一种靶向型多肽纳米基因载体复合物的制作方法

本发明涉及基因载体领域，具体地说，涉及一种靶向型多肽纳米基因载体复合物。
背景技术：
：基因治疗是将基因(主要为DNA或siRNA)传递到特定细胞中，从而促进或抑制目标蛋白的表达，达到治疗人类疾病的目的，由于DNA或siRNA容易被核酸酶降解，并且多带负电荷导致其难以通过同样带负电荷的细胞膜，故需要利用基因载体来保护并传递核酸进入细胞内。理想的基因载体应该保证高转染效率的同时，具有良好的生物相容性和较低的细胞毒性，除此之外，对特定细胞类型的转染也是基因载体需要具备的特征之一。因此，发展具有高效、低毒且具有靶向功能的基因载体是基因治疗成功应用的重要前提。基因载体分病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然具备高转染效率的优点，却存在很大的安全隐患，高免疫原性可引起机体免疫原性，并且存在激活原癌基因引发肿瘤的风险。非病毒载体的优势在于免疫原性低，生产制备简单，对基因材料要求限制少等。非病毒载体分为聚合物和脂质体两大类，前者包括聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚氨基酸、树枝状大分子等；后者以阳离子脂质体为代表。这些载体的共同特点是都带有大量正电荷，通过静电吸附作用携带基因物质。聚乙烯亚胺是一种转染效率高且被广泛应用的基因载体材料，但由于它不可降解，毒性大等原因抑制了其在体内的应用。近年来，生物可降解的聚阳离子材料渐渐引起了研究者的关注。相比不可降解的聚合物材料，多肽及其衍生物类材料由于其类蛋白质的组成，具有低毒低富集，生物相容性好的特点，有望成为理想的基因载体。随着分子生物学技术的迅猛发展和人类对肿瘤发病机制认识的不断深入，基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分。而对体内特定细胞类型的基因转染是基因治疗可以成功的关键因素。近年来，肿瘤微环境中的非肿瘤细胞成分，如肿瘤相关成纤维细胞，血管内皮细胞，肿瘤相关巨噬细胞逐渐引起了人们的关注。针对肿瘤间质细胞的基因治疗，阻碍间质细胞对肿瘤发生发展的促进作用，从而达到辅助常规治疗办法的手段是一种很有应用前景的策略。CN102114000A公开了一种同时包载抗癌多肽和基因或化疗药物或放疗药物的共输送脂质纳米递药系统。所述递药系统由寻靶材料、脂质成分和药物组成，其充分利用组分间的性状差异，或通过静电吸附进行包载，或通过被动结合主动载药的方法，实现将不同药物共同包载到脂质纳米递药系统中，将可恢复抑癌蛋白p53活性的抗癌多肽和基因药物或化疗药物或放疗药物同时递送入靶细胞内，达到协同治疗的目的。然而，该发明所述纳米递药系统存在构建步骤复杂，靶向修饰过程繁琐，靶向修饰合成效率低等问题，且脂质体稳定性有待改进，限制了其进一步应用。CN104288776A公开了一种自组装多肽—凋亡素基因复合纳米颗粒及其制备方法和应用。所述的自组装多肽—凋亡素基因复合纳米颗粒是由自组装多肽作为载体，通过自身的酸性氨基酸和碱性氨基酸所带的电荷与携带凋亡素基因的质粒分子之间形成离子键结合，质粒分子牢固粘附于自组装多肽表面，形成复合纳米颗粒。该复合纳米颗粒呈纤维状，长度为100～200nm，直径为10～20nm。该纳米颗粒表面富含精氨酸，能与细胞膜表面精氨酸受体识别结合并被细胞摄取，在细胞内表达其所携带的基因，所表达的凋亡素蛋白能特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒。然而，其由于所公布的载体无靶向性，所述精氨酸受体无特异性，限制了其对特定细胞的靶向转染和生物体内转染。因此，亟需开发一种高效、低毒、制备简易且具备肿瘤靶向作用的多肽纳米基因载体复合物。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种靶向型多肽纳米基因载体复合物(PNP/DNA/抗体复合物或PNP/siRNA/抗体复合物)。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：本发明首先提供了一种具备肿瘤靶向作用的多肽纳米基因载体复合物，其由带正电荷的纳米基因载体、基因药物和具备肿瘤靶向的抗体构成；所述纳米基因载体上吸附有基因药物和具备肿瘤靶向的抗体；所述纳米基因载体由多肽和疏水性功能分子偶联构成。