癌的治疗和/或预防用药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及针对CAPRIN-1的抗体或其片段的作为癌的治疗和/或预防剂等的新的 医药用途。
【背景技术】
[0002] 癌是占所有死亡原因的第一位的疾病，现行的治疗是以手术疗法为主、组合放疗 法和化疗法的治疗。尽管近年来开发了新的手术方法、发现了新的抗癌剂，但现状是除了一 部分癌以外，癌的治疗成绩并没有多大提高。近年来，随着分子生物学、癌免疫学的进步，与 癌特异性地反应的抗体类、由细胞毒性T细胞识别的癌抗原类、编码癌抗原的基因类等被鉴 定，对以癌抗原类为靶的特异性的癌治疗法的期待正在提高。
[0003] 细胞质增殖相关蛋白 1 (Cytoplasmic-activation and prol iferation-associateed protein 1，CAPRIN_1)作为已知在分裂间期的正常细胞发生活化和/或细胞 分裂时表达，并在细胞内与RNA形成细胞内应激颗粒而参与mRNA的转运、翻译的控制等的细 胞内蛋白质被知晓，并被发现在癌细胞的表面特异性地表达，作为用于癌治疗的抗体药物 的靶正在被进行研究(专利文献1~19)。
[0004] 现有技术文献
[0005] 专利文献
[0006] 专利文献 1:W02010/016526
[0007] 专利文献 2: W02011/096517
[0008] 专利文献 3: W02011/096528
[0009] 专利文献 4: W02011/096519
[0010] 专利文献 5:W02011/096533
[0011] 专利文献 6: W02011/096534
[0012] 专利文献 7: W02011/096535
[0013] 专利文献 8:W02013/018886
[0014] 专利文献 9:W02013/018894
[0015] 专利文献 10:W02013/018892
[0016] 专利文献 11:W02013/018891
[0017] 专利文献 12:W02013/018889
[0018] 专利文献 13:W02013/018883
[0019] 专利文献 14:W02013/125636
[0020] 专利文献 15:W02013/125654
[0021] 专利文献 16:W02013/125630
[0022] 专利文献 17:W02013/125640
[0023] 专利文献18:W02013/147169
[0024] 专利文献 19:W02013/147176
【发明内容】
[0025]发明要解决的课题
[0026]本发明的目的是制作出以在癌细胞的表面特异性地表达的CAPRIN-1为靶的、与现 有的抗体相比抗肿瘤活性优异的抗体，提供作为癌的治疗和/或预防剂的用途。
[0027]用于解决课题的技术方案 [0028]本发明具有以下特征。
[0029] 在本发明中，提供用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，包含抗体 或其片段作为有效成分，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，且与CAPRIN-1 蛋白质具有免疫反应性，所述重链可变区包含序列号1、2和3的互补决定区，所述轻链可变 区包含序列号4、5和6的互补决定区。
[0030] 在其实施方式中，上述癌是乳癌、肾癌、胰癌、大肠癌、肺癌、脑瘤、胃癌、子宫癌、卵 巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、淋巴瘤、肝癌、胆囊癌、肉瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、 肾上腺皮质癌、尤文氏瘤、霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、睾丸癌、甲状腺癌、或头颈 癌。
[0031] 在其他实施方式中，上述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链型抗体或多 特异性抗体(例如双特异性抗体）。
[0032] 本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2013-166164号的说明书 和/或附图所记载的内容。
[0033]发明的效果
[0034]本发明所涉及的针对CAPRIN-1的抗体毒害癌细胞。因此，本发明所涉及的针对 CAPRIN-1的抗体在癌的治疗和/或预防中是有用的。
【具体实施方式】
[0035]本发明中使用的针对CAPRIN-1的多肽的抗体的抗肿瘤活性如后所述，通过在生物 体外检查对表达该多肽的肿瘤细胞是否显示介由免疫细胞的细胞毒活性来评价，或者在生 物体内检查对荷癌动物的肿瘤增殖抑制来评价。
