱等缺点。因此，为了提高乳腺癌诊断和治疗的特异性和准确性，弥补抗体的缺陷，迫切需要寻求新的药物载体和试剂，以作为检测和治疗乳腺癌的有效方法。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述问题，本发明提供了一种靶向纳米药物载体，该载体包括聚酰胺-胺型树枝状大分子、聚乙二醇和靶向多肽；聚酰胺-胺型树枝状大分子外围的部分或全部nh2基各自连接一个聚乙二醇分子，部分聚乙二醇的另一端连接靶向多肽；聚酰胺-胺型树枝状大分子外围的nh2基团与聚乙二醇的摩尔比为1:48-1:96；聚酰胺-胺型树枝状大分子与靶向多肽的摩尔比为1:5-20；靶向多肽是能够与表达或过量表达her2的癌症细胞或癌症组织靶向结合的多肽。

在本发明中，采用上述结构以及特定比例的纳米药物载体可以有效地降低与上述载体的毒性，更好地作为传递能治疗癌症药物如dox的载体，减少对正常细胞的伤害。另外，本发明的载体与her2蛋白结合能力强，能够有效地通过该蛋白来对肿瘤病人进行靶向治疗。

在本发明的实施方式中，在聚酰胺-胺型树枝状大分子外围的nh2基连接聚乙二醇分子的个数由聚酰胺-胺型树枝状大分子外围的nh2基团与聚乙二醇的摩尔比值决定，也由聚酰胺-胺型树枝状大分子与所述靶向多肽的摩尔比决定，以确保只有部分聚乙二醇的另一端与靶向多肽连接，而非所有的聚乙二醇的另一端均与靶向多肽连接。

在本发明中，载体是以聚酰胺-胺型树枝状大分子为中心，外围连接有peg，在peg外侧分布有靶向多肽。该靶向多肽有序分散在peg外侧，优选地，等间距分散在peg外侧，即聚酰胺-胺型树枝状大分子外侧。即在一个优选实施方式中，靶向多肽呈等间距与部分聚乙二醇的另一端连接，在由聚酰胺-胺型树枝状大分子为中心形成的纳米球的外侧呈等间距分布。

在本发明一个优选实施方式中，peg也呈等间距分散在聚酰胺-胺型树枝状大分子的外围，其间距比靶向多肽的分散间距小。

在本发明一个优选实施方式中，为了增强对her2的特异性，靶向多肽为h6、h10或由其形成的二价体或多价体。

其中，h6的多肽序列为：ylffvfer，如seqidno.1所示；

h10的多肽序列为：klrlfwnr，如seqidno.2所示。

靶向多肽可以为h6形成的二价体或多价体，也可以为h10f形成的二价体或多价体。其中，二价体或多价体可以通过连接分子共价连接形成，或是通过与多聚体混合非共价连接形成的，本领域技术人员可以根据需要选用多聚体，如聚乙二醇或环糊精。在本发明中，多价指二价以上。

聚酰胺-胺型树枝状大分子pamam为一种优良的纳米级单分子表面活性剂、具有良好的增溶和稳定作用。在本发明一个优选实施方式中，为了得到适用于上述特定多肽且对正常细胞伤害最低的载体，聚酰胺-胺型树枝状大分子pamam为第3-6代聚酰胺-胺型树枝状大分子，优选为第4代聚酰胺-胺型树枝状大分子，即g4pamam树枝状大分子。

在本发明的实施方式中，本发明的靶向纳米药物载体可以制为纳米颗粒，也可称为纳米球。当使用本发明的载体与药结合时，可称为载有药物的纳米球。

在本发明的实施方式中，聚乙二醇peg的分子量可以根据需要来选择，可以选用分子量为1000或是2000的聚乙二醇。同时，为了得到本发明的载体结构，可以使用双功能的聚乙二醇与pamam树枝状大分子反应以及靶向多肽反应，其中，双功能中一活化剂可以为如nhs类的物质，另一活化剂可以为如mal类的物质。

也可以先使聚乙二醇的一侧先被nhs活化，并与pamam反应得到pamam-peg，再使用如mal类的物质使pamam-peg中peg另一侧活化，使其顺利与靶向多肽反应。在本发明一个优选实施方式中，双功能聚乙二醇指聚乙二醇分子的两端均被nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)功能化。

在本发明一个优选实施方式中，为了减少载体的毒性，聚酰胺-胺型树枝状大分子表面的nh2基团与聚乙二醇的摩尔比为1:48-1:96，优选为1:50-1:80，进一步优选为1:60。