作为优选，多肽与基因药物的正负电荷比(N:P)为20:1～50:1。其中，所述基因药物为siRNA和/或DNA。进一步地，所述多肽为分子量在1.5kDa～4kDa之间两亲性穿膜肽，优选为多聚精氨酸；所述疏水性功能分子为胆固醇。作为优选，多肽与抗体的质量比为10:1-5:1。作为优选，所述纳米基因载体的粒径在50～110nm之间。进一步地，所述多肽纳米基因载体复合物的制备方法为：(1)将多肽和疏水性功能分子偶联构成的两亲性结合物溶解在少量二甲基亚砜中使其充分分散，取少量上述二甲基亚砜溶液加入水(或磷酸盐缓冲液)中在100W超声条件下超声5-10min，自组装得到带正电荷的纳米基因载体；上述二甲基亚砜溶液加入水(或磷酸盐缓冲液)后的体系中，两亲性结合物的浓度不低于32.4mgL-1；考虑到二甲基亚砜对细胞的毒性，二甲基亚砜在该体系中质量比不应超过1％；(2)将基因药物的水溶液与步骤(1)所得溶液混合，室温静置20～30min，通过静电吸附作用形成纳米基因载体与基因药物的复合物；(3)向步骤(2)所得溶液中加入抗体，室温孵育，通过静电吸附作用形成多肽纳米基因载体复合物。进一步地，所述抗体为靶向肿瘤间质细胞的抗体，优选为抗成纤维细胞活化蛋白抗体(anti-FAP-α)。本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本发明的有益效果在于：本发明通过自组装形成纳米基因载体并携带小干扰核酸，表面吸附靶向肿瘤组织的抗体。利用带丰富正电荷的纳米基因载体吸附具有靶向性、带负电的抗体，可避免带正电的纳米基因载体在体内循环中被清除，同时又能提高靶向能力。该方法过程简单，反应条件温和，易于操作。此外，本发明所述纳米基因载体由多肽和疏水性功能分子偶联构成两亲性结合物，该两亲性结合物的自组装过程中不生成共价健，没有逆反应，可形成高度有序的纳米结构，特别适合于构建生物医用材料。附图说明图1为PNP/DNA/抗体复合物粒径(A)及Zeta电位的影响(B)。其中，PNP代表纳米基因载体，PNP/DNA代表纳米基因载体/DNA复合物，PNP/DNA/抗体代表纳米基因载体/DNA/抗体复合物。图2为PNP/DNA/抗体复合物电镜形貌。图3为PNP/siRNA/抗体复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果。图4为PNP/siRNA/抗体复合物细胞毒性实验结果。图5为PNP/siRNA/抗体复合物体外转染siRNA细胞摄取实验结果。图6为蛋白免疫印记分析PNP/siRNA/抗体复合物的体外基因敲击效率。图7为正负电荷比(N:P)对转染效率的影响。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1两亲性结合物的制备利用二氯三苯甲基氯树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)、和Fmoc保护的L-氨基酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-Gly-OH，购自吉尔生化(上海)有限公司)为原料，在各种耦合、裂解试剂存在的条件下，通过固相合成法在树脂上制备多聚精氨酸的聚合物。再经过简单的裂解反应，将多肽从树脂上分离下来，经后续的沉淀、洗涤、干燥处理后制得纯白色多肽粉末。具体的实验过程如下：首先，取1.01克二氯三苯甲基氯树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)至多肽合成装置(购自西格玛奥德里奇公司)，加入干燥的N，N-二甲基甲酰胺(购自西格玛奥德里奇公司)浸泡树脂半小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂N，N-二甲基甲酰胺。称取0.76克Fmoc-Arg(Pbf)-OH用10毫升N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入2毫升催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温下让Fmoc-Arg(Pbf)-OH与树脂相互作用约1.5小时，使其充分固定在树脂上。