[0036]本发明所涉及的上述针对CAPRIN-1的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选 为单克隆抗体，只要能够发挥抗肿瘤活性就可以是任何种类的抗体，包含例如，重组抗体 (例如，合成抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体 (scFv)等）、人抗体、它们的抗体片段(例如，Fab、F(ab '）2、Fv)等。这些抗体及其片段还可以 通过本领域技术人员公知的方法制备。另外，在受试者是人的情况下，为了避免或抑制排斥 反应，优选为人抗体或人源化抗体。
[0037] "与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合"，是指与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合，与除 了CAPRIN-1蛋白质以外的蛋白质实质上不结合。
[0038]另外，本发明中作为癌的治疗和/或预防的对象的受试者是人、宠物、家畜类、竞技 用动物等哺乳动物，优选的受试者是人。
[0039]以下，以下关于涉及本发明的抗原的制作、抗体的制作、以及药物组合物进行说 明。
[0040] <抗体制作用抗原的制作>
[0041 ]作为用于获取本发明所涉及的针对CAPRIN-1的抗体的致敏抗原使用的蛋白质或 其片段，可以来源于人、狗、猫、牛、马、小鼠、大鼠、鸡等，对成为其来源的动物种类没有限 制。但是优选考虑与在细胞融合中使用的母细胞的相容性来选择。一般来说，优选来源于哺 乳动物的蛋白质，特别优选来源于人的蛋白质。例如当CAPRIN-1是人CAPRIN-1时，可以使用 人CAPRIN-1蛋白质和/或其部分肽、表达人CAPRIN-1的细胞等。
[0042] 人CAPRIN-1及其同源物的碱基序列和氨基酸序列例如可以通过登录GenBank(美 国1^031)，利用131^\31'、卩厶31厶等算法（1(&1'1;[11&11(1厶1七8(311111，？1'0(3.似1:1.厶0&(1.3(3；[.1]3厶，90: 5873-5877，1993;Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25:3389-3402，1997)来得到。 [0043] 在本发明中，当以人CAPRIN-1的碱基序列（序列号16或18)或氨基酸序列（序列号 17或19)为基准时，包含与它们的0RF或成熟部分的碱基序列或氨基酸序列具有70%~ 100%、优选80 %~100 %、更优选90 %~100 %、进一步优选95 %~100 %、例如97 %~ 100%、98%~100%、99%~100%或99.5%~100%的序列同一性的序列的核酸或蛋白质 成为靶CAPRIN-1(将序列号17与序列号19的氨基酸序列比较，则690位以后的氨基酸残基不 同）。这里，"％序列同一性"是将2个序列在导入间隙或不导入间隙的情况下以形成最大的 类似度(或一致度)的方式比对(对齐)时，相同氨基酸(或碱基)相对于氨基酸(或碱基)的总 数(包含间隙的数)的百分比（％)。
[0044] CAPRIN-1蛋白质的片段具有从作为由抗体所识别的最小单位的表位(抗原决定 簇)的氨基酸长度至小于该蛋白质的全长的长度。表位是指在哺乳动物、优选人中具有抗原 性或免疫原性的多肽片段，其最小单位包含约7~12个氨基酸、例如8~11个氨基酸。
[0045]上述的人CAPRIN-1蛋白质和/或包含其部分肽的多肽片段可以按照例如Fmoc法 (芴基甲基氧基羰基法）、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等化学合成法来合成（日本生化学会 编、生化学实验讲座1、蛋白质的化学(蛋白质的化学）IV、化学修飾i肽合成(化学修饰和肽 合成）、东京化学同人（日本）、1981年）。另外，还可以利用各种市售的肽合成仪通过常规方 法合成。另外，可以使用公知的基因工程学方法(Sambrook等，Molecular Cloning，第2版， Current Protocols in Molecular Biology(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995),John Wiley & Sons 等），制备编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸整合到表达载体中并导入宿主细胞，在 该宿主细胞中生产多肽，从而得到作为目的的人CAPRIN-1蛋白质和/或其多肽片段。
