专利名称：抗masp－2抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗MASP-2抗体和其功能等同物。特别地，本发明涉及能抑制MASP-2的功能的MASP-2抗体。此外，本发明涉及生产所述抗体的方法、抑制MASP-2活性的方法以及包含MASP-2抗体的药物组合物。
背景技术：
补体系统包含对先天的以及适应性免疫防御功能有重大意义的酶和非酶蛋白质的复杂系列。直到最近才知道两种活化模式，经典途径由抗体-抗原复合物起始，替代途径由在微生物表面上的某些结构起始。已经描述了补体激活的第三种、新的不依赖抗体的途径。当甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin)(MBL，最初被描述为甘露聚糖结合蛋白3，MBP，参见Ezekowitz，美国专利5,270,199)与碳水化合物结合时起始这个途径，被称为MBLectin途径。
MBL与补体的组分Cl的Clq亚组分在结构上相关，看来是MBL通过相关联的称为MASP或p1000的丝氨酸蛋白酶激活补体系统，MASP类似于经典途径的Clr和Cls组分。这个新的补体激活途径被称为MBLectin途径。根据为这个途径假定的机制，MBL与在许多微生物包括细菌、酵母、寄生原生动物和病毒表面发现的特殊碳水化合物结构结合，其抗微生物活性来自对末端的、溶胞补体途径组分的活化，或来自促进吞噬作用。
MASP(MBL-相关丝氨酸蛋白酶)是在结构上与补体途径的Clr和Cls相似的丝氨酸蛋白酶。MASP-1具有在胰蛋白酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶中发现的一类组氨酸环状结构。已经发现MASP-1参与了MBL的补体激活。已经报道了编码MASP-1的cDNA克隆，其编码一推定的19氨基酸的前导肽、随后是预计形成成熟肽的680个氨基酸残基。
MASP-2(MBL-相关丝氨酸蛋白酶2)是在结构上也与补体途径的Clr和Cls类似的丝氨酸蛋白酶。类似于这些，但与MASP-1相反，它没有在胰蛋白酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶中发现的一类组氨酸环状结构。已经发现MASP-2参与了MBL的补体激活。
在先有技术中已经描述了抗MASP-2的抗体。
WO02/06460描述了人MASP-2。该文件还进一步描述了通过用人MASP-2的N-末端19个氨基酸免疫兔，或用人MASP-2的氨基酸505到523和氨基酸538到556免疫鸡来得到的抗MASP-2抗体。
发明概述有意思的是，本发明的发明人已经认识到，抑制MBLectin途径在治疗许多临床状况方面是可取的。然而，MBLectin途径的特定抑制物在先有技术中没有被很好的表征，因此存在着对特定抑制物的未被满足的需求。
本发明公开的是，针对MASP-2的C末端部分的抗体比针对MASP-2N-末端部分的抗体能更有效地抑制MASP-2的活性。本发明还公开了MASP-2表位，其中识别所述表位的抗体对于抑制MASP-2的活性是特别有用的。在以下描述了优选的表位。
一方面本发明涉及特异性地识别以及结合表位的至少一部分的抗体或其功能等同物，所述表位被选自下述的一个或多个参照抗体识别i.按保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；ii.命名为M0545YM029的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；iii.命名为M0545YM035的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；iv.命名为M0545YM046的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；或v.命名为M0545YM048的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
因此，本发明的一个目的是提供特异性识别和结合在MASP-2的C-末端部分中的表位或其功能同源物的抗体或其功能等同物。
本发明的进一步的目的是提供包含MASP-2的C-末端片段的分离的多肽，所述多肽对于获得针对在MASP-2的C-末端中的表位的抗体是有用的。特别地，来自MASP-2的C-末端部分的分离的多肽或其功能同源物是包含下述或由下述组成的多肽i.EGF、CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域；或ii.CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域；或iii.CCP1结构域；或iv.CCP2结构域；或
CCP1和CCP2结构域。
本发明的进一步的目的是提供通过用包含MASP-2的C-末端片段的分离的多肽免疫动物，优选的免疫哺乳动物来生产抑制MASP-2活性的抗体的方法，所述多肽对于获得针对在MASP-2的C-末端中的表位的抗体是有用的。特别地，来自MASP-2的C-末端部分的分离的多肽或其功能同源物是包含下述或由下述组成的多肽v.EGF、CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域；或vi.CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域；或vii.CCP1结构域和丝氨酸蛋白酶结构域；或viii.CCP2结构域和丝氨酸蛋白酶结构域；或ix.CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域x.丝氨酸蛋白酶结构域本发明的进一步的目的是提供生产特异性识别和结合在MASP-2的C-末端部分中的表位的抗体或其功能同源物的方法，包括向哺乳动物施用MASP-2的C末端部分或其片段或其功能同源物的步骤。本发明还公开了根据该方法生产的抗体。
本发明的更进一步的目的是提供抑制MASP-2的活性的方法，包括步骤1)提供包含MASP-2的组合物；2)提供根据本发明的MASP-2抗体；3)将所述组合物与所述抗体一同孵化，从而抑制MASP-2活性。
对MASP-2的抑制将导致对补体活化的抑制，优选的导致对MBLectin途径的抑制。因此，抑制MASP-2的活性的抗体可被用于抑制MBLectin途径的活化，从而所述抗体对于治疗以不适当的补体活化、特别是不适当的MBLectin途径活化为特征的临床状况是有用的。
由此，本发明还涉及抑制MBLectin途径的方法，优选的所述方法包括使用能抑制MASP-2的活性的抗MASP-2抗体。
本发明的更进一步的目的是提供药物组合物，所述药物组合物包含识别MASP-2的C-末端部分中的表位的MASP-2抗体或其功能等同物，以及药学上可接受的赋形剂。
本发明的又一个目的是提供用于治疗临床状况的药物，所述药物包含识别MASP-2的C-末端部分中的表位的抗体或其功能等同物作为活性成分。
本发明的又一个目的是提供治疗临床状况的方法，包括向需要治疗的个体施用治疗有效剂量的、识别MASP-2的C-末端中的表位的抗体或其功能等同物。
本发明的进一步的目的是提供识别MASP-2的C-末端部分中的表位的抗体或其功能等同物的用途，用于制备治疗需治疗个体的临床状况的药物。
附图1描绘了指明单个结构域的MASP-2示意图。
附图2显示了人MASP-1、MASP-2、Clr和Cls序列的比对，指明存在的单个结构域是MASP-2。在这四个蛋白质中保守的氨基酸进一步用星号表明。
附图3描绘了MASP-2抗体在完全血清中对C4沉积作用(deposition)的抑制。
附图4描绘了不同浓度的MASP-2抗体对C4沉积作用的抑制。
附图5显示了C4沉积作用分析。该图说明了用各种纯化的抗MASP-2抗体在人血清中抑制C4沉积作用。
附图6显示了利用4种不同抗体在人血清中针对MASP-2的Western印迹的组合。将人血清上样在每个泳道上。该图是从四个独立的Western印迹组合而成的，利用上述泳道中显示的抗体进行检测。
附图7显示了测定重叠表位的竞争性ELSA的结果。
附图8说明了NimoAb101抗体(DWE16140-6cons)的轻链可变区的序列。
附图9说明了NimoAb101抗体(DWE16140-3consRev)的重链可变区的序列。
附图10显示了在NimoAb101抗体(DWE16140-，2，3，4，5，8)的重链序列，以及通过BLAST搜索鉴定的同源序列之间的比对。
附图11显示了在NimoAb101抗体(DWE16140-6，7，9，10)的轻链序列，以及通过BLAST搜索鉴定的同源序列之间的比对。
序列表
