一种制备靶向载药微气泡的方法及装置与流程

本发明涉及一种制备靶向载药微气泡的方法，特别是适用制备微气泡超声造影剂的方法，及可适用于该方法的装置。

背景技术：

常用的制备微气泡超声造影剂的方法有超声空化法，冷冻干燥法，同轴静电雾化法，高剪切乳化法等等。而这些方法所制备的微气泡尺寸不均一，粒径不可控，无法共振增强超声成像，并且药物包封率不高，稳定性差，靶向性也不强，无法制备出理想的靶向载药超声造影剂。

近年来微流控芯片技术已开始用于微纳米材料制备的研究，对于应用微流控方法制备微气泡超声造影剂的研究也已经起步。微流控芯片是指通过光刻等技术在数平方厘米的玻璃或高聚物表面刻画几十到几百微米大小通道用于流体控制的微型实验平台。在微流控芯片通道中，当气体以一定流速进入液体流后，在表面张力作用下，气体流可自发断裂形成一个个微气泡。与传统方法相比，微流控技术因为是在连续流中制备微气泡，制备条件均一可控，因此所获得的微气泡具有高度的单分散性和尺寸均一性。若将药物溶于油相，利用水、油、气三相流体微流控芯片技术，则理论上可将药物可控封装在脂质微气泡的油膜中，形成磷脂包裹载药油层、内核为气体的三相微气泡，保证很好的药物包封率。

目前国内外一般采用流动聚焦型和内置毛细管T型结构这两种常见的微流控芯片制备微气泡，但是所制备的微气泡粒径较大，同时制备产率较常规方法低很多，导致效率低下。提高产率可以在提高单个微流控芯片产率的基础上依靠规模化、集成化的微流控芯片组来实现，而制备微小粒径、性质更稳定的微气泡则是目前微流控技术制备载药微气泡所面临的挑战。目前应用微流控芯片技术已经能够实现制备5μm以下微气泡的课题组并不多，国外主要通过在微流控芯片中裹挟气体通过几微米大小的喷嘴制备小粒径微气泡，这样制备的微气泡稳定性较差且不能用于载药，同时其特制的微流控芯片喷嘴需要超高精度的光刻制备技术，价格昂贵不适合量产。尤其是，微流控制备方法在解决微气泡稳定性及拥有用于载药的油层结构等问题上尚无有效方法。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供一种稳定性好的拥有三相载药微气泡结构的方法。

本发明的进一步目的还在于提供一种可有效制备粒径小，包封率完全，且稳定性好的拥有三相载药微气泡结构的方法。

本发明的另一目的旨在提供适用于上述方法的一种特别的装置。

本发明的方案是，该载药微气泡是由微流控方法制备的气相内核、油相中间层、外壳为磷脂和靶向分子薄膜层的三相微气泡；其制备过程是：对微流控芯片和水、油、气三相进行加热的同时，对各通道分别通入油、气、水相制备三相微气泡，制备完成后再降温固化收集，其中加热温度高于油相熔点；所述的油相为熔点不低于20℃的憎水化合物；微流控芯片的各通道端口在交叉口中心处间隙距离为不高于10μm，其中气相、油相通道的端口处设置成毛细管大小。

微流控芯片的气相、油相通道的端口可以直接制备成毛细管大小，或是在气相、油相通道内插设有毛细管。

本发明的所述的微流控芯片的内部通道可以是十字型、米字型或是其它可实现制备三相微气泡的形状。

所述的油相中加入有药物、磷脂及靶向分子成分，在油、气、水三相界面处水相切割气相和油相形成微气泡，

发明人通过研究意外的发现通过本发明以上方案的油、气相通道端口在交叉口中心处毛细管大小控制、以及对微流控芯片加热条件的控制及油相的选择可以解决现有技术中一直困扰技术人员三相微气泡稳定性问题，在对微流控芯片加热过程，油相所进行加热降温冷却过程中起到对三相微气泡良好的稳定性作用。

本发明优选微流控芯片的各通道端口在交叉口中心处间隙距离为1～10μm.