[0046]编码上述多肽的多核苷酸可以通过公知的基因工程学方法和/或使用了市售的核 酸合成仪的常规方法来容易地制备。例如包含人CAPRIN-1基因的碱基序列的DNA可以通过 使用人染色体DNA或cDNA文库作为模板，使用以能扩增该碱基序列的方式设计的一对引物 进行PCR，从而制备。PCR的反应条件可以适当设定，可以列举例如，使用耐热性DNA聚合酶 (例如，Taq聚合酶、Pfu聚合酶等）和含有Mg 2+的PCR缓冲液，将包含在94°C保持30秒(变性）、 在55°C保持30秒~1分钟(退火）、在72°C保持2分钟(延伸）的反应过程作为1个循环，例如， 进行30个循环后，在72°C反应7分钟的条件等，但不限定于此。对于PCR的方法、条件等，例如 记载于Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995),John Wiley & Sons (特别是第15章）中。
[0047]另外，可以基于CAPRIN-1基因碱基序列和CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列信息，制 备合适的探针和/或引物，使用该探针和/或引物来对人等的cDNA文库进行筛选，从而分离 所需的DNA^DNA文库优选由表达CAPRIN-1的蛋白质的细胞、器官或组织来制作。这样的细 胞或组织的例子是来源于精巢、以及白血病、乳癌、淋巴瘤、脑瘤、肺癌、胰癌、大肠癌、肾癌、 胃癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、肉瘤、肥大细胞瘤、肝癌、胆囊癌、黑素瘤、 肾上腺皮质癌、尤文氏瘤、霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、睾丸癌、甲状腺癌或头颈 癌等的癌或肿瘤的细胞或组织。上述探针或引物的制备、c D N A文库的构建、c D N A文库的筛 选、以及目的基因的克隆化等操作对于本领域技术人员而言是已知的，可以按照例如 Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology (1989)、Ausbel等（上述）等所记载的方法来进行。由这样得到的DNA，可以获得编码人 CAPRIN-1蛋白质和/或其部分肽的DNA。
[0048] 作为导入表达载体的上述宿主细胞，只要是可表达上述多肽的细胞，就可以是任 何细胞，作为原核细胞的例子可以列举大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可以列举猴肾脏 细胞C0S1、中国仓鼠卵巢细胞CH0等哺乳动物细胞、人胎儿肾脏细胞株HEK293、小鼠胚胎皮 肤细胞株NIH3T3、芽殖酵母、裂殖酵母等的酵母细胞、蚕细胞、爪蟾卵细胞等，但不限于这 止匕 -、〇
[0049] 当使用原核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有能在原核细胞中复制 的复制起点（Origin)、启动子、核糖体结合部位、多克隆位点、终止子、抗药性基因、营养缺 陷型互补基因等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以例示pUC系、pBluescriptll、 pET表达系统、pGEX表达系统等。如果将编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该 载体转化原核宿主细胞后，培养所得的转化体，则可以在原核宿主细胞中表达由上述DNA编 码的多肽。此时，也可以将该多肽制成与其他蛋白质的融合蛋白质来表达。
[0050] 当使用真核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有启动子、剪接区、多聚 (A)添加部位等的真核细胞用表达载体。作为这样的表达载体，可以例示pKAl、pCDM8、 p SVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 载体、pRS、p cDNA3、pYES2等。与上述同样地，如果 将编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该载体转化真核宿主细胞后，培养所得 的转化体，则可以在真核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。当使用p IND/V5-Hi s、 pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作为表达载体时，可以作为附加了His标签（例如， (His) 6~(His)1Q)、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白质表达上述多 肽。
[0051]表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚 糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。
[0052]为了从宿主细胞中分离纯化目的多肽，可以将公知的分离操作组合来进行。可以 列举例如，利用脲等变性剂和/或表面活性剂的处理、超声波处理、酶消化、盐析和/或溶剂 分别沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换层析、疏水 层析、亲和层析、反相层析等，但不限于此。
