一种荷载乳腺癌靶向磁性纳米药物的纤维素膜的构建方法及其应用与流程

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种荷载乳腺癌靶向磁性纳米药物的纤维素膜的构建方法及其应用。

背景技术：

乳腺癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，近几年逐渐跃居女性恶性肿瘤的首位。据有关统计，我国许多大城市的乳腺癌发病率正在以快速增长的趋势逐年上升，年平均增长速度远高于世界平均增长速度。同时，我国乳腺癌的死亡率也呈缓慢的上升趋势，而且乳腺癌的发病年龄出现了年轻化的倾向，其发病的中位年龄是48岁，比西方国家提早了10年，对女性的身心健康构成了严重威胁。

目前乳腺癌的治疗是以手术为主，配合术后放化疗、内分泌治疗及靶向治疗等的综合疗法，虽然治法已经比较完善，但仍有许多患者会发生复发、转移，而且放、化疗的不良反应及药物的耐药也成为许多患者治疗上的障碍。

纳米生物技术作为纳米技术与生物技术相结合的产物，在疾病的诊断及治疗方面具有十分广阔的应用前景，应用纳米材料作为药物载体早已成为纳米医学研究领域的前沿方向。国内外更是开展了很多用靶向纳米药物抑制各类癌细胞生长的研究。近年来由于乳腺癌发病率的持续高升，针对乳腺癌靶向治疗的研究方兴未艾，出现了抗体介导的靶向、微载体介导的靶向、乳腺癌干细胞靶向等研究领域，为乳腺癌的治疗研究奠定了理论基础。近几十年研究发现，纳米技术联合药物对退行性疾病，如肿瘤、糖尿病和心血管疾病等的预防以及治疗有着不容忽视的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有恶性肿瘤尤其是乳腺癌的治疗药物的缺陷和不足，提供一种荷载肿瘤靶向磁性纳米药物的纤维素膜的构建方法。

本发明另一目的是提供所述荷载肿瘤靶向磁性纳米药物的纤维素膜的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种荷载肿瘤靶向磁性纳米药物的纤维素膜的构建方法，包括如下步骤：

S1.肿瘤靶向纳米药物(MHNP/HMME/DOX/FA)的制备

通过化学修饰的方式使叶酸(FA)具有光活性，将光活性叶酸固定于磁性水凝胶(MHNP)上，再将血卟啉单甲醚(HMME)与肿瘤治疗药物吸附于所述磁性水凝胶中；

S2.荷载肿瘤靶向磁性纳米药物的纤维素膜(BC/MHNP/HMME/DOX/FA)的制备

通过培养木醋杆菌，静态发酵产生纤维素膜，并在避光条件下，将步骤S1制备的肿瘤靶向纳米药物溶液没过纤维素膜，60～80rpm/min处理8～20h后取出进行真空冷冻干燥。

其中，优选地，步骤S1所述肿瘤治疗药物为阿霉素(DOX)。

优选地，步骤S1所述光活性叶酸(AzPhFA)的制备方法为：在带盖的深色容器中，将叶酸加入含N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，在冰浴、避光的条件下搅拌反应40～50h；将混合溶液透析得到光活性叶酸，冷冻干燥。

优选地，得到的光活性叶酸在使用前，加入50ml的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度1ng/μl。

在光活性叶酸(AzPhFA)的制备过程中，优选地，所述叶酸和含N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的质量体积比为1～5μg：1ml。

更优选地，所述叶酸和含N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的质量体积比为2μg：1ml。

优选地，所述含N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，N-琥珀酰亚胺酯的浓度为25～35μg/ml。

更优选地，所述含N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，N-琥珀酰亚胺酯的浓度为30.72μg/ml。

优选地，所述含N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，二甲基甲酰胺DMF和PBS的体积比为2～5：1。

更优选地，所述含N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，二甲基甲酰胺DMF和PBS的体积比为4：1。

