mAb 2抗-Met抗体的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年8月23日提交的新加坡专利申请号201306428-2和2013年4月30 日提交的新加坡专利申请号201303329-5的优先权的权益，这两个新加坡专利申请的内容 出于所有目的在此以引用方式整体并入。
技术领域
[0003] 本发明属于免疫学领域并且涉及特异性结合c-Met的抗体、其片段和其用途。
【背景技术】
[0004] C-Met是由通过二硫键连接到跨膜β-链的胞外α-链构成的190kD酪氨酸激酶受体。 c-Met是作为170kD单一多肽合成的，其被蛋白水解切割而形成α-链和β-链。成熟的α-链是 45kD并且构成了 sema结构域的一部分。sema结构域是信号素（semaphorin)和神经丛素 (plexin)共有的保守结构域。该结构域呈对于同型二聚化重要的七叶β-螺旋桨（seven-bladed beta-propeller)结构。在c-Met中，α-链和β-链均形成对于受体二聚化和配体结合 必要且充分的sema结构域。
[0005] 肝细胞生长因子(HGF)是唯一已知的C-Met配体。在HGF结合时，C-Met受体在细胞 表面上二聚化，这导致激酶结构域中的酪氨酸残基的自身磷酸化。自身磷酸化被认为诱导 c-Met的构象变化，暴露了c-Met的羧基末端尾中的对接位点（docking site)。这导致c-Met 对接位点中的酪氨酸残基的转磷酸化。对接位点可用于募集接头分子和信号传导分子，导 致各种信号传导途径(包括AKT/P13K、RAS/MAPK和STAT途径)的激活。
[0006] c-Met信号传导途径的异常C-Met激活与各种人癌症中的过度增殖、肿瘤细胞侵 袭、肿瘤血管生成和不良预后相关联。另外，c-Met信号传导通过抑制凋亡并诱导对癌症疗 法的抗性、由此阻碍肿瘤治疗的作用来保护肿瘤细胞。c-Met作为癌症预后标志物和其参与 癌症转移和药物抗性使c-Met成为非常有吸引力的药物靶标。
[0007] 各种机制已被用于抑制c -Me t激活。小分子激酶抑制剂如PHA-6 6 5 7 5 2、AM7和 SU11274在抑制c-Met激活方面是极为成功的。然而，由于小分子抑制剂的脱靶效应(off-target effect) 所致的毒性组织是主要担忧。另外， SU11274 被报道针对特定的 c-Met 突变 是无效的。
[0008] UlsnRNA/核酶的使用也被报道下调C-Met/HGF的表达水平。然而，该方法由于药物 递送问题而对于癌症治疗是不可行的。为了有效，UlsnRNA/核酶必须被有效地递送到待表 达的每个肿瘤细胞中。
[0009] 已对使用HGF片段和C-Met片段(分别如NK4和诱饵(decoy)-Met)来竞争Met-HGF相 互作用进行检查。这些竞争性抑制剂显示了体内异常移植模型中对c-Met激活的有效抑制； 然而，它们的临床效用仍有待确定。
[0010] 许多抗体如赫赛汀(Herceptin)(临床上被称为曲妥珠单抗(Trastuzamab))已在 临床上获得成功。赫赛汀是用于乳腺癌治疗的靶向酪氨酸受体激酶HER2的嵌合抗体。
[0011] 随着治疗性抗体的成功，已尝试开发针对Met-HGF轴的治疗性抗体。开发了旨在 封阻Me t-HGF相互作用的靶向HGF的中和抗体。只有当使用两种或三种不同的抗-HGF抗体的 组合时，c-Met与HGF的结合才被封阻。已开发出靶向HGF的β-链的五种完全人抗-HGF抗体。 这些抗体在封阻U-87MG胶质母细胞瘤细胞中的Met-HGF相互作用方面是成功的。
[0012] 开发靶向C-Met的治疗性二价抗体已经是具有挑战性的。先前已开发出针对C-Met 的胞外结构域的两种单克隆抗体(D0-24和DN-30)。有趣的是，两种单克隆抗体充当激动剂 而非拮抗剂并且在体内激活c-Met信号传导。为了避免二价单克隆抗体对c-Met的激活，对 DN-30Fab片段进行工程化。DN-30Fab保持了其对c-Met的高结合亲和力，但丧失了其对c-Met的激动剂活性。DN_30Fab通过引起c-Met胞外结结构域脱落和受体下调而有效地抑制c-Met信号传导。