SEQ ID 1人MASP-2SEQ ID 2包括可变区的NimoAb101重链的一部分SEQ ID 3包括可变区的NimoAb101轻链的一部分SEQ ID 4包括可变区的NimoAb101重链的一部分SEQ ID 5包括可变区的NimoAb101轻链的一部分SEQ ID 6NimoAb101的重链的CDR1(也称为H1)SEQ ID 7NimoAb101的重链的CDR2(也称为H2)SEQ ID 8NimoAb101的重链的CDR3(也称为H3)SEQ ID 9NimoAb101的轻链的CDR1(也称为L1)SEQ ID 10NimoAb101的轻链的CDR2(也称为L2)SEQ ID 11NimoAb101的轻链的CDR3(也称为L3)SEQ ID 12PCR引物SEQ ID 13PCR引物定义术语“MASP-2的C-末端部分”是指包含EGF、CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域的MASP-2的C-末端，其中所述MASP-2的C-末端部分不包括CUB 1结构域。
术语“表位”是指在化合物上的特定位点，即，某一抗体特异性结合的蛋白质。表位可以是线性的，即，肽或表位可以是三维的结构。
发明的详细说明抗体本发明的一个方面是提供特异性识别或结合MASP-2的C末端部分中的表位或其功能同源物的抗体或其功能等同物，所述表位可以是在以下提及的任何表位。
抗体或其功能等同物可以是本领域已知的任何抗体，例如衍生自哺乳动物或合成抗体的多克隆或单克隆抗体，例如单链抗体或包含抗体片段的杂交体。此外，抗体可以是单克隆抗体或人工多克隆抗体的混合物。另外抗体的功能等同物可以是抗体片段，特别是表位结合片段。此外，抗体或其功能等同物可以是模拟抗体的小分子模拟物(mimic)。自然发生的抗体是由重链和轻链组成的免疫球蛋白分子。在本发明的优选实施方式中，抗体是单克隆抗体。
单克隆抗体(Mab′s)是一种抗体，其中每个抗体分子是类似的，从而识别相同的表位。单克隆抗体一般通过杂交瘤细胞系来生产。制造单克隆抗体和合成抗体的杂交瘤细胞的方法对于本领域技术人员是熟知的。例如，生产抗体的杂交瘤可以通过使生产抗体的B淋巴细胞与永生的B淋巴细胞系融合来制备。例如，根据本发明的单克隆抗体可以按照AntibodiesALaboratory Manual，By EdHarlow and David Lane，Cold Spring HarborLaboratory Press，1988中描述的来制备。所述单克隆抗体可以衍生自任何适当的哺乳动物物种，然而单克隆抗体往往是啮齿动物抗体，例如鼠科或大鼠单克隆抗体。优选的，根据本发明的抗体是单克隆抗体或衍生自单克隆抗体。
多克隆抗体是识别特殊的给定抗原的抗体分子的混合物，因此多克隆抗体能识别所述抗原中的不同表位。通常从预先用抗原免疫了的哺乳动物的血清中纯化多克隆抗体。可以按照AntibodiesA Laboratory Manual，ByEdHarlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中描述的任何方法来制备多克隆抗体。多克隆抗体可衍生自任何适合的哺乳动物物种，例如来自小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、绵羊、奶牛或骆驼。抗体优选的不源自非哺乳动物物种，即，例如抗体优选的不是鸡抗体。例如抗体也可以是人工多克隆抗体，例如在US 5,789,208或US 6,335,163中描述的，通过将它们整体引用把这两个专利的说明书合并到本申请中。
在本发明的一个实施方式中，抗体是人抗体，例如人单克隆抗体。可以通过例如蛋白质工程、从合成文库中选择、或免疫带有人抗体基因的转基因小鼠，将人抗体制成人目标分子。做为选择，抗体可以是人源化抗体。人源化抗体一般是包含来自人抗体的区域和来自非人抗体例如啮齿动物抗体的区域的嵌合抗体。人源化(也称改形或CDR嫁接)是充分确立了的技术，用于减少异种来源的(一般是啮齿动物)单克隆抗体(mAbs)的免疫原性和改善他们对嫁接啮齿类CDR的人免疫系统构架的活化作用。在此使用术语“人源化抗体分子”(HAM)来描述具有来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，而该分子的其余的免疫球蛋白来源的部分中的一些或全部来自人免疫球蛋白。抗原结合位点可包含融合到一个或多个人恒定区的来自非人免疫球蛋白的完整可变区；或嫁接到适当的人类可变区中的构架区上的一个或多个互补决定区(CDR)。人源化MAbs的一种方法涉及生产嵌合抗体，其中将包含一种抗体的完整可变区的抗原结合位点融合到来自第二抗体，优选的人抗体的恒定区。例如，在EP-A-0120694(Celltech Limited)、EP-A-0125023(GenentechInc.)、EP-A-0171496(Res.Dev.Corp.Japan)、EP-A-0173494(Stanford University)和EP-A-0194276(CelltechLimited)中描述了进行这种嵌合化操作的方法。抗体人源化的更复杂的形式涉及重新设计可变区结构域，从而使组成非人抗体结合位点的氨基酸被整合到人抗体可变区的框架中(Jones等，1986)。
根据本发明的抗体也可以是重组抗体。重组抗体是利用重组技术生产的抗体或其片段或其功能等同物。例如，重组抗体可以利用合成文库或通过噬菌体展示来生产。重组抗体可以根据任何的常规方法来生产，例如在″Recombinant antibodies″，Frank Breitling，Stefan Dbel，Jossey Bass，September 1999中概述的方法。
根据本发明的抗体也可以是双特异性抗体，即，特异性识别两种不同表位的抗体。双特异性抗体通常可以从单克隆抗体或从重组抗体开始制备，例如通过化学交联或利用重组技术融合两个杂交瘤的抗体来组合他们的特异性。根据本发明的抗体也可以是三特异性抗体。
在一个优选的实施方式中抗体的功能等同物可以是抗体的片段，优选的是抗原结合片段或可变区。对本发明有用的抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。对抗体进行木瓜胃蛋白酶消化产生两个同一的抗原结合片段，称为Fab片段，每个片段具有单个抗原结合位点，还产生余下的“Fc”片段，因其易于结晶的能力而这样称呼。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，其具有两个能交联抗原的抗原结合片段，并产生余下的其他片段(称为pFc′)。其他的片段可包括双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。在此关于抗体使用的“功能片段”是指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。
优选的抗体片段保持了某些或实质上完全的选择性结合其抗原或受体的抗体的能力。一些优选的片段定义如下(1)Fab是包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab片段可以通过用木瓜胃蛋白酶消化整个抗体以产生完整的轻链和一条重链的一部分而产生。
(2)Fab′是抗体分子的片段，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，随后还原，以产生完整的轻链和重链的一部分而获得。每个抗体分子可获得两个Fab′片段。Fab′片段不同于Fab片段在于在重链CH 1结构域的羧基末端具有额外的几个残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。
(3)(Fab′)2是可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行随后的还原来获得的抗体片段。F(ab′)2是通过两个二硫键结合在一起的两个Fab′片段的二聚体。
(4)Fv是包含完整抗原识别和结合位点的最小的抗体片段。这个区域由一个重链可变区和一个轻链可变区的紧密的、非共价连合的二聚体组成。在这种配置中，每个可变区的三个CDR互相作用以在该VH-VL二聚体的表面确定抗原结合位点。这六个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或仅包含三个特异于抗原的CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管与完整结合位点相比亲合性较低。
在本发明的一个实施方式中，抗体是单链抗体(“SCA”)，作为一种遗传学上融合的单链分子，被定义为包含通过适合的多肽接头连接的轻链可变区、重链可变区的遗传工程化的分子。这种单链抗体也被称为“单链Fv”或“scFv”抗体片段。一般的，Fv多肽进一步包含位于VH和VL结构域之间、允许scFv形成用于抗原结合的期望结构的多肽接头。