优选地，所述含N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的pH＝7～8。

更优选地，所述含N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的pH＝7.4。

优选地，所述冰浴是4℃冰浴。

优选地，所述搅拌反应的时间为48h。

优选地，所述透析是使用透析袋(MWCO:Nominal:500)进行透析三天。

另外，优选地，步骤S1所述磁性水凝胶(MHNP)的制备方法为：

(1)制备光活性水凝胶(AzPhNIPA-AA)：将水凝胶溶于PBS缓冲液中得到水凝胶溶液，然后将水凝胶溶液加入到含有叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，在冰浴条件下搅拌反应40～50h；将混合溶液透析纯化得到叠氮苯基衍生物，真空冷冻干燥；使用前，向其中加入PBS溶液溶解，配制成一定浓度溶液待用。

(2)制备磁性水凝胶(MHNP)：通过光化学固定法—液态光接枝法将水凝胶接枝到纳米粒表面；具体是：避光条件下，将光活性水凝胶溶于PBS缓冲溶液中，加入油酸改性后的四氧化三铁纳米粒(Fe₃O₄-OA)，混合均匀，并超声分散清洗后，振荡条件下于120～130W紫外灯下8～12cm处照射15～25min后，真空冻干。

在磁性水凝胶(MHNP)的制备过程中，优选地，步骤(1)所述水凝胶和PBS缓冲液的质量体积比为0.01g：5～15ml。

更优选地，步骤(1)所述水凝胶和PBS缓冲液的质量体积比为0.01g：10ml。

优选地，步骤(1)所述PBS缓冲液的pH＝7～8。

更优选地，步骤(1)所述PBS缓冲液的pH＝7.4。

优选地，步骤(1)所述水凝胶溶液和含有叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的体积比为1：3～5。

更优选地，步骤(1)所述水凝胶溶液和含有叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的体积比为1：4。

优选地，步骤(1)所述含有叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，叠氮苯胺盐酸盐的浓度为1～2mg/ml。

更优选地，步骤(1)所述含有叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，叠氮苯胺盐酸盐的浓度为1.5mg/ml。

优选地，步骤(1)所述含有叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，二甲基甲酰胺DMF和PBS的体积比为3～5：1。

优选地，步骤(1)所述含有叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，二甲基甲酰胺DMF和PBS的体积比为4：1。

优选地，步骤(1)所述含有叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的pH＝7～8。

优选地，步骤(1)所述含有叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的pH＝7.4。

优选地，步骤(1)所述冰浴条件下搅拌反应的时间为48h。

优选地，步骤(1)所述透析使用透析袋(MWCO:Nominal:500)透析三天。

优选地，步骤(2)所述光活性水凝胶和PBS缓冲溶液的质量体积比为8～12μg/ml。

更优选地，步骤(2)所述光活性水凝胶和PBS缓冲溶液的质量体积比为10μg/ml。

优选地，步骤(2)所述油酸改性后的四氧化三铁纳米粒(Fe₃O₄-OA)和光活性水凝胶的PBS溶液的质量体积比为1：8～12。

更优选地，步骤(2)所述油酸改性后的四氧化三铁纳米粒(Fe₃O₄-OA)和光活性水凝胶的PBS溶液的质量体积比为1：10。

优选地，步骤(2)所述油酸改性后的四氧化三铁纳米粒(Fe₃O₄-OA)的制备方法为：化学共沉淀法制备四氧化三铁纳米粒，通过自组装的形式将油酸包裹在纳米粒表面，合成Fe₃O₄-OA。

优选地，步骤(2)所述超声分散清洗的时间为30～60分钟。

优选地，步骤(2)所述振荡条件下于125W紫外灯下10cm处照射20min。

另外，优选地，步骤S1所述将光活性叶酸固定于磁性水凝胶(MHNP)上方法是通过光接枝的方法，具体为：将磁性水凝胶(MHNP)溶于PBS缓冲溶液中，然后向其中加入光活性叶酸，在避光条件下混合均匀，并超声分散清洗后，于120～130W紫外灯下8～12cm处照射15～25s，真空冻干。