[0013] 单臂5D5抗体(MetMab或临床上被称为奥纳珠单抗(Onartuzumab))是革E向c-Met的 单价嵌合抗体。与DN-30类似，当被转化为单价Fab时，二价5D5抗体变成拮抗剂。与Fab DN-30不同，Me tMab通过与HGF竞争c-Met结合而充当诘抗剂并且引起c-Met内化和下调。
[0014]因此，需要提供克服或至少改善一个或多个上述缺点的结合c-Met的新诘抗性抗 体。
【发明内容】
[0015]下面描述了针对人c-Met的α-链的抗体。开发针对抗人C-Met的α-链而产生的一组 二价抗-Met鼠科动物单克隆抗体。通过蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫沉淀、流式 细胞术、表位定位和对c-Met的激动剂/诘抗剂活性来表征这些抗体。令人惊讶地，这些抗体 都不是c-Met激动剂。两种抗体mAb 2和mAb 13通过流式细胞术显示与天然c-Met的最强结 合，但在检测蛋白质印迹上的变性c-Met方面效果差。mAb 2在降低细胞增殖方面是最有效 的。通过流式细胞对mAb 2的进一步分析显示其与活细胞上的c-Met的结合是温度敏感性 的。mAb 2表位的详细定位揭示部分mAb 2表位被包埋在c-Met内。
[0016]因此，在第一方面，提供特异性结合包含在c-Met的α-链中的表位的抗体。
[0017] 在第二方面，提供编码如本文所述的抗体的核酸，其中所述抗体的重链包含如SEQ ID NO: 1中所示的序列或由如SEQ ID NO: 1中所示的序列组成。
[0018] 在第三方面，提供包含如本文所述的抗体或由如本文所述的抗体组成的药物组合 物。
[0019] 在第四方面，提供治疗和/或预防癌症的方法，其包括施用治疗有效量的如本文所 述的抗体。
[0020] 在第五方面，提供诊断癌症的方法，其包括通过施用用于检测c-Met的如本文所述 的抗体来检测c-Met的异常表达。
[0021] 在第六方面，提供本文所公开的抗体在制造用于治疗和/或预防癌症的药剂中的 用途。
[0022] 在第七方面，提供本文所公开的抗体用于检测具有异常c-Met表达的细胞的用途。
[0023] 在第八方面，提供本文所公开的抗体作为癌症预后标志物的用途。
【附图说明】
【附图说明】 [0024] 了所公开的实施方案并且用于解释所公开的实施方案的原理。然而，应 当理解，附图被设计为只用于说明的目的，而不是作为本发明范围的定义。
[0025] 图1是图解说明抗-α-链c-Met单克隆抗体表位定位的定位的草图。A)抗体结合区 域的图解。利用肽扫描(一种基于ELISA的测定)来确定21种单克隆上清液的结合区域。合成 跨越整个c-Meta-链的连续重叠肽并且将其涂覆于96孔中。为了确定α-链上的抗体结合区 域，向每条肽中添加单克隆细胞上清液。抗体结合导致比色反应，通过450ηΜ下的吸光度读 数对其进行分析。将所述抗体的表位分类成各个区域。共有同一结合区域的抗体被指示。图 并非按比例绘制。Β和C) c -Me t的晶体结构的抗体结合区域的定位。结合HGF0-链的c -Me t胞 外结构域(氨基酸残基25-567)的晶体结构。从蛋白质数据库(PDB)以保藏号1SHY获得晶体 结构。以绿色突出显示c-Met并且以蓝色突出显示HGF。从两个不同的角度(B)和(C)显示蛋 白质复合物以允许相对于配体-受体相互作用位点观察不同抗体结合区域。(D)是图解说明 单克隆抗体筛选的概况的示意图。筛选768个细胞系在杂交瘤融合后的抗-α-链抗体产生。 在初级筛选中发现57个细胞系表达抗-α-链c-Met抗体。将这些细胞系扩增并且在次级筛选 中再次测试其抗-α_链抗体产生。观察到39个细胞系稳定地表达抗-α-链抗体。21个细胞系 被选择用于单细胞克隆。然后在蛋白质印迹上对这些抗体的结合区域、同种型亚类和功能 性进行表征。基于这些测定，选择11个克隆用于腹水产生。从腹水纯化单克隆抗体并且进行 进一步表征。