也可以凭有用的性质来选择抗体，例如控制抗体的血清半衰期是可取的。通常，完整抗体分子具有很长的血清余辉时间(persistence)，而片段(＜60-80kDa)非常快速地经肾过滤。完整抗体的糖基化通常延长血清余辉时间。由此，如果希望MASP-2抗体的长期作用，MASP-2抗体优选的是完整抗体，而如果希望MASP-2抗体的较短的作用，抗体片段是优选的。
在本发明的另一个实施方式中，抗体的功能等同物是模拟抗体的小分子模拟物。
本发明范围内的优选抗体是能抑制MASP-2的功能的抗体或其功能等同物。MASP-2的活性可以是MASP-2的丝氨酸蛋白酶活性，例如对C4和/或C2的丝氨酸蛋白酶活性。特别地，优选抗体或其功能等同物能抑制MASP-2的丝氨酸蛋白酶活性。更优选的，是能抑制MBL-MASP-2复合物的C4沉积作用(deposition)的抗体或其功能等同物。根据本发明进一步优选的抗体是能在全血清中抑制C4沉积作用的抗体或其功能等同物。进一步优选的抗体或其功能等同物能够在来自具有C4解沉积(disposition)活性的个体的全血清中抑制C4沉积作用。用于确定C4沉积作用的有用的化验在以下描述。
另外，优选的抗体是能抑制MBL-MASP-2复合物的C2沉积作用的抗体或其功能等同物。根据本发明进一步优选的抗体是能在全血清中抑制C2沉积作用的抗体或其功能等同物。进一步优选的抗体或其功能等同物能够在来自具有C2解沉积(disposition)活性的个体的全血清中抑制C2沉积作用。用于确定C2沉积作用的有用的化验在以下描述。
由此，优选的抗体或其功能等同物能够在全血清中抑制C4和/或C2沉积作用，达到少于50％，如少于40％，例如少于30％，如少于25％，例如少于20％，如少于15％，例如少于10％，如少于5％的对照C4沉积作用。优选的，该抗体能够在全血清中抑制C4沉积作用达到少于30％，优选的少于25％，更优选的少于20％，甚至更优选的少于15％，更优选的少于10％。做为选择或另外，优选的抗体能够在全血清中抑制C2沉积作用达到少于30％，优选的少于25％，更优选的少于20％，甚至更优选的少于15％，更优选的少于10％。
在本发明的一个非常优选的实施方式中，抗体选自以登记号03050904保藏的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体组。此外，功能等同物可以是所述抗体的片段，优选的是所述抗体的结合片段。
在本发明的一个实施方式中，抗体或其功能等同物包含特定的高变区，称为CDR。优选的，该CDR是依照Kabat CDR定义的CDR。例如可以通过与其他抗体进行序列对比来鉴定CDR或高变区。优选的，抗体或其功能等同物包含至少一个，更优选的至少两个，更优选的全部三个下列重链CDR1.附图10中所示的DWE 16140-4con的H1(SEQ ID 6)；2.附图10中所示的DWE 16140-4con的H2(SEQ ID 7)；3.附图10中所示的DWE 16140-4con的H3(SEQ ID 8)；更优选的，该抗体或其功能等同物包含重链，所述重链包含或由一序列组成，所述序列与SEQ ID 4有至少95％，更优选的至少98％，更优选的至少99％的同源性或同一性。更加优选的，抗体或其功能等同物包含重链，所述重链包含或由SEQ ID 4中列出的序列组成。
更优选的，该抗体或其功能等同物包含重链，所述重链包含或由一序列组成，所述序列与SEQ ID 2有至少95％，更优选的至少98％，更优选的至少99％的同源性或同一性。更优选的，该重链由附图10的DWE16140-4序列组成。
MASP-2的功能同源物的同源性百分比可以如在此描述的来确定。最优选的，抗体或其功能等同物包含重链，所述重链包含或由SEQ ID 2中列出的序列组成。优选的，所述抗体或其功能等同物能够特异性地识别一表位，所述表位被称为NimoAb101的抗体所识别。
在本发明的另一个实施方式中，抗体或其功能等同物包含特定的高变区，称为CDR。优选的，该CDR是依照Kabat CDR定义的CDR。优选的，抗体或其功能等同物包含至少一个，更优选的至少两个，更优选的全部三个下列轻链CDR4.附图11中所示的DWE16140-10con的L1(SEQ ID 9)；5.附图11中所示的DWE16140-10con的L2(SEQ ID 10)；6.附图11中所示的DWE16140-10con的L3(SEQ ID 11)；更优选的，该抗体或其功能等同物包含轻链，所述轻链包含或由一序列组成，所述序列与SEQ ID 5有至少95％，更优选的至少98％，更优选的至少99％的同源性或同一性。更加优选的，抗体或其功能等同物包含轻链，所述轻链包含或由SEQ ID 5中列出的序列组成。
更优选的，该抗体或其功能等同物包含轻链，所述轻链包含或由一序列组成，所述序列与SEQ ID 3有至少95％，更优选的至少98％，更优选的至少99％的同源性或同一性。MASP-2的功能同源物的同源性百分比可以如在此描述的来确定。更加优选的，抗体或其功能等同物包含轻链，所述轻链包含或由SEQ ID 3中列出的序列组成。更优选的，该轻链由附图10的DWE16140-10con序列组成。优选的，所述抗体或其功能等同物能够特异性地识别一表位，所述表位被称为NimoAb101的抗体所识别。
在一个优选的实施方式中，抗体或其功能等同物包含在以上描述的重链CDR和轻链CDR。更优选的，抗体或其功能等同物包含上述重链可变区和上述轻链可变区。更优选的，抗体或其功能等同物包含在此描述的重链和在此描述的轻链。
因而，在本发明的非常优选的实施方式中涉及一种抗体，所述抗体包含选自以下的一个或多个，优选的至少2个，更优选的至少3个，更优选的至少4个，更优选的至少5个，更优选的至少6个CDR1)SEQ ID 6的重链的CDR1；2)SEQ ID 7的重链的CDR2；3)SEQ ID 8的重链的CDR3；4)SEQ ID 9的轻链的CDR1；5)SEQ ID 10的轻链的CDR1；或6)SEQ ID 11的轻链的CDR1；或其功能等同物。此外这个抗体优选的能抑制MASP-2的活性和/或能够特异性识别以下所述的MASP-2表位。
MASP-2表位和肽MASP-2蛋白质包含许多结构域，称为CUB 1、EGF、CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域。在附图1中给出了MASP-2的示意图。在附图2中表明了在人MASP-2中各个结构域的位置。据信，与同MBL联合有关的结构域位于N-末端，而丝氨酸蛋白酶结构域与MASP-2的丝氨酸蛋白酶活性有关。令人惊讶的，对MASP-2的C末端产生的抗体在全血清中比其他针对MASP-2的抗体更有效地抑制MASP-2的活性。
根据本发明的抗体和其功能等同物特异性识别MASP-2的C-末端部分中的表位。“特异性识别”意思是与其他分子或其部分相比，抗体以显著更高的亲合性与所述表位结合。优选的，经Western印迹或ELISA检测，该抗体仅与所述表位结合。为确保抗体特异性地识别MASP-2的给定片段中的表位，在产生所述抗体的过程中将所述片段用作抗原。在本发明中优选的是，用于免疫的MASP-2抗原长度大于18个氨基酸，例如至少20个，如至少25个，例如至少30个氨基酸。举例来说，如果抗体识别CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域中的表位，在产生所述抗体的过程中把由CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成的肽用作抗体。
优选的，抗体或其功能等同物特异性地识别MASP-2的C-末端部分中的表位，其中所述C-末端部分包含、或甚至更优选的由EGF、CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。在本发明的一个实施方式中，MASP-2的C-末端部分包含或优选的由CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。在本发明的另一个实施方式中，MASP-2的C-末端部分包含或优选的由CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。在本发明的又一个实施方式中，MASP-2的C-末端部分包含或由CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。在本发明优选的实施方式中，MASP-2的C-末端部分包含或优选的由丝氨酸蛋白酶结构域组成。
在本发明更进一步的实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或优选的由CCP1结构域组成。在本发明又一个实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或优选的由CCP2结构域组成。在本发明再进一步的实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或优选的由CCP1和CCP2结构域组成。