所述光接枝的过程中，优选地，所述磁性水凝胶和PBS缓冲溶液的质量体积比为1mg：8～12ml。

更优选地，所述磁性水凝胶和PBS缓冲溶液的质量体积比为1mg：10ml。

优选地，所述磁性水凝胶和光活性叶酸的质量比为80～120：1。

更优选地，所述磁性水凝胶和光活性叶酸的质量比为100：1。

优选地，所述超声分散清洗的时间为30～60分钟。

优选地，所述125W紫外灯下10cm处照射20s。

另外，优选地，步骤S1所述将血卟啉单甲醚(HMME)与肿瘤治疗药物吸附于所述磁性水凝胶中的方法为：将磁性水凝胶溶于PBS缓冲液中，向其中加入溶于PBS缓冲溶液的血卟啉单甲醚和肿瘤治疗药物，冰浴搅拌三天，使磁性水凝胶充分吸附血卟啉单甲醚和肿瘤治疗药物；将反应液除去未吸附到水凝胶里的血卟啉单甲醚和肿瘤治疗药物，冻干。使用前加入PBS，将药物溶液取出并通过过滤除菌，调至100ng/μl备用。

优选地，所述磁性水凝胶与PBS缓冲液的质量体积比为1mg：2～5ml。

更优选地，所述磁性水凝胶与PBS缓冲液的质量体积比为1mg：4～5ml。

优选地，肿瘤治疗药物为阿霉素。

优选地，所述磁性水凝胶与血卟啉单甲醚或肿瘤治疗药物的质量比为1：1。

优选地，所述除去未吸附到水凝胶里的血卟啉单甲醚和肿瘤治疗药物的方法为：将反应液迅速转移至新的容器中，并在其下方置一块磁铁，静置0.8～1.5(优选为1h)后，振荡5～7(优选为6h)，再次静置，连续3～5次；再重复加入PBS重复上述步骤，以除去未吸附到水凝胶里的血卟啉单甲醚和肿瘤治疗药物。

另外，优选地，步骤S2所述木醋杆菌的静态发酵方法为：木醋杆菌用活化培养基培养20～30小时(优选为24小时)后，接种于有发酵培养基的三角瓶中，于35～38℃(优选为37℃)的生化培养箱中静态培养7～10天后，即可得到细菌纤维素膜。

优选地，所述活化培养基：葡萄糖15～25g/L、蛋白胨3～7g/L、酵母粉3～7g/L、磷酸二氢钠2～3g/L、柠檬酸1～1.5g/L、pH＝5。

更优选地，所述活化培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、磷酸二氢钠2.7g/L、柠檬酸1.15g/L、pH＝5。

优选地，所述发酵培养基：葡萄糖25～35g/L、蛋白胨7～8g/L、酵母粉8～12g/L、磷酸二氢钠7～8g/L、柠檬酸0.3～0.7g/L、pH＝6～7。

更优选地，所述发酵培养基：葡萄糖30g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉10g/L、磷酸二氢钠7.5g/L、柠檬酸0.5g/L、pH＝6.5。

优选地，步骤S2所述木醋杆菌静态发酵产生的纤维素膜需要先放入NaOH溶液中，70～90℃(优选为80℃)水浴浸泡碱处理后，进行真空冷冻干燥处理。

优选地，所述NaOH溶液的浓度为8～12％。

更优选地，所述NaOH溶液的浓度为10％。

优选地，所述NaOH溶液浸泡的时间为10～15h。

更优选地，所述NaOH溶液浸泡的时间为12h。

优选地，步骤S2中制备荷载肿瘤靶向磁性纳米药物的纤维素膜的具体方法是：避光条件下，将PBS磷酸缓冲液配制的靶向磁性纳米药物溶液滴加于干燥的纤维素膜上直至能没过纤维膜，避光条件下，置于摇床上12h后取出进行真空冷冻干燥；4℃储存备用。