[0053]为了制作本发明的抗体，可以将如上制作的抗原如后述那样作为致敏抗原使用。 [0054] <抗体的结构>
[0055]抗体(免疫球蛋白）通常是至少含有2条重链和2条轻链的杂多聚体糖蛋白质。除了 IgM以外，免疫球蛋白是由2条相同的轻(L)链和2条相同的重(H)链构成的约150kDa的杂四 聚体糖蛋白质。典型地，各个轻链通过1个二硫共价键与重链连接，但在各种免疫球蛋白同 种型的重链之间二硫键的数量有变化。各个重链和轻链也具有链内二硫键。各个重链在一 端具有可变区(VH区），几个恒定区与其连接。各个轻链具有可变区(VL区），在其相反端具有 1个恒定区。轻链的恒定区与重链最初的恒定区对齐，且轻链可变区与重链的可变区对齐。 抗体的可变区通过被称为互补性决定区（CDR)的特定区域而表现特定的可变性，从而赋予 抗体以结合特异性。在可变区中相对保守的部分被称为框架区（framework region;FR)。完 整的重链和轻链的可变区包含3个互补决定区由4个框架区连接而成的结构，即从N末起 卩尺1、〇)1?1、？1?2工01?2、？1?、〇)1?和?1?4依次连接而成的结构。3个互补决定区在重链中从其~ 末端依次被称为CDRH1、CDRH2、CDRH3，同样在轻链中被称为CDRL1、CDRL2、CDRL3。在抗体对 抗原的结合特异性中，CDRH3最为重要。另外，各链的CDR通过框架区以接近的状态被保持在 一起，与来自其他链的互补决定区一同有助于抗体的抗原结合部位的形成。恒定区不直接 有助于抗体与抗原结合，但表现各种效应器功能，例如，显示与抗体依赖性细胞性细胞毒活 性(ADCC)的相关、介由对Fc γ受体的结合而产生的吞噬作用（ADCP)、介由新生儿Fc受体 (FcRn)的半衰期/清除速度、介由补体级联的Clq构成要素的补体依赖性细胞毒(CDC)。 [0056] <抗体的制作>
[0057]本发明中的抗CAPRIN-1抗体是指与CAPRIN-1蛋白质的全长或其片段具有免疫反 应性的抗体。
[0058]这里，"免疫反应性"是指在生物体内抗体与CAPRIN-1抗原（CAPRIN-1蛋白质的全 长或其部分多肽）结合的特性。介由本发明的抗体对CAPRIN-1的这样的结合而对肿瘤细胞 发挥毒害（例如，死灭、抑制或衰退）的功能。本发明的抗体与CAPRIN-1蛋白质结合，从而可 以毒害肿瘤，例如，乳癌、肾癌、胰癌、大肠癌(例如，结肠癌）、肺癌、脑瘤、胃癌、子宫癌、卵巢 癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、淋巴瘤、肝癌、胆囊癌、肉瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、肾 上腺皮质癌、尤文氏瘤、霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、睾丸癌、甲状腺癌或头颈癌 等。
[0059] 本发明的抗体优选只要是单克隆抗体就不特别限定，包含合成抗体、多特异性抗 体(例如双特异抗体、三特异抗体等）、、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、抗体片段 (例如，Fab、F(ab'） 2、FV)等。另外，抗体是免疫球蛋白分子的任意类例如IgG、IgE、IgM、IgA、 IgD 和 IgY，或任意亚类例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、gAl、IgA2 等。
[0060] 抗体进而除了糖基化以外，也可以通过去糖基化、乙酰化、甲酰化、酰胺化、磷酸 化、或聚乙二醇(PEG)化等而被修饰。
[0061] 以下显示各种单克隆抗体的制作例。
[0062] 例如将表达CAPRIN-1的乳癌细胞株SK-BR-3等施与小鼠而进行免疫，从该小鼠取 出脾脏，将细胞分离，然后使该细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从所得的融合细胞(杂交瘤）中 选择产生具有癌细胞增殖抑制作用的抗体的克隆。分离产生具有癌细胞增殖抑制作用的单 克隆抗体的杂交瘤，培养该杂交瘤，从培养上清通过一般的亲和纯化法来纯化抗体，从而制 备本发明的抗体。
[0063]产生单克隆抗体的杂交瘤例如，也可以如下地制作。首先，按照公知的方法，用致 敏抗原对动物进行免疫。作为一般的方法，可以通过将致敏抗原向哺乳动物的腹腔内或皮 下注射来进行。具体来说，可以将致敏抗原用PBS(磷酸盐缓冲液，Phosphate-Buffered Saline)和/或生理盐水等稀释成适当量、进行悬浮，在所得的悬浮液中根据需要适量混合 通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂，乳化后，每4~21天对哺乳动物施与，施与数次。另外，致敏 抗原免疫时也可以使用合适的载体。