术语“MASP-2”是指本领域技术人员已知的任何MASP-2分子。例如所述MASP-2可以来自哺乳动物，例如MASP-2可以是来自人。在本发明的优选实施方式中，MASP-2是人MASP-2，被确定为SEQ ID 1或与SEQ ID 1有至少50％、优选的至少60％、更优选的至少70％、更优选的至少80％、更优选的至少90％、更优选的至少95％的同源性、或更优选的为同一性的功能同源物。在本发明非常优选的实施方式中，MASP-2是SEQ ID 1的MASP-2。
因此，在优选的实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸136到686或其功能等同物组成，因此所述片段包含人MASP-2的EGF、CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域。
因此，在本发明另一个实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸183到686或其功能等同物组成。因而所述片段包含人MASP-2的CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域。
在本发明的又一个实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸293到362或其功能等同物组成。所述片段包含人MASP-2的CCP1结构域。
在本发明进一步的实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸293到431或其功能同源物组成。所述片段包含人MASP-2的CCP1和CCP2结构域。
在本发明再进一步的实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸363到431或其功能等同物组成。所述片段包含人MASP-2的CCP2结构域。
因此，在本发明更进一步的实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸293到686组成。因而所述片段包含人MASP-2的CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域。
在本发明再进一步的实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸363到686或其功能等同物组成。所述片段(＝CCP2、丝氨酸蛋白酶)在本发明更进一步的实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸445到686或其功能等同物组成。所述片段包含人MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域。
在本发明的一个实施方式中，所述表位不在SEQ ID 1的氨基酸505到523和氨基酸538到556之内。
在本发明的一个优选实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或优选的由SEQ ID 1的氨基酸363到385，如370到390，例如380到400，如390到410，例如400到420，如410到430，例如420到440，如430到450，例如440到460，如450到470，例如460到480，如470到490，例如480到500，如490到510，例如500到520，如510到530，例如520到540，如530到550，例如540到560，如550到570，例如560到580，如570到590，例如580到600，如590到610，例如600到620，如610到630，例如620到640，如630到650，例如640到660，如650到670，例如660到686组成，其中所述片段最多包含100个、优选的最多80个、更优选的最多60个、更优选的最多40个氨基酸。
在另一个优选实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸400到420，如410到430，例如420到440，如430到450，例如440到460，如450到470，例如460到480，如470到490，例如480到500，如490到510，例如500到520，如510到530，例如520到540，如530到550组成，其中所述片段最多包含100个、优选的最多80个、更优选的最多60个、更优选的最多40个氨基酸。
在又一个优选实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或优选的由SEQ ID 1的氨基酸410到430，例如420到440，如430到450，例如440到460组成，其中所述片段最多包含100个、优选的最多80个、更优选的最多60个、更优选的最多40个氨基酸。
在另一个非常优选的实施方式中，抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或优选的由氨基酸420到440或430到450组成。
在本发明的一个优选实施方式中，抗体或其功能等同物特异性地识别一表位，所述表位可被命名为M0545YM035的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体识别。
在本发明的另一个优选实施方式中，抗体或其功能等同物特异性地识别一表位，所述表位可被命名为M0545YM029的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体识别。
在本发明的另一个优选实施方式中，抗体或其功能等同物特异性地识别一表位，所述表位可被命名为M0545YM046的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体识别。
在本发明的另一个优选实施方式中，抗体或其功能等同物特异性地识别一表位，所述表位可被命名为M0545YM048的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体识别。
在本发明特别优选实施方式中，抗体或其功能等同物特异性地识别一表位，所述表位可被以保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体识别。
特别地，由以保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞系和命名为M0545YM029和M0545YM035的杂交瘤细胞系生产的抗体识别重叠表位。因而，优选的是，抗体或其功能等同物特异性地识别一表位或其部分，所述表位可被一个或多个选自以下组的抗体识别以保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；命名为M0545YM029的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；或命名为M0545YM035的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
根据本发明，当给定抗体识别可被另一个给定抗体识别的表位的至少一部分时，称为这两个抗体识别相同的或重叠表位。
本领域技术人员可以用各种化验来确定一种抗体(也称为测试抗体)是否与一种特定抗体(也称为参考抗体)识别相同的或重叠的表位。优选的，该分析包括步骤提供包含可被参考抗体识别的表位的MASP-2或其片段；向所述MASP-2中添加测试抗体和参考抗体，其中测试抗体和参考抗体都用可检测的标记物标记了。做为选择，两种抗体都用不同的可检测标记物标记；检测MASP-2上可检测标记物的存在；从而检测测试抗体是否可以代替参考抗体。
如参考抗体被替换，测试抗体识别与参考抗体识别的相同或重叠的表位。因而如果用可检测标记物标记了参考抗体，在MASP-2上的低可检测信号表明了对参考抗体的替代。因而如果用可检测标记物标记了测试抗体，在MASP-2上的高可检测信号表明了对参考抗体的替代。优选MASP-2片段被固定在固体支持物上以便处理。可检测标记物可以是任何可直接或间接检测的标记物，例如酶、放射性同位素、重金属、有色化合物或荧光化合物。在以下的实施例5中描述了“MASP-2竞争性ELISA”，是用于确定测试抗体是否识别与参考抗体识别的相同或重叠的表位的非常优选的方法。本领域技术人员可以很容易地针对特定的讨论中的抗体来修改所述方法。
本发明的又一个目的是提供分离的MASP-2多肽用作产生MASP-2抗体的抗原，特别是能在全血清中抑制MASP-2活性的MASP-2抗体。例如所述多肽可用于免疫动物以产生针对该多肽的抗体。