本发明优选在十字型微流控芯片，在十字型微流控芯片左右两个通道分别插入毛细管至十字交叉口中心处，两个毛细管的端口在所述的十字交叉口中心处的间隙距离为1～10μm；毛细管的内径为1～20μm，毛细管紧贴在十字型微流控芯片通道壁上；对十字型微流控芯片和水、油、气三相进行加热的同时，向十字型微流控芯片左右两通道的毛细管内分别通入油相和气相，十字型微流控芯片的上端通道则通入连续相水相；所述的油相中加入有磷脂及靶向分子成分，在油、气、水三相界面处水相切割气相和油相形成微气泡，油相自发包裹气相形成膜层中间层，磷脂和靶向分子自发分布于水油界面外层。

本发明的方案中优选油相为熔点不低于30℃的憎水化合物。本发明所述的油相进一步优选为溶点30-90℃的憎水化合物。

本发明的油相可以为脂肪酸等。

所述的磷脂为二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺DPPE、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸DOPS、二硬脂酰基磷脂酰胆碱DSPC、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油DPPG、二硬脂酰磷脂酰甘油DSPG、二棕榈酰磷脂酸DPPA、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺DSPE和磷脂的PEG化产物中的一种或几种。

所述的油相优选为癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸中均加有质量含量为1％-20％磷脂后中的一种；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸中均加质量含量为0.1％-10％胆固醇后中的一种；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸中均同时加了质量含量为0.1％-10％胆固醇和质量含量为1％-20％磷脂后中的一种；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸中均同时加了1％-20％的磷脂后中的一种；或是在癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸中同时加了质量含量为0.1％-10％胆固醇和质量含量为1％-20％的磷脂后中的一种。

所述的油相用于携带药物，所述的药物为溶血栓药物和/或抗肿瘤药物。

所述气相为空气、氮气、SF6或C3F8。

所述的连续相水相中添加有表面活性剂。所述的表面活性剂为吐温20、丙二醇+甘油、PEG，PVA，甘油+PVA，脂质体，葡萄糖浆中的一种或几种。

所述的靶向成分为靶向血栓分子及靶向肿瘤分子；

对十字型微流控芯片进行加热的温度为20～99℃；优选为20～90℃；本发明进一步的优选为30～80℃。

微气泡通过十字型微流控芯片的收集口处流出时，降温至-5～25℃进行固化处理；优选为-5～5℃。

本发明优选的水相的流速为1-1000μl/min。优选的油相的流速为0.1-100μl/min。优选的气相的压力为0.1-50atm。

本发明更优选的水相的流速为50-100μl/min。更优选的油相的流速为1-10μl/min。更优选的气相的压力为2-10atm。

本发明通过设置毛细管内径的微流控芯片。在芯片左右两个通道分别插入端口平齐的毛细管，紧凑相交于十字交叉口中心处，两毛细管口精确控制在1-10μm。首先，将分散相和连续相引入十字型芯片，其中作为分散相的油相和气相分别从芯片左右两端毛细管通道通入，连续相(水相)从上端通道通入。在三相界面处，油相和气相被从毛细管中挤出，在表面张力的作用下，首先形成油气界面，当相对于油相流速较快的气相被水相“切割”形成气泡时，油相自发包裹气相，形成油包气的气泡。其中，油相的成分可以为脂肪酸，在油相中加入磷脂，可形成以磷脂为核壳，油相包围气相的三相微气泡。在油相中再加入油溶性药物，可制得包封率完全，有磷脂作为核壳保护的载药微气泡。同时，如果将磷脂与相应的配体进行结合，可实现微气泡的靶向载药功能。最后，微气泡通过收集口处流出，用冰块将其降温，进行固化，制备尺寸均一可控的稳定的微气泡。在该过程中，本发明通过加热温度控制油相并配合磷脂在油水界面自发形成稳定的单分子膜，待制备的微气泡冷却后，通过固化的油相和磷脂膜共同稳定微气泡。

本发明还提供设计了一种用于所述的制备靶向载药微气泡超声造影剂方法的恒温装置，包括恒温保护套，加热器，温控器，微型注射泵；恒温保护套包括支撑基座，加热器盖板，恒温保护套盖板；支撑基座底层设有加热器，加热器上方覆盖有加热器盖板，芯片设置在加热器盖板上；所述加热器外接有温控器；支撑基座的上层一端设有为微型注射泵，微型注射泵通过硅胶输液管与芯片内的通道相连通。

所述的微型注射泵包括水相注射泵、气相注射泵、油相注射泵。

所述的恒温装置，恒温保护套盖板对应芯片上端位置处设置为透明材质。

所述的恒温装置，所述的加热器盖板上设置有多个空心小孔。空心小孔的孔径可设置为0.4-1cm。

加热器盖板上有一空心圆柱，直径为2.5cm，用于储备油相。将固体油相装入注射器中，后将注射器放入加热器盖板上圆柱形孔中进行固定。放置完毕后，盖上装置盖板，以保证保温效果。

将芯片气相分散相及水相连续相的硅胶输液管通过盖板小孔穿出，在外连接注射泵。最后，在恒温保护套盖板上层对应芯片的空缺处盖上有机玻璃盖板，有利于观察微气泡的生产情况及进行一些简单的芯片移动。