用N，N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，加入甲醇搅拌30分钟，封闭树脂上未反应的活性位点，并再次用N，N-二甲基甲酰胺溶胀树脂。然后用体积比为1:4的哌啶(购自西格玛奥德里奇公司):N，N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)进行保护基的脱除，反应3次，前两次各持续3分钟，第三次持续20分钟。之后再用5mL的N，N-二甲基甲酰胺重复洗涤树脂5次，每次持续1分钟，直到N，N-二甲基甲酰胺洗液的pH显中性。称取1.52克Fmoc-Arg(Pbf)-OH，0.92克2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(购自吉尔生化(上海)有限公司)，0.36克1-羟基苯并三唑(购自吉尔生化(上海)有限公司)，用10毫升N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到多肽合成装置中，再加入2毫升催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温下让Fmoc-Arg(Pbf)-OH与树脂相互作用约2小时，使其充分连接到上一个氨基酸上，N，N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，取少许树脂加入10％茚三酮的无水甲醇(购自国药集团化学试剂北京有限公司)中加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂颜色无明显变化，则说明第二个氨基酸已完全同上一个氨基酸偶联，若树脂变蓝甚至发黑，则说明第二个氨基酸没有与前一个氨基酸完全反应，需重复连接。重复以上步骤继续缩合精氨酸，直至第9个精氨酸，随后连接甘氨酸。用体积比为1:4的哌啶:N，N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)进行保护基的脱除之后，加入1.00g胆固醇(购自西格玛奥德里奇公司)/4mL吡啶(购自西格玛奥德里奇公司)的混合液，反应两次、每次2小时。做完茚三酮测试，确保胆固醇已经完全连接到了多肽的N末端，再用5mL的二氯甲烷重复洗涤树脂5次，每次持续1分钟。最后，将多肽从树脂上裂解下来，具体过程如下：首先配制裂解液：9.5mL三氟乙酸(购自西格玛奥德里奇公司)+0.85mL1，2-乙二硫醇(购自西格玛奥德里奇公司)+0.5mL茴香硫醚(购自西格玛奥德里奇公司)+0.5mL去离子水。将树脂放入上述混合液中进行裂解反应3小时，之后过滤掉树脂，在收集到的液体中加入乙醚(购自国药集团化学试剂北京有限公司)，立即出现白色沉淀。然后，离心分离上述悬浊液，转速为5000rpm、离心时间5分钟，除去上清液，进行冷冻干燥，收集白色多肽粉末，制得分子量2kDa的两亲性结合物。实施例2PNP/siRNA/抗体复合物的制备本实施例所述方法同样适用于PNP/DNA/抗体复合物的制备，制备时，将本实施例中的siRNA替换为相应的DNA即可。PNP/siRNA/抗体复合物按照如下步骤的方法制备而成：(1)首先将上述制成的两亲性结合物(分子量2423)制备成10mg/mL的二甲基亚砜(购自国药集团化学试剂北京有限公司)储存液。将5μL储存液稀释在100μLDEPC水中，超声5min使其形成颗粒均匀、稳定的多肽纳米颗粒PNP(即前文所述的纳米基因载体)。(2)将negativecontrolsiRNA(委托上海吉玛公司合成)溶于DEPC水中，震荡混匀，配置成0.13mg/mL工作液。立即将50μLsiRNA溶液加入到50μL多肽纳米颗粒溶液中，轻轻震荡混匀，室温孵育20-30min形成PNP/siRNA复合物。形成的PNP/siRNA复合物中，PNP与siRNA的电荷比为20:1。(3)将抗体(购自美国R&DSystems公司)干粉用PBS溶解，制备成1mg/mL工作液，按PNP与抗体质量比10:1加入抗体。混匀后室温孵育20-30min形成PNP/siRNA/抗体复合物。将上述制备的复合物溶液用PBS缓冲液(购自维森特)稀释至1mL，放入激光粒度仪自动检测粒径和Zeta电位(英国马尔文公司，型号ZetasizerNanoZS)。