本发明可以使用任何C-末端MASP-2多肽，然而优选的多肽是包含或更优选由MASP-2的EGF、CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成的分离的多肽。因此，根据本发明非常优选的MASP-2多肽包含或更优选的由SEQ ID 1的氨基酸136到686或其功能等同物组成。
在另一个实施方式中，所述分离的MASP-2多肽包含或优选的由CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。因此，优选的MASP-2多肽包含或由SEQ ID 1的氨基酸183到686或其功能等同物组成。
在本发明的又一个实施方式中，所述分离的MASP-2多肽包含或优选的由CCP1结构域组成。因此，优选的多肽包含或更优选的由SEQ ID 1的氨基酸293到362或其功能等同物组成。
在本发明进一步的实施方式中，所述分离的MASP-2多肽包含或优选的由CCP2结构域组成。例如，所述多肽可以包含或更优选的由SEQ ID 1的氨基酸363到431或其功能等同物组成。
在本发明更进一步的实施方式中，所述分离的MASP-2多肽包含或优选的由CCP1和CCP2结构域组成。因此，所述多肽可以包含或更优选的由SEQ ID 1的氨基酸293到431或其功能等同物组成。
C-末端MASP-2多肽优选的长度最多为570个氨基酸，例如所述多肽的长度可在20到570个，如30到500个，例如50到400个，如100到300个，例如150到250个氨基酸的范围中。
包含预定的氨基酸序列、例如在SEQ ID 1中列出的氨基酸序列的片段，MASP-2多肽或片段的功能等同物或功能同源物，被定义为包含一氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列能被也能识别所述预定的氨基酸序列的抗体识别。术语“功能等同物”和“功能同源物”在此可互换地使用。
根据本发明的功能同源物包含具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与在上列出的预定的MASP-2多肽序列具有同源性。例如这种多肽与上述列出的预定多肽序列具有至少约40％、如至少约50％，例如至少约60％，如至少约70％，例如至少约75％，如至少约80％，例如至少约85％，如至少约90％，例如至少约92％，如至少约94％，例如至少约95％，如至少约96％，例如至少约97％，如至少约98％，例如至少约99％的同源性。
优选同源性可以通过任何适当的的算法，或计算机实施的这些算法来计算，所述算法例如在Intelligenetics的PC/Gene程序中的CLUSTAL，或在Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group(GCG)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。此外氨基酸序列之间的同源性也可以借助公知的矩阵，例如BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85和BLOSUM 90中的任何一个来计算。
根据本发明的功能同源性优选的是具有一氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与上述列出的预定MASP-2多肽序列具有至少约50％、优选的至少约60％、更优选的至少约70％、更优选的至少约75％、更优选的至少约80％、更优选的至少约85％、更优选的至少约90％、更优选的至少约95％、更优选的至少约98％的同源性。
功能同源物可以包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含一个氨基酸被替换为任何其他氨基酸的至少一个替换。例如这种替换可以是保守性氨基酸替换或可以是非保守性替换。优选的，所述替换是保守性替换。
保守性氨基酸替换是用预定氨基酸组中的一个氨基酸替换同组中的另一个氨基酸，其中在预定组中的氨基酸表现出相似的或实质上相似的性质。在此处应用的术语“保守性氨基酸替换”的含义之中，在具有以下特征的氨基酸组之中一个氨基酸可被另一个氨基酸替换i)极性侧链(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys)ii)非极性侧链(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met)iii)脂肪族侧链(Gly、Ala、Val、Leu、Ile)iv)环状侧链(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)v)芳香侧链(Phe、Tyr、Trp)vi)酸性侧链(Asp、Glu)vii)碱性侧链(Lys、Arg、His)viii)酰胺侧链(Asn、Gln)ix)羟基侧链(Ser、Thr)x)含硫侧链(Cys、Met)，和xi)是单氨基-二羧酸或单氨基-单羧酸-单氨基羧酸的氨基酸(Asp、Glu、Asn、Gln)。
氨基酸的添加或删除可以是添加或删除2到5个氨基酸，如5到10个氨基酸，例如10到20个氨基酸，如20到50个氨基酸。然而，添加或删除超过50个氨基酸，如添加50到200个氨基酸，也包含在本发明的范围之中。
除此处描述的多肽化合物之外，可以设计空间上相似的化合物来模拟肽结构的关键部分，这样的化合物也可以按照与本发明的肽相同的方式来使用。这可以通过本领域技术人员公知的建模和化学设计技术来实现。例如，可以应用酯化作用及其他烃基化作用来修饰例如二精氨酸肽的主链，来模拟四肽结构。应当理解的是，所有这种空间上相似的结构都处于本发明的范围之中。
具有N-末端烷化和C-末端酯化的肽也被包含在本发明之中。功能等同物还包含糖基化的和共价的或聚合的结合物，包括二聚体或无关的化学部分。通过本领域已知的方法，将官能团连接到位于片段的N-末端和C-末端之一、或两者上的基团上，来制备这种功能等同物。
因而功能等同物可包含片段，所述片段联结到脂肪族的或酰基的酯、或羧基末端的酰胺基、烷基胺或包含羧基侧链的残基上，例如，联结到天冬氨酸残基上的烷基胺的联结物；含羟基残基的O-酰基衍生物，和氨基末端氨基酸或含氨基残基的N-酰基衍生物，例如联结到Met-Leu-Phe的联结物。酰基基团的衍生物选自烷基部分(包括C3到C10正常烷基)，从而形成烷醇类，和选自碳环或杂环化合物，从而形成芳酰基类。活性基团优选的是双官能化合物，所述双官能化合物本身是已知用于通过反应性侧基将蛋白质与不溶性基质交联的。
此外功能同源物可以是由核酸编码的多肽，所述核酸能在严紧杂交条件下与编码前述预定MASP-2多肽序列的核酸序列的互补链杂交。
在此使用的严紧条件是指按照如Southern E.M.1975，J.Mol.Biol.98503-517描述的Southern印迹和杂交中正常应用的严紧程度。为此，常规的实践包括预杂交和杂交的步骤。通常利用包含6×SSPE、5％Denhardt′s、0.5％SDS、50％甲酰胺、100μg/ml变性的鲑鱼睾丸DNA(在42℃孵育18小时)，随后用2×SSC和0.5％SDS(在室温下和在37℃)洗涤，和用0.1×SSC和0.5％SDS(在68℃孵化30分钟)来进行这样的步骤，如Sambrook等，1989，在“Molecular Cloning/a Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor)中所描述的，通过引用将其合并在此。
可以通过任何常规方法来确定可被特定抗体识别的表位，例如涉及使用质谱的方法。利用质谱的表位作图法的非限制性实例包括1.Baerga-Ortiz，A，Hughes，CA，Mandel，JG，Komives，EAEpitopemapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchangemass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conservedprotein.Protein Sci.111300-1308，2002
2.Hochleitner，EO，Borchers，C，Parker，C，Bienstock，RJ，Tomer，KBCharacterization of a discontinuous epitope of the human immunodeficiencyvirus(HIV)core protein p24by epitope excision and differential chemicalmodification followed by mass spectrometric peptide mapping analysis.