另外，本发明制备的荷载肿瘤靶向磁性纳米药物的纤维素膜在制备肿瘤治疗药物方面的应用，也咋本发明的保护范围之内。

优选地，所述肿瘤治疗药物为阿霉素。

优选地，所述肿瘤为乳腺癌。

更优选地，所述乳腺癌的细胞系为人乳腺癌MCF-7细胞系。

本发明中，纤维素膜是由木醋杆菌经静态发酵产生纤维素，通过氢氧化钠溶液中80摄氏度水浴2小时处理后而成，乳腺癌靶向磁性纳米递药系统是在前期光化学固定法将具有温度和pH敏感性的水凝胶接枝到四氧化三铁纳米粒表面形成磁性水凝胶载体基础上，在水凝胶表面接枝靶向分子配体叶酸，同时吸附阿霉素和血卟啉单甲醚。

本发明中，通过利用超顺磁性的纳米磁性粒子通过具有温度和pH敏感性的水凝胶携带抗癌药物阿霉素(DOX)与光敏剂血卟啉单甲醚(HMME)，以及叶酸表面修饰后介导靶向，并将修饰后的纳米粒子荷载于天然的纤维素膜上，结合外部施加磁场与激光宏观靶向，构成纳米靶向递药系统。通过外敷的给药方式作用到癌变部位，同时还可以辅助外加磁场的方式宏观靶向将抗乳腺癌药物运送至肿瘤细胞周围，同时借助叶酸的微观靶向实现与乳腺癌细胞表面受体结合，同时外加激光使光敏剂血卟啉单甲醚协同抗肿瘤药物阿霉素随载体进入细胞后释放诱导乳腺癌细胞程序性死亡，从而达到高效靶向抑制癌细胞生长的效果。实验证明本发明所述递药系统具有毒副作用低，并且结合了光动力疗法与化疗协同抑制的目的，是一种新型的多重靶向给药系统。

本发明具有以下有益效果：

本发明制备的荷载乳腺癌靶向磁性纳米药物的纤维素膜(文中简称复合纤维素膜)，具有较好的稳定性、分散性以及均一性，实现了载药磁性纳米药物与细胞靶向(叶酸)结合磁场与激光的有机结合，构成了一种新型的抑制乳腺癌细胞生长的治疗系统，纤维素膜负荷载药靶向磁性纳米粒子(BC/MHNP/HMME/DOX/FA)的乳腺癌靶向磁性纳米递药系统，同时外加磁场和激光处理后对乳腺癌细胞生长抑制率最高，有明显的高效靶向抑制乳腺癌细胞生长的效果。

本发明中的乳腺癌靶向磁性纳米递药系统成功合成，并构建新型的联合治疗系统，所设计制备的荷载磁性纳米粒子的复合纤维素膜，协同磁场与激光的乳腺癌靶向联合治疗系统融合物理与生物的靶向机制，化疗与光动力治疗的双重抑制乳腺癌机制，能够高效抑制乳腺癌细胞的生长，这为乳腺癌的精准化个体化综合治疗和靶向药物治疗临床治疗提供了新的思路，具有很好的应用于临床治疗乳腺癌前景。

而且，本发明中将光敏剂利用磁性纳米粒子载体携带直接靶向作用于乳腺癌细胞，不仅能高效抑制乳腺癌细胞的生长，而且大大降低了常规光敏剂药物使用剂量，以及过高剂量的光敏剂对正常组织的损害

体外透皮组比静脉注射组具有更好的抑瘤效果，本发明中充分利用细菌纤维素膜的特有优势，同时结合磁性纳米粒子载体靶向给药，创新性的以敷料的方式通过经皮给药，实现乳腺癌治疗过程中的可控缓释给药，大幅度降低了乳腺癌抑制药物对正常组织的毒副作用。