在本发明一个优选实施方式中，为了减少载体的毒性，聚酰胺-胺型树枝状大分子与所述靶向多肽的摩尔比为1:10-20，优选为1:6-10，进一步优选为1:7.5。

在本发明一个优选实施方式中，聚乙二醇的另一端与靶向多肽为化学键连接，优选为碳氮键连接，即可以表示为：

其中，pamam为本发明的聚酰胺-胺型树枝状大分子，n指peg中-ch-ch-o-单元的个数，该解释也适用下述反应历程中结构式。当靶向多肽为h6时，得到的靶向纳米载体可以简写为pamam-peg-h6。

在本发明的实施方式中，可以使用本领域中常用的方法来制备上述靶向纳米药物载体，为了使合成更加方便，本发明还提供了上述多肽靶向纳米药物载体的制备方法，该制备方法的反应历程为：

其中，nh2-peptide为本发明的靶向多肽，聚酰胺-胺型树枝状大分子pamam与靶向多肽的摩尔比为1:10-20，优选为1:6-10，进一步优选为1:7.5。

在一个优选实施方式中，该制备方法包括以下步骤：

1)合成pamam-peg；

2)使用马来酰亚胺(mal)活化pamam-peg，即并与靶向多肽按配比室温反应，即得pamam-peg-肽。

其中，为了简化工艺，步骤1)具体为：

在meoh和dmso的混合溶剂中，pamam与nhs活化的peg按配比在室温下反应，纯化，即得上述pamam-peg。

混合溶剂中，meoh和dmso的体积比优选为1:1。

在pamam-peg的制备中，在混合溶剂中，pamam树枝状聚合物表面的nh2基团与nhs活化的peg按配比在室温下连续搅拌反应10-15分钟，优选15分钟，用sephadexg-50柱纯化反应混合物以除去未反应的peg。

在步骤2)中，先用马来酰亚胺mal活化步骤1)中得到的pamam-peg，并与靶向多肽按配比在室温下连续搅拌下进一步反应20-30小时，优选24-30小时，然后将反应后的混合物透析并冻干，即可得到pamam-peg-靶向多肽树枝状聚合物，通常为白色固体。

即在一个优选实施方式中，可以使用下述方法来制备得到pamam-peg-靶向多肽树枝状聚合物，该载体与药物结合时靶向性能最佳。

制备方法如下：

1)在混合溶剂中，pamam树枝状聚合物表面的nh2基团与nhs活化的peg按配比在室温下连续搅拌反应10-15分钟，纯化，即得pamam-peg；

2)先用马来酰亚胺mal活化步骤1)中得到的pamam-peg，并与靶向多肽如h6或h10按配比在室温下连续搅拌下进一步反应24-30小时，然后将反应后的混合物透析并冻干，即可得到pamam-peg-靶向多肽树枝状聚合物，通常为白色固体。

在本发明的实施方式中，也可以先将peg的一端先用nhs活化，另一端与mal活化，得到nhs-peg-mal，再与pamam树枝状聚合物反应得到pamam-peg-mal，将pamam-peg-mal与靶向多肽如h6或h10按配比反应，得到pamam-peg-靶向多肽。

在本发明的实施方式中，可以使用发散方法通过重复迈克尔反应加入氨基与丙烯酸甲酯合成，通过透析后核磁氢谱(¹h-nmr)进行不同代数的pamam树枝状大分子的结构鉴定。

本发明还提供了上述靶向纳米药物载体以及上述制备方法在制备治疗癌症药物或肿瘤放射靶向标记物中的应用。

优选地，癌症为her2蛋白过表达的癌症，进一步优选为乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌或子宫颈癌中的任意一种。

在本发明中，冶疗癌症药物可以被制为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物中的任意一种。也可以被制为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素或金属络合物中的任意一种。

在上述应用中，上述药物中还可以包括多种能杀伤癌细胞的制剂和/或显像制剂。

在上述应用中，可以将得到的靶向纳米药物载体包载药物，如dox等。

本发明的靶向纳米药物载体具有靶向her2蛋白的作用，可以作为靶头增加药物载体如纳米材料、脂质体等在her2阳性细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。且本发明的靶向纳米药物载体可以采用化学合成的方法制备得到，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠。该发明的载体对肿瘤标志物her2蛋白的靶向作用明显，选择性强，同时具有高的药物包载效率，而且几乎没有毒性，极大的提高了药物载体的安全性，为乳腺癌和其他her2阳性肿瘤的诊断和治疗提供了新的选择与思路。

附图说明

图1为本发明实施例1中靶向纳米药物载体的tem和dls图；

图2为使用本发明实施例1的载体包载化疗药物dox(即pamam-peg-peph6-dox)的反应流程图；

图3为使用本发明实施例中pamam-peg-peph6-dox的药物体外释放图；

图4为本发明实施例中pamam-peg-peph6-dox对her2蛋白的体外等离子共振成像亲和力图；

图5a为本发明实施例pamam-peg-peph6-dox、游离dox、pamam-peg-peph6在不同浓度的正常细胞中的细胞毒性图；

图5b为本发明实施例pamam-peg-peph6-dox、游离dox、pamam-peg-peph6在不同浓度的her2阳性的肿瘤细胞中的细胞毒性图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1