[0026] 图2呈现了使用纯化的抗-α-链c-Met单克隆抗体的蛋白质印迹的摄影图像。选择 11个杂交瘤克隆(mAb2、mAb4、mAb8和mAbll-18)用于腹水产生。从腹水纯化单克隆抗体并且 再次测试其对全细胞溶解产物中的全长c-Met的反应性。从未转染的NIH3T3细胞(UT)、用全 长人〇-16丨(16〇转染的祖!13了3细胞、1]-871?；细胞系和了470细胞系获得5(^8全细胞溶解产 物。U-87MG细胞和T47D细胞分别表达高水平的c-Met和不可检测水平的c-Met。单克隆抗体 以lyg/mL的浓度使用。10ng纯化的α-链被用作阳性对照。AF276抗体被用作对照。蓝色箭头 指示c-Met前体(170kD)。红色箭头指示纯化的α-链。分子量以千道尔顿被标注在旁边。 [00 27]图3描绘了蛋白质印迹的图像，其显示抗-α-链c-Met单克隆抗体使内源性c-Met免 疫沉淀。从腹水产生单克隆抗体并且使用蛋白质A珠粒将其纯化。测试纯化抗体使来自SNU-5细胞溶解产物的内源性c-Met免疫沉淀的能力。lyg/mL抗体被用于免疫沉淀。商业抗-Met 抗体SC-10和AF276以及小鼠 IgG被用作对照。通过蛋白质印迹法使用A)SC-10抗体和AF276 抗体以及B)从该筛选产生的缀合HRP的单克隆抗体来分析免疫沉淀的SNU-5细胞溶解产物。 mAb 8、mAb 12和18先前被显示识别不同表位并且在蛋白质印迹上运行良好。分子量以千道 尔顿被标注在旁边。
[0028]图4显示来自用抗-α-链c-Met单克隆抗体处理的SNU-5细胞的流式细胞术分析的 代表性信号。将纯化的单克隆抗体(lyg/mL)与活的SNU-5细胞一起培育。在细胞通过流式细 胞器之前，使用缀合FITC的二级抗体检测结合的抗体。FITC强度的变化指示单克隆抗体与 SNU-5细胞的结合。
[0029]图5呈现了 HaCaT细胞的图像，其证实纯化的抗-α-链c-Met单克隆抗体对细胞离 散(cell scatter)的作用。在处理前将HaCaT细胞血清饥饿24hr。固定前与单克隆抗体（1μ g/mL)和HGF培育24hr。然后用结晶紫将细胞染色用于可视化。抗-HGF抗体(抗-HGF)、商业上 获得的小鼠免疫球蛋白G(IgG)和c-Met小分子抑制剂SU11274被用作对照。UT:未处理的。
[0030]图6是显示纯化的抗-α-链C-Met单克隆抗体对SNU-5细胞活力和半胱天冬酶激活 的作用的一对条形图。在含血清的培养基存在下向SNU-5细胞中添加10yg/mL单克隆抗体。 在测试(A)细胞活力和(B)半胱天冬酶激活前将细胞培育721ι Γ(^υ?1274(5μΜ)被用作对照。 [0031 ]图7是证实mAb 2和mAb 13对细胞生长的作用的一系列测定。在含血清的培养基存 在下将lOPg/mL单克隆抗体与SNU-5细胞一起培育。A)是显示SNU-5细胞的细胞生长的条形 图。单克隆抗体处理后72hr，收获细胞并且使用自动化的ADAM细胞计数器(Digital Bio)进 行计数。第〇天:被接种用于测定的细胞的数量。B和C)在与单克隆抗体一起培育6天前用5μΜ CellTracker Green B0DIPY染料将SNU-5细胞染色。隔天向细胞中添加含有10yg/mL单克隆 抗体的新鲜培养基。收获细胞并且通过流式细胞术分析CelITracker Green B0DIPY荧光保 留。B)用相应的单克隆抗体处理的荧光细胞的直方图示。C)通过流式细胞术记录单克隆抗 体处理的细胞的CellTracker Green B0DIPY荧光强度。一式两份进行实验。获得平均几何 平均荧光并且将其标绘出来。
[0032]图8呈现了显示mAb 2和mAb 13在SNU-5细胞中的胞内免疫荧光染色的摄影图像。 在所示温度下将活的SNU-5细胞与10yg/mL单克隆抗体一起培育1小时。收获细胞并且将其 旋涂到显微镜载玻片上。将细胞在4%PFA (多聚甲醛)/PBS(磷酸盐缓冲盐水）中固定并且 进行渗透化处理。使用抗小鼠的缀合Alexa F丨u〇r?488的二级抗体检测mAb 2和mAb 13。 使用分别将F-肌动蛋白和细胞核染色的鬼笔环肽和DAPI作为复染剂。