[0064] 这样将哺乳动物进行免疫，确认在血清中所需的抗体水平升高，然后从哺乳动物 采取免疫细胞，进行细胞融合，作为优选的免疫细胞，特别可以列举脾细胞。
[0065] 作为与上述免疫细胞融合的其他母细胞，使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。作为该骨 髓瘤细胞，优选使用公知的各种细胞株，例如P3U1 (P3-X63Ag8Ul)、P3 (P3x63Ag8.653) (J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.l(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS_1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol .(1976) 6，51卜519)、MPC-11(Margulies.D·Η·et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman， M.et al·，Nature(1978)276，269-270)、F0(deSt.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods (1980)35,1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313-323)、R210(Galfre， G.et al.，恥忉代（1979)277，131-133)、24(^-1、24(^-^以及24(^-^2等。
[0066] 上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以按照公知的方法，例如Kohler 和Milstein的方法（Kohler，G.and Milstein，C.Methods Enzymol · (1981)73,3_46)等来进 行。
[0067] 更具体地，上述细胞融合例如可在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养 液中实施。作为融合促进剂，可以使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而根据需 要为了提高融合效率，还可以添加使用二甲基亚砜等助剂。
[0068] 免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意地设定。作为在上述细胞融合中使用 的培养液，可以使用例如，适合上述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、其 他可以在这种细胞培养中使用的通常的培养液，进一步也可以合并使用胎牛血清(FCS)等 血清补液。
[0069] 在细胞融合中，将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混 合，将预先加温至37°C左右的PEG溶液(例如平均分子量1000~6000左右）以通常30~60% (w/v)的浓度添加、混合，由此形成作为目的的杂交瘤。接着，优选将逐次添加适当的培养 液、离心除去上清的操作反复进行，由此除去对于杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
[0070] 这样得到的杂交瘤可以通过在通常的选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄嘌 呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液）中培养来选择。上述HAT培养液中的培养持续 对于除了作为目的的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死灭充分的时间(通常数天~数周）。 然后，实施通常的有限稀释法，进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。
[0071] 另外，除了对除人以外的动物免疫抗原来得到上述杂交瘤以外，还可以将人淋巴 细胞、例如感染了EB病毒的人淋巴细胞在体外（in vitro)用蛋白质、蛋白质表达细胞或其 溶解物致敏，使致敏淋巴细胞与来源于人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞、例如U266(注 册号TIB196)融合，得到产生具有所希望的活性(例如，细胞增殖抑制活性)的人抗体的杂交 瘤。
[0072] 这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养，另外，可 在液氮中长期保存。
[0073