附图说明

图1为一种用于三相载药微气泡生成的微流控芯片平面示意图。其中a为连续相入口及通道，b,c为分散相入口及通道，d为两分散相毛细管接口，e为微气泡通道及微气泡。

图2为实施例1制备的微气泡图。

图3为实施例1制备的载药微气泡图。

图4为本发明设计的微气泡制备装置系统结构示意图。图中的反应器即恒温保护套。

图5为恒温保护套支撑基座示意图；图中左部上层可设置微型注射泵；右部下层设置有加热器。

图6中加热器盖板上设有空心圆柱的示意图，其中空心圆柱用于储备油相。

图7为加热器盖板的示意图。

图8为恒温保护套盖板的示意图，其顶面的一部分，可对应芯片位置，并设置为透明材质。

图9为常温下(a)和60度恒温下(b)制备的三相微气泡稳定性对照。

图10为调节水油气条件控制产生不同大小的微气泡。

图11为收集到的不同尺寸的微气泡。

图12为分别使用癸酸、月桂酸、棕榈酸为油相，分别在(a)40℃、(b)60℃、(c)70℃下制备微气泡。

具体实施方式

实施例1

将加热器放入恒温保护套支撑基座底层右端空缺处(如图4所示)，加热器连接线通过右端方形小孔处移出，在外连接温控器进行加热。盖上加热器盖板(如图7所示)。在恒温保护套支撑基座上层左端放入微型油相注射泵，用螺丝钉进行固定。将微流控芯片放于右端的加热器盖板中央，通过四个较大的圆孔，用螺丝钉进行固定。将含5％DPPC的月桂酸(熔点44-46℃)装入微型玻璃瓶，再放置于右端加热器盖板上空心圆柱内，作为油相储存处与油性注射泵进行连接。固定完成后，盖上恒温保护套盖板(如图8所示)，芯片输液硅胶管通过盖板小孔处输出与外界注射泵进行连接。盖上恒温保护套盖板的有机玻璃盖板。玻璃板上方与显微镜等观察设备相连，构成整个微气泡制备系统(如图4所示)。

加热，将温度维持于60℃左右，使月桂酸能完全熔化。微流控芯片的宽度及高度均为100μm。如图2，芯片a通道处通入含5％PEG的水溶液，芯片b通道处通过20μm内径毛细管通入含5％磷脂DPPC的月桂酸，芯片c通道处通过20μm内径毛细管通入空气。其中水相流速为80μL/min，油相流速为0.5μL/min，通入的空气气压为2atm。在三通道汇聚的喷口处，溶有磷脂的油相在表面张力作用力下，自发包围气相形成微气泡，磷脂在水相和油相之间自发生成磷脂膜，从而在三相结合处获得以磷脂为壳膜、油相内包含气相的尺寸均一的微气泡超声造影剂。所制得的微气泡通过100μm内径的毛细管导出，在外收集并用冰块降温，使含有磷脂的月桂酸及时固化，提高其稳定性。将收集的微气泡于显微镜下拍照，如图2所示。通过调节水相流速的大小可以改变微气泡的尺寸，如图10所示，制备出5μm至100μm大小的微气泡(如图11所示，气泡尺寸分别为5μm，10μm,50μm)。

实施例2

其它操作步骤同实施例1，原料药为阿霉素。方法为将阿霉素溶于油相制备载阿霉素微气泡。如图3所示，在绿光激发下，载有阿霉素的微气泡外周发红光，而溶液不发光，证明药物100％包裹于微气泡的油层。并且，通过改变油相流速控制油膜厚度，发现阿霉素的荧光强度发生了相应的改变，证明该制备方法具备调控微气泡载药量的能力。

对比例1

其它操作步骤同实施例1，是常温下制备三相微气泡。

将实施例1的60度恒温下制备的三相微气泡和对比例1为常温下制备的三相微气泡稳定性进行比对。如图9所示，图9(a)的放置24小时后，相当一部分的微气泡已不存在了，而图9(b)在放置24小时，乃至18天后仍没有消失，稳定存在。制备温度超过油相熔点后所制备的三相微气泡稳定性大大提高。

发明人通过本发明的方法配置不同的气相、水相、油相的原料，目前可成功制备出在常温下稳定存放20天的微气泡(如图12所示，气泡放置时间分别为1分钟，1天,20天)。使用不同熔点的脂肪酸作为油相时，加热温度不同。分别使用癸酸(熔点32℃)，月桂酸(熔点44～46℃)，棕榈酸(熔点63℃)为油相，分别在40℃，60℃，70℃下制备微气泡。(如图12，(a)、(b)、(c)所示)。