Caesalpin E在制备治疗肾癌药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物CaesalpinE的新用途，具体涉及CaesalpinE在制备治疗肾 癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] GuoxuMa等人首次分离纯化出化合物CaesalpinE，并将成果发表在著名天然 产物杂志JournalofNaturalProduct上（CaesalpinsA~H,BioactiveCassane-Type DiterpenesfromtheSeedsofCaesalpiniaminax，J.Nat.Prod.，2013,76,1025-1031)〇
[0003] 目前尚未有该化合物关于肾癌的活性报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种CaesalpinE的医药用途。
[0005] 上述目的是通过如下技术方案实现的：
[0006]CaesalpinE在制备治疗肾癌药物中的应用，所述CaesalpinE化学结构式如下，
[0007]
[0008] 进一步地，所述肾癌为人肾癌RC-2。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
[0010] 实施例1:CaesalpinE的分离制备及结构确证
[0011] CaesalpinE的制备方法同文献报道的制备方法（CaesalpinsA-H,Bioactive Cassane-TypeDiterpenesfromtheSeedsofCaesalpiniaminax,J.Nat.Prod. ,2013, 76,1025-1031)。
[0012] 结构确证：白色无定形粉末，HR-ES頂S显示[M+Na]+为m/z453. 1907,结合 核磁特征可得分子式为C24H3()07，不饱和度为10。核磁共振氢谱数据5H(ppm，DMS0-d6， 600MHz) :H-1 (5. 64,t，J= 1. 8)，H-2 (1. 88,m)，H-2 (2. 15,m)，H-3 (1. 18,m)，H-3 (1. 93,m)， H-6(5.89,d，J= 6.0)，H-7(5.01，d，J= 6.0)，H-ll(6.68,s)，H-15(6.84,d，J= 2.4)，H-16(7. 68,d，J= 2. 4)，H-17(2. 55,s)，H-18(l. 21，s)，H-19(l. 22,s)，H-20(l. 64,s)， 1-0C0CH3(1.84,s)，6-0C0CH3(2.19,s)，5-0H(4.09,s)，7-0H(5.76,s);核磁共振碳谱数据 Sc (ppm，DMS0-d6, 600Hz) :77. 6 (CH，1-C)，22. 5 (CH2, 2-C)，33. 6 (CH2, 3-C)，39. 9 (C，4-C)， 79. 8 (C，5-C)，81. 1 (CH，6-C)，74. 5 (CH，7-C)，128. 1 (C，8-C)，141. 1 (C，9-C)，50. 3 (C，10-C)， 104. 7 (CH，n-C)，156. 0 (C，12-C)，131. 3 (C，13-C)，132. 4 (C，14-C)，106. 1 (CH，15-C)， 146. 8 (CH，16-C)，17. 3 (CH3,17-C)，31. 3 (CH3, 18-C)，25. 6 (CH3,19-C)，29. 9 (CH3, 20-C)， 171. 6 (C，1-0C0CH3)，21. 5 (CH3,1-0C0CH3)，173. 3 (C，6-0C0CH3)，22. 1 (CH3,6-0C0CH3)。结构 确证数据与文献报道一致，因此可以确定本发明制备的化合物即为文献报道的Caesalpin E〇
[0013] 实施例2:CaesalpinE的药理作用试验
[0014] 一、材料和仪器
[0015] 人肾癌RC-2细胞株购于ATCC细胞库（美国）。分析纯蔗糖购于国药集团化学 试剂公司。重水（D20)购于青岛腾龙微波科技有限公司。Tris、SDS、30%丙烯酰胺单体、 Tween20购于重庆医科大学基础研究所实验室。小牛血清、RPMI-1640购于美国Gibco公司。 Centriplus离心超滤管、AmiconUltra高回收率高流速切向流超滤离心管（100kD)、PVDF 膜购于Mi11ipore公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海安亭科学仪器厂。5XSDS-PAGE 蛋白质上样缓冲液、BeyoECL荧光检测试剂、考马斯亮蓝G250、考马斯亮蓝R250购于碧云天 生物技术研究所。CaesalpinE自制，HPLC归一化纯度大于98%。鼠抗人HSP70单克隆抗 体、兔抗人ICAM-1单克隆抗体、兔抗人G250多克隆抗体购于Sigma公司。兔抗人Survivin 多克隆抗体武汉博士德生物有限公司。
[0016] 超净工作台（苏州华新空调净化有限公司），自动平衡离心机（上海医用分析仪器 厂），光学显微镜（NIKON，日本），透射电子显微镜（LeicaTCS-NT，德国），低温高速离心机 (日立公司，日本），低温超高速离心机H-80B(日立公司，日本）。垂直电泳槽、电转槽（北 京六一厂，中国）。台式高速离心机、酶标仪（上海安亭科学仪器厂，中国）。96孔培养板 (Corning公司，美国）。凝胶仪、PCR扩增仪（BI0-RAD，美国）。
[0017] 二、试验方法
[0018] 1、MTT检测CaesalpinE不同浓度48h对肾癌细胞株RC-2增殖的影响
[0019] 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液（含有0? 1%青霉素、链霉素）常规培养 人肾癌细胞株RC-2,根据细胞生长密度1~2天换液一次，3天传代一次。取对数期生长细 胞，按照如下步骤操作：（1)接种细胞：胰酶消化对数生长期的肾癌RC-2细胞，用含10%小 牛血清的RPMI-1640培养液lmL制成单细胞悬液，混匀后用移液管按照体积100yL/孔，即 接种肾癌细胞数目5X103个/孔，加入96孔培养板中。每组细胞设置3个复孔；（2)培养细 胞：将培养板小心置入孵箱中（37°C、5%C02)培养3天；(3)处理细胞：分别按空白组（加 51^01^0液）、0.25、0.5、0.75、111111〇1/1〇36834111￡处理组分组后加药处理4811 ;(4)显 色：在各个时间点，予以每孔各加入MTT溶液20yL，之后继续放入孵箱中孵育4h，然后小心 把孔内培养液用注射器吸去；对于当天接种的细胞而言，离心之后（l〇〇〇rpm，5min)，然后 将孔内培养液移除。之后把150yLDMS0加入每孔，使其充分振荡10min后，把结晶物溶解 完全；（5)比色：在全自动酶标仪上检测各孔在580nm波长下的光密度值[(D580)]，按公式 测定细胞活力：D(580)实验孔/D(580)对照孔X100%。