附图说明

图1为纳米药物表征实验结果；其中，A：光活性叶酸接枝效率；B：磁性水凝胶血卟啉单甲醚吸附效率实验。

图2为纳米药物表征实验结果；其中，C：磁性纳米粒粒径分布；D：血卟啉单甲醚释放动力学实验。

图3为细菌纤维素膜及复合纤维素膜表征实验；其中，A：XRD结晶度检测；B：TGA热重分析。

图4为细菌纤维素膜及复合纤维素膜表征实验；其中，C：FT-IR红外光谱检测；D：Roman拉曼光谱检测。

图5为细菌纤维素膜及复合纤维素膜AFM原子力显微镜(A)与SEM扫描电镜(B)检测。

图6为磁场与激光条件下，不同纳米粒子与复合纤维素膜作用于乳腺癌MCF7细胞形态观察结果。

图7为磁场与激光条件下，磁性纳米药物与复合纤维素膜抑制乳腺癌MCF7细胞生长实验结果。

图8为磁场激光条件下流式检测细胞凋亡效果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1制备复合纤维素膜

1材料、试剂与仪器

1.1细胞株

人乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)由中国科学院深圳先进技术研究院提供，经本实验室传代培养。

1.2主要试剂、仪器

四氧化三铁纳米粒和水凝胶：为本实验室前期合成；血卟啉单甲醚：购买自广州威佳生物科技有限公司；胰酶、低糖DMEM培养基均为GIBCOBRL公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；96孔聚苯乙烯组织培养基板为美国Corning康宁公司产品。

Nikon显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，Sigma32184高速冷冻离心机，Thermo CO₂培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

2制备方法

2.1磁性纳米药物(MHNP/HMME/DOX/FA)的制备与表征

2.1.1磁性水凝胶(MHNP)的制备

(1)光活性水凝胶(AzPhNIPA-AA)的制备

称取0.01g水凝胶，溶于10ml pH＝7.4的PBS缓冲液中，吸取1ml水凝胶溶液加入到4ml含有6.00mg叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH＝7.4，体积比为4：1)溶液中，在冰浴条件下搅拌反应48h。将混合溶液转移至透析袋(MWCO:Nominal:500)纯化叠氮苯基衍生物，透析三天。取出溶液用真空冷冻干燥机(LGJ-12，BYLABO)冻干。冻干后，向其中加入PBS溶液溶解，配制成一定浓度溶液待用。

(2)磁性水凝胶(MHNP)的制备

通过光化学固定法—液态光接枝法将水凝胶接枝到纳米粒表面。避光条件下，将之前制备的光活性水凝胶溶于PBS缓冲溶液中，配制成一定浓度，加入一定量油酸改性后的四氧化三铁纳米粒(Fe₃O₄-OA)，混合均匀，并用超声波清洗器分散一段时间后转移至培养皿中；振荡条件下，于125W紫外灯下10cm处照射20min后，收集于离心管中，真空冻干后备用。

2.1.2光活性FA的制备

取一带瓶盖的棕色小瓶，分别将50μg的FA加入25ml含768μg N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH＝7.4，体积比为4：1)溶液中，在4℃(冰浴、避光)的条件下搅拌反应48h。将混合溶液转移至透析袋(MWCO:Nominal:500)纯化叶酸，透析三天，冷冻干燥备用。使用前，加入50ml的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度1ng/μl。

2.1.3光活性叶酸接枝

称取1mg磁性水凝胶(MHNP)溶于10ml PBS缓冲溶液中，吸取1ml磁性水凝胶溶液，向其中加入1μg光活性FA，MHNP与AzPhFA的比例为100:1)，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器分散一段时间后转移至培养皿中，于125W紫外灯下10cm处照射20s，真空冻干备用。