3.Hochleitner，EO，Gorny，MK，Zolla-Pazner，S，Tomer，KBMassspectrometric characterization of a discontinuous epitope of theHIV envelopeprotein HIV-gp120 recognized by the human monoclonal antibody 1331A.J.Immunol.1644156-4161，20004.Parker，CE，Tomer，KBMALDI/MS-based epitope mapping of antigensbound toimmobilized antibodies.Mol.BiotechnoL 2049-62，20025.Peter，JF，Tomer，KBA general strategy for epitope mapping by directMALDI-TOF mass spectrometry using secondary antibodies and cross-linking.Anal.Chem.734012-4019，20016.Van De，WJ，Deininger，SO，Macht，M，Przybylski，M，Gershwin，MEDetection of molecular determinants and epitope mapping usingMALDI-TOF mass spectrometry.Clin.Immunol.Immunopathol.85229-235，19977.Yu，L，Gaskell，SJ，Brookman，JLEpitope mapping of monoclonalantibodies by mass spectrometryidentification of protein antigens in complexbiological systems.J.A m.Soc.Mass Spectrom.9208-215，19988.Zhao，Y，Chalt，BTProtein epitope mapping by mass spectrometry.Anal.Chem.663723-3726，1994制备MASP-2抗体的方法可以通过任何本领域技术人员已知的合适方法来生产抗体和其功能等同物。
生产特异性识别和结合MASP-2的C-末端部分中的表位的抗体的一种方法包括向哺乳动物施用MASP-2的C-末端部分或其片段或其功能同源物的步骤。所述MASP-2的C-末端部分或其片段或其功能同源物可以是前述的任何MASP-2片段和肽。特别地，MASP片段可以是任何前述的MASP-2片段，其中所述片段包含表位。向所述哺乳动物施用的MASP-2的C-末端部分或其片段或其功能同源物在此也称为“MASP-2抗原”。
在一个实施方式中，本发明涉及生产能抑制MASP-2活性的抗体的方法，其中所述抗体特异性地识别MASP-2的C-末端部分中的表位。
MASP-2抗原长度优选的至少18个氨基酸，更优选至少20个，再更优选的至少25个氨基酸。
可以向所述哺乳动物施用MASP-2抗原一次以上，如两次、例如3次、如3到5次，例如5到10次，如10到20次，例如20到50次，如超过50次。也可能向同一哺乳动物施用不同的MASP-2抗原，可以同时性地也可以按任何顺序次序性地施用。
通常，在施用前将MASP-2抗原置于水溶液中或悬浮。此外，MASP-2抗原可以与一个或多个其他化合物混合。例如，MASP-2抗原可以与一个或多个适合的佐剂和/或与一个或多个载运体混合。
佐剂是一种物质，其与施用的抗原的混合物增强或修改了针对所述抗原的免疫反应。例如，佐剂可以选自AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、硅土、明矾、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、高岭土、石墨、氢氧化铝、胞壁酰二肽、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(N-acetyl-nornuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine)(CGP 11687，也称为nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′，2′-二棕榈酰-sn-丙三氧基-3-羟基磷酰基氧代)-乙胺(CGP 19835A，也称为MTP-PE)、在2％角鲨烯/Tween-80乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)、脂多糖和它的各种衍生物，包括脂质A、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂、Merck佐剂65、多核苷酸(例如，聚IC和聚AU核苷酸)、来自结核分枝杆菌的蜡D(wax D)，在短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属的成员中发现的物质、脂质体或其他脂质乳剂、Titermax、ISCOMS、Quil A、ALUN(参见US 58767和5554，372)、脂质A衍生物、霍乱毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基质或GMDP、白细胞介素1、白细胞介素2、Montanide ISA-51或QS-21。用于本发明的优选的佐剂包括弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂。
载运体是支架结构，例如多肽或多醣，抗原能够与之缔合。载运体可以独立于佐剂存在。载运体的功能可以是，例如增强分子量、特别是MASP-2抗原的分子量，来增强免疫原性，赋予稳定性、增强生物活性或提高血清半衰期。载运体可以是本领域技术人员已知的任何适合的载运体，例如蛋白质或抗原呈递细胞。载运体蛋白可以是，但不限于钥孔青贝血蓝素、血清蛋白如铁传递蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白、免疫球蛋白或激素，如胰岛素或棕榈酸。
可以通过任何的适合的方法，例如胃肠外的、口服的或局部的方法来施用MASP-2抗原。然而优选的，抗原是通过注射，例如肌肉内的、皮内的、静脉内或皮下注射来施用，更优选的通过皮下的或静脉注射来施用。
哺乳动物可以是任何适合的哺乳动物。往往利用啮齿动物，例如小鼠或大鼠来制备单克隆抗体。可以通过向任何哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、绵羊、奶牛或骆驼施用MASP-2抗原来制备多克隆抗体。根据本发明的抗体可以是抗体的混合物，例如单克隆抗体的混合物，多克隆抗体的混合物，或两者的混合物。因此，使用超过一种动物也包含在本发明的范围之内。