靶向纳米药物载体pamam-peg-h6肽的制备

(1)第四代聚酰胺-胺型(g4pamam)树枝状大分子使用发散方法通过重复迈克尔反应加入氨基与丙烯酸甲酯合成，其次通过透析(mwco3500)后1h-nmr光谱法进行了pamamg4的结构鉴定。

(2)在meoh和dmso(1:1)的溶剂混合物中，pamam树枝状聚合物的外围nh2基团与nhs活化的peg以1:64的摩尔比室温反应15分钟合成pamam-peg。用sephadexg-50柱纯化以除去未反应的peg。

(3)为了合成目标pamam-peg-h6肽，通过马来酰亚胺(mal)活化pamam-peg，并与肽h6以1:16的摩尔比在室温下连续搅拌下进一步反应30小时，将反应混合物透析并冻干，得到pamam-peg-h6树枝状聚合物，为白色固体。

图1中进行tem和dls测量其尺寸和形态，修饰聚乙二醇和多肽后平均大小从约4nm增加到7nm，pamam，并且ζ电位测量显示带正电(3.60mv)，纳米载体的正电荷与带负电荷的肿瘤细胞膜的进行有效的静电相互作用增加摄取。

实施例2

在本实施例中，具体包括以下步骤：

(1)使用实施例1中的靶向纳米药物载体包载化疗药物dox，线路图见图2所示。使用光谱法测定载量纳米载体包载化疗药物dox的含量。结果显示，每个纳米载体可能潜在的平均包封14歌dox分子。

(2)来自pamam-peg-h6/dox的体外dox释放研究

在酸性条件下，使用透析法进行。将在中性ph条件.10mg载有dox的纳米球分别重悬于2mlph7.4和ph5.5pbs缓冲液中，然后加入透析液中袋(mwco3500)。透析袋悬挂在含有200毫升的pbs缓冲液中，37℃搅拌均匀。在不同时间段取样，并通过荧光分光光度法测定。图3结果显示在酸性条件下，纳米载体上包载的dox释放速率明显比ph7.4更快，ph值可能是由于带正电的dox分子在pamam树支在酸性环境中，通过质子化排斥加速dox从疏水树枝状大分子的释放提高药效。

实施例3

在本实施例中，具体包括以下步骤：

将1mg/ml的pamam-peg-h6颗粒修饰到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜，然后用10×pbs清洗10min，再用1×pbs清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×pbs中，4℃条件下孵育过夜，然后用10×pbs清洗10min，1×pbs清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，用氮气吹干，装芯片上机(plexeraht表面等离子共振成像系统)。

流动相依次通过1×pbs、2×pbs、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的人her2纯化蛋白，记录分析spri信号。

由图4可以看出，pamam-peg-h6的spri信号随着人her2蛋白浓度的增加逐渐增强，亲和解离常数kd达到了7.48×10-¹⁰摩尔/升，说明本发明的靶向载体对her2是有强结合的，可以作为靶向her2肿瘤的药物载体用于相关的研究应用。

实施例4

在本实施例中，评价药物载体的体外抗肿瘤效果，具体方法如下：

(1)分别将skbr-3和293t细胞种分别传到96孔板中培养，每个孔5000个细胞，培养过夜；

(2)当细胞融贴壁后，分别加入含0.01、0.1、0.5、1、10和100mm的dox,pamam–peg–h6和pamam–peg–h6/dox37℃孵育48h；

(3)吸掉药物溶液，加入0.5mg/ml的mtt溶液37℃度孵育4个小时；

(4)吸掉液体，加入200μl二甲基亚砜(dmso)，经过10分钟震荡混匀后，使用酶标仪测定570nm处的光密度od570值，并分析数据。

如图5a所示，在正常细胞中，与游离dox(freedox)相比，pamam-peg-h6几乎没有细胞毒性，进而说明其作为载体的安全性。图5b中，pamam–peg–h6/dox对her2阳性的肿瘤细胞的毒性比游离dox表现出更高的细胞毒性，说明是由于h6靶向作用导致更高效的细胞毒作用。

本发明的靶向纳米药物载体是一种对her2蛋白高灵敏度高特异性结合的载体，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于多种肿瘤的靶向治疗。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>国家纳米科学中心

<120>一种靶向纳米药物载体及其制备方法和应用

<130>khp171111887.5

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

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<213>人工序列

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