2.1.4血卟啉单甲醚(HMME)和阿霉素(DOX)吸附

(1)称取1mg上述制备的纳米药物溶于PBS＜5ml缓冲液中，向其中加入溶于PBS缓冲溶液的1mg血卟啉单甲醚或阿霉素，冰浴搅拌三天，使MHNP充分吸附药物。将反应液迅速转移至10ml管中，并在其下方置一块磁铁，静置1h后，振荡6h，再次静置，连续3-5次；再重复加入适量PBS重复上述步骤，以除去未吸附到水凝胶里的HMME与DOX。冻干，加入PBS，将药物溶液取出并通过过滤除菌，调至100ng/μl备用。

2.1.5磁性纳米药物(MHNP/HMME/DOX/FA)的表征

(1)血卟啉单甲醚水凝胶相互作用实验

1)HMME装载效率与吸附效率测定

a.取3.0mg MHNP、4.8mg(b)HMME溶于5ml PBS缓冲液中(总V＝5.6ml)，4℃冰浴搅拌3天；

b.将反应液迅速转移至10ml管中，并在其下方置一块磁铁，静置1h后，连同磁铁手动轻轻摇晃数分钟，再次静置，连续3-5次；再重复加入适量PBS；

c.收集尽可能多的吸取上清液，混匀后，取500ul，用分光光度计在390nm处测定HMME吸光度a，计算HMME含量(c值)；

d.计算HMME的吸附效率

Encapsulation efficiency(％)＝(Mb-Mc)/Mb×100％

计算水凝胶的装载效率

Loading efficiency(％)＝(Mb-Mc)/Ma×100％。

(2)释放动力学测定

取适量充分吸附装载了HMME的纳米药物载体(Fe₃O₄-OA/NIPA-AA/DOX)转移至透析袋中，分别置于4℃、37℃、41℃下的PBS缓冲溶液中进行透析，分别在0min、15min、30min、45min、1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h时间点从透析液中取出1ml置于EP管中，并向透析液中加入等体积的PBS缓冲液。最后，用高效液相色谱定量检测各时间点收集的透析液中HMME的含量，并绘制其释放动力学曲线。

(3)叶酸接枝率的检测

FA光固定于纳米粒子上之后，总质量发生变化，剩余(未固定的)FOL质量将小于固定前FA总质量。同时，分散于酒精后的密度、分光光度也将发生变化。故可采用分光光度法进行定量检测，FA与AzPhFA在280nm处都出现了最大紫外吸收峰，故可用该波长进行后续实验测定。通过对标准品FA进行紫外分光光度法进行标准曲线绘制后，进行对接枝一定量的磁性水凝胶纳米粒子前后AzPhFA样品的质量变化进行检测并进行计算(m₁，m₂)。接枝量＝m₁-m₂。

(4)磁性纳米药物(MHNP/HMME/DOX/FA)粒径大小检测

将少量的一定浓度纳米药物(Fe3O4-OA/NIPA-AA/HMME/FOL/DOX)溶液，用粒度仪(Vector-33，德国Bruker公司)表征，作图并分析其粒径大小与分布。

2.2复合纤维素膜(BC/MHNP/HMME/DOX/FA)的制备与表征

(1)细菌纤维素膜的制备

木醋杆菌静态发酵产生纤维素膜，具体方法为：木醋杆菌用活化培养基培养24小时后，接种于有发酵培养基的三角瓶中，于37℃的生化培养箱中静态培养7～10天后，即可得到细菌纤维素膜。

其中，所述活化培养基的配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、磷酸二氢钠2.7g/L、柠檬酸1.15g/L、pH＝5。

所述发酵培养基的配方为：葡萄糖30g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉10g/L、磷酸二氢钠7.5g/L、柠檬酸0.5g/L、pH＝6.5。

