一种靶向载药纳米级超声微泡及其制备方法与流程

本发明涉及靶向载药纳米级超声微泡及其制备方法。

背景技术：

超声造影剂(Ultrasound Contrast Agents,UCAs)是一类能够显著增强医学超声检测信号的诊断药物，通过静脉注射给药到达人体各器官微循环，微泡可以使其所在部位的回声信号显著增强。理想的超声造影剂能作为一种血池显像示踪剂随血流分布到全身，反映器官的血流灌注情况，同时又不干扰血流动力学。超声造影剂能有效增强心肌、肝、肾、颅脑等实质性器官的二维超声影像和血流多普勒信号，明显提高超声诊断的灵敏性和特异性，因此在影像医学诊断方面显示出很好的应用前景。目前常用的超声造影剂膜材有白蛋白、脂质、表面活性剂类及高分子材料类造影剂。但是受到体内循环时间短、代谢时间过快、超声显像不明显等缺点的限制，处于发展的瓶颈阶段。传统超声造影剂通过显示病变内部微循环灌注，显著提高了疾病诊断与鉴别诊断水平。但近年来，单一功能的造影剂已不能满足医学多样化需求。所以，越来越多的研究者开始将目光转向具有多种功能超声造影剂的研究，如多模态(适于多种成像模式的造影剂)和多功能(不仅适于成像，而且能够用于药物传递、基因转染等)超声造影剂。虽然对疾病的准确诊断可以通过应用多模态造影剂将各种成像模式综合应用来实现，然而疾病诊断之后的治疗也是一大难题。如果能够将疾病的诊断和治疗两个过程合二为一，在得到诊断结果的同时，及时地对病变部位进行对症治疗，这样不仅可以减少病人二次服药的痛苦以及药物可能引起的副作用，而且缩短了诊治时间，也可以提高疾病的治疗效果。同时，由于生物体内的结构复杂，器官组织中脂肪、蛋白质、水的含量变化，造成超声显像的灵敏度、清晰度和诊断的准确度等方面存在局限，所以提高超声分子显像信噪比和增加图像清晰度也至关重要。因此，本发明正是基于研制出新型多功能超声造影剂和提高超声显影效果这两方面思想而提出的。

CNTs已广泛用于小分子药物和生物大分子如蛋白质、DNA、RNA等跨细胞膜药物输送，而且CNTs经表面修饰后在动物体内没有明显毒性，并能被缓慢地排除体外，CNTs能够主动进入细胞，CNTs功能化后也可应用于癌症治疗。利用CNTs中空网状这一特殊结构特点，其外表面不但可以非共价吸附各种分子，还可以共价键合多种化学基团，其内部则可以包埋小分子，从而提高CNTs药物负载率及实现增溶和靶向等功能。

技术实现要素：

本发明是为了解决传统超声造影剂功能单一，灵敏度、清晰度和准确度低的问题，而提出的一种靶向载药纳米级超声微泡及其制备方法。

一种靶向载药纳米级超声微泡包括：微泡膜壁、FA-CNTs-PTX靶向载药复合物、以及包裹在微泡膜壁内部的惰性气体；其中所述FA为叶酸，CNTs为碳纳米管，PTX为紫杉醇；

其中碳纳米管置于微泡膜壁内部，靶向因子叶酸的一端通过壳聚糖连接到碳纳米管上，另一端穿过微泡膜壁伸向微泡膜壁外侧，连接叶酸的碳纳米管通过物理吸附负载抗肿瘤药物紫杉醇。

一种靶向载药纳米级超声微泡的制备方法按以下步骤实现：

步骤一：制备叶酸-壳聚糖偶合物；

步骤二：将碳纳米管进行羧基化，得到羧基化修饰的碳纳米管；

步骤三：制备靶向复合物FA-CS-CNTs；所述FA为叶酸，CS为壳聚糖，CNTs为碳纳米管；

步骤四：制备靶向载药复合物FA-CNTs-PTX；所述PTX为紫杉醇

步骤五：制备复合FA-CNTs-PTX的微泡，即靶向载药纳米级超声微泡。

发明效果：

本发明将碳纳米管(简称CNTs)加入到新型超声造影剂微泡中，可以有效克服传统超声造影剂功能单一，灵敏度、清晰度和准确度低等缺陷，可以实现诊断和靶向治疗同时进行。

本发明的一种靶向载药超声微泡，其中，包括Span和PEG膜壁和包裹在Span和PEG膜壁内部的惰性气体，在Span和PEG膜壁上镶嵌了FA-CNTs-PTX靶向载药复合物。本发明克服了传统超声造影剂微泡的靶向性低、体内循环时间短、稳定性差、超声显像不明显、功能单一的缺点，提供一种靶向性强、体内循环时间长、分子量小、稳定性好、超声显影明显且兼有治疗作用的一种多功能纳米级超声微泡。