如果抗体是单克隆抗体，抗体生产细胞通常是在免疫之后从所述哺乳动物分离。例如，该方法可包括从所述哺乳动物分离抗体生产细胞、从所述抗体生产细胞制备杂交瘤细胞、培养所述杂交瘤和分离所述杂交瘤生产的抗体的步骤。
例如，所述细胞可以在用MASP-2抗原首次施用之后1天、如2到10天的范围内、例如10到20天的范围内、如20到40天的范围内、例如1到3个月的范围内、如3到6的范围内、例如6到12个月的范围内、如12到24个月的范围内、例如超过24个月，从所述哺乳动物分离。
抗体生产细胞一般是B细胞，例如所述细胞可以通过切下所述哺乳动物的脾来从所述哺乳动物分离。
一旦从所述哺乳动物分离出抗体产生细胞，可以将该细胞与其他细胞融合以获得杂交瘤细胞。所述细胞可以是例如癌细胞、如来自白血病的细胞，例如骨髓瘤细胞。在融合之后可以用标准的培养方案来培养所述杂交瘤细胞。可以测试培养基(上清液)是否存在适合的MASP-2抗体，并可以选择出和培养能生产适合的MASP-2抗体的杂交瘤细胞。
可以用任何的适合的方法进行测试，例如检测能与MASP-2抗原缔合的抗体存在的方法。这种方法包括，但不限于Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附分析)、斑点印迹或TRIFMA。另外的或作为选择，可以测试所述培养基是否存在能抑制MASP-2活性的MASP-2抗体。确定MASP-2活性的适合的化验如下述。
一旦鉴定出能生产适合的MASP-2抗体的杂交瘤细胞，可以利用任何标准方案来培养所述细胞，并可以纯化由所述细胞生产的抗体。可以利用任何标准的方案来进行抗体的纯化，例如利用抗体-Ig抗体、蛋白G或蛋白A的纯化方法。
如果该抗体是多克隆抗体，所述抗体例如可以直接从用MASP-2抗原免疫的哺乳动物的血清中直接纯化。可以利用任何标准方法来进行抗体的纯化，例如利用抗-Ig抗体、蛋白G或蛋白A的纯化方法。
例如在AntibodiesA Laboratory Manual，ByEd Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中描述了制备单克隆抗体、单克隆抗体的混合物或多克隆抗体的方法。
在以下的实施例1中描述了制备根据本发明的抗体的方法的一个非限制性实例。
取决于抗体的性质，可以使用几种其他方法。
在本发明的一个实施方式中，可以利用重组方法生产抗体，例如蛋白质工程方法或通过筛选文库的方法。文库可以是合成文库或包含天然物质的文库。一种有用的方法是噬菌体展示。通常噬菌体展示涉及在一个或多个噬菌体文库中筛选编码有用抗体或其功能等同物的噬菌体。
在本发明的另一个实施方式中，该方法涉及利用动物，例如啮齿动物，如遗传工程化的小鼠来生产嵌合抗体或另一个物种的抗体，例如人抗体。例如，可以用上述提及的任何MASP-2片段来免疫转基因动物，如转基因小鼠，所述转基因动物携带来自另一个物种的抗体基因，如人抗体基因。
可以利用本领域技术人员已知的任何方法断裂根据本发明的抗体来生产抗体片段。该方法包括，但不限于用一个或多个蛋白水解酶例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，以及还原，或两者相结合。
抑制MASP-2活性本发明还涉及抑制MASP-2的活性的方法。特别地，该方法包括步骤1)提供包含MASP-2的组合物；
2)提供根据本发明的MASP-2抗体；3)将所述组合物与所述抗体一同孵育，从而抑制MASP-2活性。
该组合物可以是任何包含MASP-2的组合物，例如血清。该MASP-2抗体优选的是能抑制MASP-2活性的MASP-2抗体。
检测MASP-2活性的化验可以通过任何适合的化验来确定MASP-2活性。有用的化验包括特别的化验，其中测试MASP-2/MBL复合物的丝氨酸蛋白酶活性。优选的化验，是确定抑制C2和/或C4沉积作用的化验。
化验可以涉及以下步骤，制备其上固定有MBL缔合剂的固体表面，使MBL/MASP-2复合物与所述MBL缔合剂结合，和筛选对MASP-2催化的反应的抑制作用。
所述固体表面可以是任何有用的固体表面，例如微滴定孔。MBL缔合剂可以是MBL以高亲合性与之结合的任何化合物，例如MBL抗体、甘露聚糖或甘露糖、然而优选的是甘露聚糖。MBL/MASP-2复合物可以来自任何适合的来源，例如可以是从血清中纯化的重组MBL、重组MASP-2或MBL和/或MASP-2。重组MBL/MASP-2可以是全长MBL/MASP-2或其功能片段。此外，重组MBL/MASP-2可以附着于一个或多个其他化合物，例如遗传标签。MBL和/或MASP-2可以来自任何适合的物种，例如其可以是人MBL/MASP-2。在本发明的一个实施方式中，MBL/MASP-2复合物存在于全血清中，在进行分析前不被纯化。然后所述化验测试对底物的沉积的抑制，底物例如全血清中的C4。MASP-2催化的反应优选的是对C2和/或C4的沉积。
将需筛选抑制活性的抗体或其功能等同物添加到结合的MBL/MASP-2中。抗体可以是已被纯化的，或是例如粗分的杂交瘤细胞培养上清液。优选的还进行未添加抗体的对照。可以以浓度范围1μg/ml到500μg/ml，优选的5μg/ml到400μg/ml，更优选的10μg/ml到300μg/ml，更优选的15μg/ml到200μg/ml，更优选的20到100μg/ml来添加抗体。
向MBL/MASP-2复合物中添加MASP-2底物。优选的，所述底物是C2或C4，或两者的混合物。所述底物可以是重组生产的或血清来源的底物。底物在使用前可以是已纯化的或是未纯化的，但优选的是纯化的。为了监视沉积，可以用可检测标记物，例如用酶、放射性化合物、荧光化合物、染料、重金属、化学发光化合物等对底物进行标记。
然而优选的是利用特异性结合试剂检测沉积，例如特异性识别消化的底物的抗体。例如，可以使用识别人类补体C4c的抗体。所述抗体可以用直接的或间接的可检测标记物来标记。例如，通过酶、放射性化合物、荧光化合物、染料、重金属、化学发光化合物或亲合化合物来标记。亲合化合物包括例如其他抗体或生物素，链霉抗生物素蛋白。
可以按任何有用的次序进行上述步骤，即，可以在抑制性抗体之前或同时添加底物，可以在固定到固体表面之前使MBL/MASP-2复合物与底物和/或抑制性抗体混合，等等。也可以按照描述的顺序进行步骤。
如果在固定化之前混合MBL/MASP-2复合物、底物和抗体，则可以将所述混合体预孵化一给定时间，例如预孵化可以在5分钟到2小时的范围内。通常，当MBL/MASP-2复合物存在于血清中、并且没有预先从血清中纯化时，预先混合MBL/MASP-2、底物和抗体。