[0033]图9是代表在不同温度下抗-α-链c-Met单克隆抗体与活的SNU-5细胞的结合的流 式细胞术分析的一系列直方图。在4°C或37°C下用相应的单克隆抗体将活的SNU-5细胞处理 1 hr。收获细胞。通过缀合Alexa Fluor?488的抗小鼠二级抗体确定抗-α-链c-Me t单克隆 抗体结合并且通过流式细胞术分析细胞。
[0034]图10是来自与HGF复合的c-Met的计算机模拟的代表性瞬态图对，其显示了对mAb 2表位关键的残基的鉴别。mAb 2表位的丙氨酸扫描鉴别出对mAb 2-Met相互作用重要的若 干非连续残基。c-Met晶体结构(PDB保藏号为1SHY)上的关键残基的定位将所述残基分组为 两个簇，即位于c-Met表面上的残基（以粉红色表示）和包埋在c-Met中的残基（以青色表 示）。以绿色突出显示c-Met并且以蓝色突出显示HGF。再次，从两个不同的角度(A)和(B)显 示了蛋白质复合物。
[0035] 图11A)和B)显示用于确定c-Meta-链上的mAb 2表位区域的肽扫描(基于ELISA的 测定）。合成跨越整个人c-Meta-链的连续重叠肽并且将其涂覆于96孔中。为了确定mAb 2在 α-链上的结合区域，向每条肽中添加 mAb 2。11^匕2结合导致比色反应，通过450nM下的吸光 度读数对其进行分析。A)mAb 2以类似的亲和力结合肽028和肽029。陈述了肽01、肽027、肽 028和肽029的序列和结合亲和力。B)mAb 2肽扫描分析图片。mAb 2结合肽028和肽029,这导 致比色反应。
[0036]图11C)显示呈现蛋白质印迹的图像，其显示使用mAb 2对人c-Met的分析。从小鼠 腹水纯化mAb 2并且测试其对全细胞溶解产物中的全长c-Met的反应性。从未转染的NIH3T3 小鼠细胞(UT)、用全长人C-Met(Met)转染的NIH3T3小鼠细胞、U-87MG人胶质母细胞瘤细胞 和T47D人乳腺癌细胞获得50yg全细胞溶解产物。mAb 2以lyg/mL的浓度使用。10ng纯化的a-链被用作阳性对照。蓝色箭头指示c-Met前体（170kD)。红色箭头指示纯化的α-链。分子量以 千道尔顿被标注在旁边。
[0037]图1 ID)是显示通过抗-Met抗体对SNU-5人胃细胞的流式细胞术分析的直方图。 SNU-5细胞表达高水平的c-Met。将lyg/mL抗-Met抗体与活的SNU-5细胞一起培育。在使细胞 通过流式细胞器之前，使用缀合FITC的二级抗体检测结合的抗-Met抗体。仅二级抗体被用 作对照。FITC强度的右移指示单克隆抗体与SNU-5细胞的结合。mAb 2和mAb 13强烈地结合 活的SNU-5。
[0038]图11E)是显示mAb 2和mAb 13对细胞生长的作用的条形图。在含血清的培养基存 在下将lOyg/mLmAb与SNU-5细胞一起培育。mAb处理后72hr，收获细胞并且使用自动化的 ADAM细胞计数器(Digital Bio)进行计数。第0天:被接种用于测定的细胞的数量。
[0039] 图12是代表用于鉴别mAb 2主要表位的实验的计算机模拟的表、点图和瞬态图。A) 丙氨酸扫描分析用于确定参与mAb 2表位的主要残基。肽1-31是肽028和肽029的衍生物，其 中每个氨基酸残基依序被丙氨酸置换。肽序列列于表1中。使用相同的基于ELISA的测定作 为肽扫描，在ImM DTT存在下向所述肽中添加0.05yg/mL纯化的mAb 2。通过450nM下的吸光 度读数来确定mAb 2结合。以绿色突出显示的mAb 2结合的缺乏将指示被置换的残基参与 了mAb 2-Met相互作用。肽01、肽027以及无肽被用作对照。B)抗针对肽的纯化的mAb 2的滴 定。用增加浓度的纯化的mAb 2滴定丧失mAb 2结合的丙氨酸置换的肽。这些肽以增加的mAb 2结合的顺序被列出。C)c-Met晶体结构(PBD 1SHY)上的mAb 2主要表位（'IEE'和'CH)C'）的