粒径测量结果如图1A所示，将上述siRNA替换为DNA，PNP/DNA/抗体平均粒径90nm左右，分散良好粒径均一。Zeta电位测量如图1B所示，可见纳米基因载体带正电荷，为+30mV左右，吸附一定量的DNA后，Zeta电位下降为+25mV左右。进一步加入单克隆抗体，抗体与纳米基因载体吸附后可见纳米颗粒电荷反转，表面Zeta电位下降为-10mV左右。实施例3TEM观察形貌取实施例2中制备的PNP/siRNA/抗体复合物溶液10μL用于TEM测试。将复合物小心地滴到干净的铜网(购自北京中镜科仪技术有限公司)，片刻后吸去样品室温干燥，用醋酸双氧铀(购自北京中镜科仪技术有限公司)染色8min，室温干燥至少1h后进行电镜(日本日立公司，型号HT7700)观察。实验结果见图2。由图2可见，PNP/DNA/抗体复合物形成球形纳米级粒子，粒径均一，分散良好。实施例4琼脂糖凝胶电泳阻滞实验新鲜制备不同质量比的PNP/siRNA复合物，室温下孵育20min，加入上样缓冲液和SYBRGREEN(北京索莱宝科技有限公司)后混匀，将混合溶液载于1％琼脂糖凝胶上，在TAE电泳缓冲液中100V电压下电泳5～10min后紫外曝光拍照。琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果如图3所示。从图3中可见，与裸siRNA相比，PNP/siRNA复合物向正极迁移受阻，在PNP：siRNA质量比为1:1时，复合物不带电荷，滞留在胶孔中，逐渐增加PNP的量，可见复合物向负极方向迁移，证明核酸可被完全吸附于PNP/siRNA复合物中，且复合物此时带正电荷。实施例5细胞毒性实验将人前列腺癌PC-3细胞以起始密度1*104/孔接种到96孔板中，培养18-20h后吸去培养液，PBS洗2次，每孔加入200μL含不同浓度(25μg/mL～200μg/mL，以PNP的量计算，PNP：siRNA电荷比均为25：1)的PNP/siRNA、PNP/siRNA/抗体复合物、PEI25K和Lipofectamine2000，每组4个复孔，培养24h；吸弃培养基，每孔加入100μL含10％CCK-8试剂(日本同仁化学)的无血清培养基，37℃孵育1h，用酶标仪测定450nm处吸光度(OD值)，计算相对细胞存活率。细胞存活率(％)＝(OD样品组-OD空白孔)/(OD对照组-OD空白孔)*100％其中OD样品组为个给药组450nm处吸光度平均值，OD对照组为个未处理细胞组450nm处吸光度平均值，OD空白孔只加入CCK-8试剂组处吸光度平均值由图4可知，400μg/mLPNP/siRNA/抗体在所测浓度下，对PC-3细胞几乎没有毒性，相比之下，用PEI25K和Lipofectamine2000(Invitrogen)处理组，细胞存活率分别下降75％和18％。实施例6基因转染评价(1)细胞摄取实验：按上述实施例2制备PNP/siRNA/抗体复合物(本实施例中siRNA采用FAM标记，FAM-siRNA委托上海吉玛公司合成)，测定其体外转染效果，具体方法如下：以表达成纤维细胞活化蛋白的肿瘤相关成纤维细胞CAF作为考察对象，将对数生长的CAF接种于24孔细胞培养板，每孔1*105个，于37℃和5％CO2培养24h至细胞达到70％～80％融合，弃培养基，用PBS缓冲液洗涤三次。然后分别加入荧光标记的siRNA及转染复合物：FAM-siRNA，PNP/FAM-siRNA复合物和PNP/FAM-siRNA/抗体复合物于37℃和5％CO2培养6h。收集细胞，台盼蓝处理30s猝灭细胞表面荧光。流式细胞仪检测细胞对上述复合物的摄取情况(结合图5所示)。(2)转染效率评价：按实施例2所述的方法制备PNP/siRNA/抗体复合物，不同的是将negativecontrolsiRNA替换为针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA特异性siRNA序列(委托上海吉玛公司合成)。制备的PNP/siRNA/抗体复合物中，PNP与siRNA的电荷比为25:1；PNP与抗体的质量比为10:1。将DEPC水均替换为无血清培养基。