附图说明

图1为靶向载药纳米级超声微泡的结构示意图；图中Gas为惰性气体。

图2为靶向载药纳米级超声微泡的粒度分布图。

具体实施方式

具体实施方式一：一种靶向载药纳米级超声微泡包括：微泡膜壁、FA-CNTs-PTX靶向载药复合物、以及包裹在微泡膜壁内部的惰性气体；其中所述FA为叶酸，CNTs为碳纳米管，PTX为紫杉醇；

其中碳纳米管置于微泡膜壁内部，靶向因子叶酸的一端通过壳聚糖连接到碳纳米管上，另一端穿过微泡膜壁伸向微泡膜壁外侧，连接叶酸的碳纳米管通过物理吸附负载抗肿瘤药物紫杉醇。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述微泡膜壁为脂质双分子层结构，微泡膜壁材料为Span60和PEG1500。

其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述靶向载药纳米级超声微泡的的粒径在400～600nm。

其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：一种靶向载药纳米级超声微泡的制备方法包括以下步骤：

步骤一：制备叶酸-壳聚糖偶合物；

步骤二：将碳纳米管进行羧基化，得到羧基化修饰的碳纳米管；

步骤三：制备靶向复合物FA-CS-CNTs；所述FA为叶酸，CS为壳聚糖，CNTs为碳纳米管；

步骤四：制备靶向载药复合物FA-CNTs-PTX；所述PTX为紫杉醇

步骤五：制备复合FA-CNTs-PTX的微泡，即靶向载药纳米级超声微泡。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：所述步骤一中制备叶酸-壳聚糖偶合物的具体过程为：

将壳聚糖溶于1％的醋酸溶液中，搅拌至壳聚糖完全溶解；另称取叶酸和EDC溶于二甲基亚砜中，避光搅拌至叶酸完全溶解；将叶酸溶液逐滴加入CS醋酸溶液中，避光反应4～6小时，加入丙酮溶液，直至反应产物完全沉淀后，将沉淀物离心，用二甲基亚砜洗涤，再用双蒸水洗涤，收集所得下层物，冷冻干燥，得到叶酸-壳聚糖偶合物。

其它步骤及参数与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五不同的是：所述步骤二中得到羧基化修饰的碳纳米管的具体过程为：

取碳纳米管加入到圆底烧瓶中，向其中加入浓硫酸和浓硝酸体积比为3:1的混酸，95～120℃条件下加热回流2～4小时，冷却后，将所得反应溶液用0.45μm混合纤维微孔滤膜抽滤，用双蒸水洗涤至中性，收集固体产物，冷冻干燥，得到羧基化修饰的碳纳米管。

其它步骤及参数与具体实施方式四或五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四至六之一不同的是：所述步骤三中制备靶向复合物FA-CS-CNTs的具体过程为：

称取等质量的羧基化碳纳米管和叶酸-壳聚糖偶合物，分别置于1％(体积百分比)醋酸溶液中，醋酸溶液与羧基化碳纳米管或叶酸-壳聚糖偶合物的用量比为2～3ml/mg(如醋酸体积为2ml，羧基化碳纳米管或叶酸-壳聚糖偶合物质量为1mg，比例为2：1)，超声分散0.5～1小时，得到羧基化碳纳米管分散液和叶酸-壳聚糖偶合物溶液，在搅拌条件下，将叶酸-壳聚糖偶合物溶液加到羧基化碳纳米管分散液中，避光反应16～24小时；反应结束后，混合物进行抽滤，并用1％醋酸溶液洗涤，再用双蒸水洗涤至中性，收集固体产物，冷冻干燥，产物标记为FA-CS-CNTs。

其它步骤及参数与具体实施方式四至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四至七之一不同的是：所述步骤四中制备靶向载药复合物FA-CNTs-PTX的具体过程为：