(2)复合细菌纤维素膜(BC/MHNP/HMME/DOX/FA)的制备与表征

木醋杆菌静态发酵产生的纤维素膜放入10％NaOH溶液中，80摄氏度水浴浸泡12h碱处理后，进行真空冷冻干燥，置于培养皿中，避光条件下，将PBS磷酸缓冲液配制的一定浓度靶向磁性纳米药物滴加于干燥的纤维素膜上直至能没过纤维膜，避光条件下，置于摇床上12h后取出进行真空冷冻干燥。4℃储存备用。并分别进行XRD、TGA、XPS、FT-IR、Roman、SEM、AFM检测。比较两种膜的性质是否发生变化。

3、结果

(1)磁性纳米药物合成与表征

1)光活性叶酸接枝效率实验

通过配制不同浓度的叶酸标准品的溶液，通过紫外可分光光度计进行对其吸光度的检测，并根据吸光度与相应的叶酸浓度进行绘制标准曲线。通过对样品进行吸光度测定，并根据上述结果进行计算可知光活性叶酸原溶液浓度31.32ug/ml，紫外接枝后剩余浓度为9.84ug/ml，光活性叶酸AzPhFA接枝量＝31.32-9.84＝21.48μg。如图1A所示。由上可知磁性水凝胶光接枝光活性的叶酸AzPhFA的就接枝率达68.58％。

2)血卟啉单甲醚标准曲线绘制与检测

通过配制不同浓度的血卟啉单甲醚HMME标准品的溶液，通过紫外可分光光度计进行对其吸光度的检测，并根据吸光度与相应的叶酸浓度进行绘制标准曲线。经过对磁性水凝胶吸附光敏剂血卟啉单甲醚前后溶液取样，并检测相应的吸光度经检测的a＝4.136，由上图经计算浓度c＝148.7677*5＝743.8385ug/ml。

则剩余HMME的含量为Mc＝743.8385*5.6＝4165.4969ug/ml＝4.165mg/ml

吸附效率(％)＝(1-4.165/4.8)*100＝13.23％

装载效率(％)＝(4.8-4.165)/1*100＝63.45％，如图1B。

3)纳米药物粒径大小检验

如图2C所示，将合成后的磁性纳米粒子配制成一定浓度的溶液并使用粒径检测仪进行检测，并将数据通过Origin8.5绘制，表明纳米药物经过接枝叶酸和吸附血卟啉单甲醚、阿霉素后粒径约在100nm左右。

4)释放动力学实验

通过紫外分光光度法进行检测不同时间段的吸光度并计算相应的HMME浓度，并进行三次重复实验，通过Origin 8.5进行数据处理。如图2D所示，可看到37℃条件下HMME释放效率约70％左右。41℃条件下水凝胶临界点处释放效率达到85％左右。

(2)纤维素膜与复合纤维素膜的表征

由图3和4可看出，通过对细菌纤维素膜与吸附纳米药物后的复合纤维素膜进行表征实验，可以看出吸附纳米药物的复合纤维素膜的结晶度并未发生明显变化(图3A)，红外光谱以及拉曼光谱(图3B和图4D)没有新的波峰出现，只是热稳定性有所提升(图4C)。初步判断，纳米粒子与纤维素膜的吸附，主要是静态吸附形成复合纤维素膜，并随纳米粒子的加入，增加了细菌纤维素膜的稳定性。

由图5可以从直观上看出，纳米粒子吸附在纤维素膜表面以及内部，部分粒子与纤维结合，初步推断可能是由于纳米粒子与纤维素膜之间形成H-O间氢键，是的纳米粒子结合于纤维素膜上。