[0020] 2、MTT检测0. 5yMCaesalpinE不同时间对肾癌细胞株RC-2增殖的影响
[0021] 接种和处理细胞及显色和比色步骤同上（1)、（2)、（4)、（5)，处理细胞：分别按空 白组（加 5yLDMS0 液）、0.5yMCaesalpinE处理24h、48h、72h分组。
[0022] 3、制备exosomes
[0023] (1)细胞分组：取6份细胞计数相近的人肾癌RC-2细胞株体外常规培养，其中 三份为对照组（CE)，另外三份为实验组（CE2)，等细胞呈对数生长时，两组细胞株按照 3X106/100mL重新传代至新的培养瓶，严格控制每组细胞培养基的体积一致；在实验组，等 细胞培养48h后加入0. 5yM的CaesalpinE处理细胞48h，之后收集培养上清液各150mL; 对照组不加药物，加入与实验组等量的DMSO, 48h后收集培养上清液各150mL，置于-20°C冰 箱保存；（2)提取exosomes:培养上清液150mL，300g低温离心（4°C)lOmin去除细胞；800g 低温离心30min获取上清10000g低温离心30min获取上清通过100kDMffCOCentriplus 离心超滤管浓缩超滤（MffCO:分子量截留），以1000g离心30min，得到约20mL超滤液。将超 滤液分别移至2mL含30g/L的蔗糖重水垫的10mL的离心管中，100000g低温超速离心lh。 收集离心管底部的缓冲垫用PBS稀释，置于100kDMffCO高回收率高流速切向流超滤离心管 中1000g离心30min，得到3mLexosome。0? 22ym滤膜过滤除菌，_80°C保存备用设置对照 组细胞（CE1)来源的exosomes为EX1组exosomes，实验组细胞（CE2)来源的exosomes为 EX2 组exosomes〇
[0024] 4、BCA法检测exosomes蛋白含量
[0025] ⑴测定方法：取96孔酶标板，按下表加入试剂并绘制标准曲线：
[0026]
[0027]
[0028] 上述试剂加完后，准确吸取10yL样品溶液于酶标孔中，加入BCAi式剂200yL，轻 摇，于37°C保温30min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上562nm处比色，以牛血清 白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样 品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质浓度；（2)计算方法：exosome浓缩液总蛋白质 含量（mg)=浓缩后的总体积XBCA法测定蛋白质浓度。重复6次实验，取平均值做统计学 分析。
[0029] 5、统计学方法
[0030] 使用软件GRAGHPADPRISM5.0进行图表制作及统计学分析，计量资料以1±8表 示，比较组间差异使用方差分析或t检验。
[0031] 三、结果及结论
[0032] 1、MTT显示不同浓度CaesalpinE作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化
[0033]MTT结果显示当CaesalpinE浓度0? 75yM作用细胞时，细胞活力 (71. 32±4. 68 % )与CaesalpinE浓度0. 5yM及0. 25yM作用细胞时细胞组 (91. 43±2. 74% ;94. 67±1. 21% )相比，差异具有统计学意义（P〈0. 05)。
[0034] 2、MTT显示0? 5yMCaesalpinE不同时间作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化
[0035]MTT结果显示当 0.5yMCaesalpinE作用细胞 72h组（71. 34± 1.64%)与作用 48h组（91.04±6.23% )、24h组（94.56±1. 13% )对比，细胞活力差异具有统计学意义 (P〈0. 05) 〇
[0036] 3、Exosomes计数和蛋白定量
[0037] 电镜下实验组（EX2)和对照组（EX1)exosomes计数和exosomes蛋白定量结果：经 CaesalpinE处理后，RC-2细胞产生的exosomes数量和exosome蛋白含量较未经药物处理 组都明显增加，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。结果见表1。
[0038] 结果说明，CaesalpinE能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间 依赖性。经CaesalpinE处理后，透射电镜观察肾癌细胞株RC-12源性exosomes形态未见 明显改变，其分泌量和蛋白含量较处理前明显增加（P< 0.05)，这些说明CaesalpinE对肾 癌细胞株RC-12的抑制作用与CaesalpinE引起的肾癌细胞RC-2表达野生型p53mRNA上 调有关。
[0039] 表1实验组和对照组分泌exosomes数量及蛋白含量对比
[0040]
【主权项】
1.CaesalpinE在制备治疗肾癌药物中的应用，所述CaesalpinE化学结构式如下，2. 根据权利要求1所述的CaesalpinE在制备治疗肾癌药物中的应用，其特征在于： 所述肾癌为人肾癌RC-2。
【专利摘要】本发明公开了Caesalpin？E在制备治疗肾癌药物中的应用，属于药物领域。试验表明Caesalpin？E能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖性。Caesalpin？E可以进一步研究开发成制备治疗肾癌的药物。
【IPC分类】A61P13/12, A61P35/00, A61K31/343
【公开号】CN105106194
【申请号】CN201510578969
【发明人】周午贤
【申请人】周午贤
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月13日