称取等质量的靶向复合物FA-CS-CNTs与紫杉醇，分别加到无水乙醇中，无水乙醇与靶向复合物FA-CS-CNTs或紫杉醇的用量比为1～2ml/mg(如无水乙醇体积为2ml，靶向复合物FA-CS-CNTs或紫杉醇质量为1mg，比例为2：1)，再将紫杉醇的乙醇溶液滴加到靶向复合物FA-CS-CNTs的乙醇分散液中，避光，磁力搅拌3～5小时，得到靶向载药复合物，产物标记为FA-CNTs-PTX。

其它步骤及参数与具体实施方式四至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式四至八之一不同的是：所述步骤五中制备复合FA-CNTs-PTX的微泡的具体过程为：

取质量比为1：1：2的Span60、PEG1500和NaCl，研磨混合均匀后，加入PBS后，加热并磁力搅拌至混合均匀；再将靶向载药复合物FA-CNTs-PTX分散于PBS中；混合两个PBS体系，70～80℃下磁力搅拌30～60分钟，制得膜材；将制得膜材在850～900W条件下进行探头超声，同时通入氮气，得到复合微泡粗品；再将微泡粗品在3000～5000rpm下离心10～15分钟，收集上层液体，与等体积的PBS一起置于分液漏斗中，静置30～60分钟，洗涤，收集中层液体，得到复合FA-CNTs-PTX的微泡。

其它步骤及参数与具体实施方式四至八之一相同。

实施例一：

叶酸-壳聚糖偶合物(FA-CS)的制备：将壳聚糖(CS,0.1g)溶于醋酸溶液(1％，20mL)中，搅拌至CS完全溶解；另称取叶酸(FA,0.04g)、EDC(0.01g)溶于二甲基亚矾(DMSO，5mL)中，室温下避光搅拌至FA完全溶解；将FA溶液逐滴加入CS醋酸溶液中，避光反应6小时。待反应结束后，加入30mL丙酮溶液，直至反应产物完全沉淀；将沉淀物离心，用DMSO洗涤两次，再用双蒸水洗涤两次，收集所得下层物，冷冻干燥，得叶酸-壳聚糖偶合物(FA-CS)。

CNTs羧基化：取100mg CNTs加入到250mL圆底烧瓶中，向其中缓慢加入40mL混酸(浓硫酸和浓硝酸体积比为3:1)，95℃条件下加热回流4小时。冷却后，将所得反应溶液用0.45μm混合纤维微孔滤膜抽滤，用双蒸水洗涤至中性，收集固体产物，冷冻干燥，得羧基化修饰的CNTs(CNTs-COOH)。

靶向复合物FA-CS-CNTs的制备：称取羧基化CNTs(CNTs-COOH,5mg)和叶酸-壳聚糖偶合物(FA-CS，5mg)，分别置于1％醋酸溶液(10mL)中，超声分散1小时；在搅拌条件下，将FA-CS溶液缓缓加到CNTs-COOH分散液中，避光反应16小时；反应结束后，混合物进行抽滤，并用1％醋酸溶液洗涤，再用双蒸水洗涤至中性，收集固体产物，冷冻干燥，产物标记为FA-CS-CNTs。

靶向载药复合物FA-CNTs-PTX的制备：称取一定质量的靶向复合物FA-CS-CNTs，分散于乙醇溶液中，向其中滴加等质量紫杉醇(PTX)的乙醇溶液，无水乙醇的体积与靶向复合物FA-CS-CNTs或紫杉醇的质量比值为1～2ml/mg。避光，磁力搅拌3小时，得到靶向载药复合物，产物标记为FA-CNTs-PTX。

复合FA-CNTs-PTX的微泡制备：取450mg Span60、450mg PEG1500和900mg NaCl，置于研钵中，研磨混合均匀后，转移至烧杯中，加入20ml PBS分散；再取20mg靶向载药复合物FA-CNTs-PTX于20mL PBS分散。然后，混合两个PBS分散液，75℃下磁力搅拌30分钟，制得膜材。将制得膜材在900W条件下进行探头超声，同时通入氮气，得到复合微泡粗品。再将微泡粗品在3000rpm下离心15分钟，收集上层液体，置于250mL分液漏斗中，静置60分钟，加入等体积的PBS洗涤，再收集中层液体，得到复合FA-CNTs-PTX的微泡产品。靶向载药纳米级超声微泡的粒径在500nm左右。