将CAF细胞按每孔将对数生长的CAF接种于24孔细胞培养板，每孔1*105个，于37℃和5％CO2培养24h至细胞达到70％融合，将细胞分为空白对照组，PNP/NC-siRNA/抗体组，PNP/anti-GAPDH组，PNP/anti-GAPDH/抗体组，PNP/anti-GAPDH/IgG组，其中anti-GAPDH为抑制GAPDH表达的siRNA，而NC-siRNA不对相关的表达产生影响，IgG为所用抗体同种来源同型对照。各对照组siRNA浓度均为100nM。采用Western蛋白免疫印记法测定转染复合物转染anti-GAPDHsiRNA对CAF细胞GAPDH蛋白的抑制作用，重复3次，转染48h后取蛋白检测。曝光结果见图6A,从图6A中可以看出，与PNP/NC-siRNA/抗体组相比，PNP/anti-GAPDH组，PNP/anti-GAPDH/抗体组均显示出了良好的RNA干扰效果。PNP/anti-GAPDH/IgG组没有显示出转染功能，表明表面IgG无法脱落而屏蔽掉了PNP的穿膜功能，这一现象为靶向转染提供了依据，即PNP/RNA/抗体复合物只能对表达其吸附的抗体相应抗原的细胞进行转染。将Western蛋白免疫印记法结果用光密度软件ImageJ进行分析并计算蛋白相对表达率。GAPDH蛋白相对表达率(％)＝(实验组条带光密度/对照组条带光密度)*100％通过光密度分析软件对图6A中条带进行分析，以PNP/NC-siRNA/抗体组作为对照组按式进行计算，分析结果见图6B。对比例1本对比例与实施例6的区别在于：(2)转染效率评价：改变PNP/siRNA的正负电荷比(N:P，N表示多肽的氨基基团，P表示核酸的磷酸基团)，探索N:P比值变化对RNA沉默效果的影响。根据实施例2构建不同N:P的PNP/siRNA复合物(此处忽略抗体对于体系的影响，直接模拟抗体从纳米颗粒表面脱落后的转染过程)，不同的是将negativecontrolsiRNA替换为针对绿色荧光蛋白(GFP)的mRNA特异性siRNA序列(委托上海吉玛公司合成)。将稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人乳腺癌细胞系MB-MDA-231细胞接种于48孔细胞培养板，每孔6*104个，于37℃和5％CO2培养24h至细胞达到70％融合。将不同N:P的转染复合物加入到孔板中，siRNA浓度保持在100nM，每组4个重复。转染36h后，弃去培养基PBS洗2次，每孔加入100μlRIPA裂解液(高效)(北京索莱宝科技有限公司)冰上裂解15min。收集含有蛋白的裂解液，测定激发波长460nm，发射波长506nm处的荧光强度(Fluorescenceintensity，FI)。相对荧光强度(％)＝(FI实验组-FI空白孔)/(FI对照组-FI空白孔)*100％其中FI实验组为实验组每组FI的平均值，FI空白孔为只有裂解液没有细胞的孔。FI对照组为不加转染复合物处理的细胞组。实验结果如图7所示，因绿色荧光蛋白荧光强度与其表达量成正比，根据图7可知，N:P在20:1至60:1范围内均可达到约50％的RNA干扰效果。根据实施例5细胞毒性结果可知，增加PNP(N)比例会增加转染复合物毒性，故优选多肽与核酸的比例为20:1-50:1。对比例2本对比例与实施例2的区别在于：取实施例2中电荷比为20:1的PNP/siRNA复合物，加入不同量的抗体或人IgG，使形成的PNP/siRNA/抗体(或IgG)复合物中，PNP与蛋白(抗体或人IgG)的质量比依次减小(50:1-5:1)。(见表1)通过动态光散射对PNP/siRNA/抗体(或IgG)复合物的Zeta电位进行测量。与实施例2(10:1)相比，高于此比例的转染复合物抗体吸附不足导致纳米粒子带正电或Zeta电位大于-10mV；低于此比例的转染复合物Zeta电位不低于-10mV，证明实施例2中比例(10:1)时抗体吸附已达到饱和。根据对比例1，多肽与抗体的质量比可在10:1至5:1范围内变动。表1PNP/siRNA中加入不同比例抗体对Zeta点位的影响。PNP/siRNA:蛋白(w:w)PNP/siRNA50:120:110:15:1PNP/siRNA/抗体(mV)24.3±2.517.8±1.2-6.3±0.9-10.2±1.4-10.8±1.7PNP/siRNA/mAb(mV)24.3±2.518.8±2.1-2.7±1.7-10.1±1.7-9.7±1.5虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3