另外，由表1的结果也可以看出，细菌纤维素膜本身主要是以碳、氧和氢为主，复合后的粒子氮元素的含量增加，主要是来自于纳米粒子中叶酸与血卟啉单甲醚等物质含有的氮元素。

表1 BC membrane和BC/MHNP/HMME/DOX/FA表面元素浓度XPS分析

综上所述，本发明的磁性纳米粒子成功合成，并通过静态吸附的方式与细菌纤维素膜以氢键的方式结合，稳定存在于细菌纤维素膜的内部与表面，形成新型的复合纤维素膜。

实施例2体外抑制乳腺癌MCF7细胞生长实验

1、细胞培养

人乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)由中国科学院大学深圳先进技术研究院提供。细胞在培养瓶中培养至80％后，以1×10⁴/孔的密度接种至24孔板上，培养12、24、36，以进行后续实验。其它细胞培养条件为：含10％新生牛血清的高糖DMEM培养基，37℃，5.0％CO₂。

2、纤维素膜荷载纳米粒子抑制MCF7生长研究

(1)细胞培养

将生长状况良好的MCF7细胞进行培养，培养基DMEM高糖有血清，待细胞长至70-80％时，进行消化处理并接板(6孔板)，接板密度约1.0×10⁵个/孔。

(2)实验磁场与激光器

实验磁场(M)：100mT/cm2左右；细胞处理时间12h。

实验激光(L)：632.8nm，100mW，细胞处理时间：2min。

实验分组设计，磁场作用时间与激光照射时间均相同，分别为12h，2min；激光照射实验完成后需进行将细胞置于培养箱中孵育4h。

(3)实验结果处理

1)CCK-8细胞增殖检测

主要实验步骤

a.制备细胞悬液10⁶/ml.

b.接种100μl到96孔板中，接种数量为10000/孔。

c.37℃培养孵育4h，待细胞贴壁；

d.加入10μl的CCK-8，培养箱中孵育4h(加CCK-8前，更换培养基)

e，酶联免疫反应，利用酶标仪测定450nm吸光度。

空白对照：不含细胞的培养基中加CCK-8药物.

2)标准曲线，浓度设定(100/500/1000/5000/10000/10000)

3)样品检测

检测波长：450nm参比波长：620nm(去除样品浑浊所带来的吸收)

终止反应：每孔加10μl 0.1M HCL溶液，放4℃。

样品检测：避光条件下，进行酶标仪检测并进行数据处理。

(4)流式检测

将纤维素膜荷载不同浓度纳米粒子处理的乳腺癌细胞经过胰酶消化后，用PBS缓冲液洗2-3次后，并进行加入1mlPBS重悬，加入PI染色液，30min，进行检测，获得结果并进行处理。

3、实验结果

(1)形态学观察与CCK-8细胞存活率检测

由图6可以看出，通过磁场(100mT,4h)与激光(632.8nm,100mW,2min)处理后，外加乳腺癌靶向磁性纳米粒子(MHNP/HMME/DOX/FA)乳腺癌细胞出现明显的形态上的改变，多数都变成了圆形的细胞，并出现类似凋亡小体状物，以及较多的细胞碎片，经复合纤维素膜作用后的同样能达到乳腺癌靶向磁性纳米粒子同样的效果，且具有较好的靶向效果。

由图7可以看出，通过磁场(100mT,4h)与激光(632.8nm,100mW,2min)处理后，乳腺癌靶向磁性纳米粒子(MHNP/HMME/DOX/FA)对乳腺癌细胞的生长抑制率达80％以上，乳腺癌靶向磁性纳米粒子荷载的复合纤维素膜具有较好的抑制乳腺癌细胞生长的效果，同时，具有很好的抑制乳腺癌细胞生长的效果。

(2)在磁场激光条件下，流式检测细胞凋亡效果

如图8所示，从流式细胞术结果可以看出，磁性纳米粒子(MHNP/HMME/DOX/FA)有机的结合了乳腺癌化疗与光动力治疗，在结合叶酸生物靶向与磁场靶向的双重效果，该纳米粒子具有较好的杀伤乳腺癌细胞的效果；同时将磁性纳米粒子吸附于细菌纤维素膜后，作用于乳腺癌细胞同样具有高效抑制乳腺癌细胞MCF-7生长的效果。