在本发明的一个优选实施方式中，利用在实施例2和3中描述的任一方法来确定MASP-2的活性。特别地，能抑制C4沉积作用的抗体优选的应能在实施例2和3中的至少一个、优选的在两个方法中抑制C4沉积作用。能抑制C4沉积作用的抗体更优选的至少应能根据在实施例2中描述的方法抑制C4沉积作用，而能在全血清中抑制C4沉积作用的抗体应能如实施例3中描述的在全血清中抑制C4沉积作用。
药物组合物和其施用在一个实施方式中本发明涉及包含根据本发明的抗体和其功能等同物的药物组合物。本发明还涉及包含抗体用于医治临床状况的药剂、包括施用所述抗体的医治临床状况的方法、或所述抗体用于制备医治临床状况的药物的用途。
临床状况可以是以下提及的任何状况。需要施用MASP-2抗体的个体可以是患有所述状况或存在获得所述临床状况的风险的任何个体。优选的，所述个体是人。
医治可以是疗效性的、缓解性的、改善性的和/或预防性的医治。
本发明的药物组合物优选的包含药学有效量的至少一种特异性识别MASP-2的C-末端中的表位的抗体或其功能等同物(在上下文中称为“MASP-2抗体”)。药学有效量是MASP-2抗体的数量，其在接受所述药物组合物的个体中诱导期望的反应。
MASP-2抗体的药学有效量取决于其施用的个体、特别是所述个体的大小以及临床状况和特定的施用模式。然而通常，每一剂量向成人施用在1mg到5000mg的范围中，优选的10mg到3000mg的范围，更优选的在50mg到1000mg的范围，例如100mg到750mg的范围，如150mg到500mg的范围，例如200mg到400mg的范围，如250mg到350mg的范围，例如约300mg的MASP-2抗体。
本发明的组合物可以是适于肠胃外施用的药物组合物。这种组合物优选的包括水性的或非水性的无菌注射溶液，其可包含湿润或乳化剂、抗氧化剂、pH缓冲剂、抑菌化合物和使制剂与体液等渗的溶质，体液优选的是个体的血液；和水性的和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂或增稠剂。该药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和管形瓶，并可以贮藏在冻干条件下，仅需在使用前当即添加无菌液体载运体。
优选的，本发明的组合物包含一个或多个适合的药学上的赋形剂，其可以是非无菌的或无菌的，用于细胞、组织或器官，例如适于向个体施用的药学上的赋形剂。这种赋形剂可以包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和这些赋形剂以各种数量的组合。制剂应适合施用的模式。本发明进一步涉及成套的药物试剂盒，包含一个或多个容器，所述容器装填有一种或多种本发明的上述组合物的成分。非水赋形剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。
优选的，本发明的药物组合物以可注射的形式制备，可以是液体溶液或悬浮液；此外适于在注射前溶于或悬浮于液体之中的固体形式也处于本发明的范围之内。该制备物可以是乳化的或免疫原性决定簇，以及根据本发明的胶原凝集素(collectins)和/或胶原凝集素同源物可以被包裹在脂质体中。
MASP-2抗体可以单独施用或与其他化合物组合施用，可以是同时性的或以任何次序顺序性的施用。
施用可以是例如胃肠外的或输液、快速输液、鼻咽吸收、皮肤吸收、和肠道的，例如口服。胃肠外的注射可以是例如静脉的、肌肉内的、皮内的或皮下的注射。优选的，所述施用是通过注射或输液的胃肠外施用。
应按需要频度施用MASP-2抗体，因此MASP-2抗体可以施用超过一次，如至少两次，例如至少3次，如至少4次，例如至少5次，如在1到100的范围内，例如在1到50次的范围内，如在1到25次的范围内，例如在1到10次的范围内。
优选的，在两次施用之间有至少1天，如至少2天，例如至少3天，如至少5天，例如至少一周，如至少2周，例如至少一个月，如至少6个月，例如至少1年，如至少2年，例如至少3年，如至少5年，例如至少10年。
临床状况根据本发明的临床状况可以是任何的状况，其可以通过施用MASP-2抗体被有疗效地、改善性地或预防性地医治。
本发明一个优选实施方式的临床状况是慢性的炎性疾病。慢性的炎性疾病可以是例如自体免疫性炎症状况。
自体免疫性炎症状况(在此也称为“自体免疫失调”)可以被宽松地归类入那些主要局限于特定器官或组织和那些影响整个身体的疾病。器官特异性失调(和受影响的器官)的实例包括多发性硬化(包被在神经突起上的髓鞘质)、I型糖尿病(胰腺)、桥本氏甲状腺炎(甲状腺)、恶性贫血(胃)、阿狄森氏病(肾上腺)、重症肌无力(神经肌肉接点上的乙酰胆碱受体)、类风湿性关节炎(关节衬面)、葡萄膜炎(眼)、银屑癣(皮肤)、格-巴二氏综合症(神经细胞)和葛雷夫斯氏病(甲状腺)。系统性的自体免疫疾病包括系统性红斑狼疮、肾小球肾炎(glomeronephritis)和皮肌炎。
在本发明的一个实施方式中，优选的临床状况选自类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。
自体免疫失调的其他实例包括哮喘、湿疹、异位皮炎(atopicaldermatitis)、接触性皮炎、其他湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、鼻炎、扁平地衣、天疱疮(Pemplugus)、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、脉管炎、红斑、皮肤嗜曙红细胞增多、局限性脱发、动脉硬化、原发性胆汁性肝硬变和肾病综合征。相关的疾病包括肠炎、如腹部疾病(coeliacdisease)、直肠炎、嗜曙红性胃肠炎、肥大细胞增生病、炎症性肠病、Chrohn′s病和溃疡性结肠炎，以及与食物有关的过敏。
在本发明的另一个实施方式中，临床状况以大块(massive)的细胞丧失为特征，例如由于程序性细胞死亡或坏死。所述坏死或程序性细胞死亡可以由许多种因素诱导。
在本发明的优选实施方式中，临床状况是缺血性/重灌注性损伤。缺血可以由各种原因引发，例如在中风、心肌梗塞、大手术或器官移植之后。因而，临床状况可以是由例如中风、心肌梗塞、大手术或或器官移植引起的缺血性/重灌注性损伤。
因此，临床状况可以是缺血性/重灌注性损伤，其是PTCA(经皮腔内冠状动脉成形术)或CABG(冠状动脉旁路移植术)的结果。此外，临床状况可以是缺血性/重灌注性损伤，其是急性心肌梗塞或脑缺血的结果。
实施例实施例1单克隆抗MASP-2抗体对雌性Wistar大鼠(8周龄)皮下注射3μg在完全弗氏佐剂中乳化的重组人MASP-2CCP1-CCP2-丝氨酸蛋白酶结构域(CCP1/2-SP)(Rossi等，2001)，用在不完全的弗氏佐剂中的3μgCCP1/2-SP强化三次。在移除脾脏前三天，静脉内给予盐水中的3μg CCP1/2-SP对大鼠进行强化。脾细胞悬浮物与小鼠骨髓瘤细胞(X63-Ag8.653)的融合和在小鼠饲养细胞上的培养已有描述(Liu等，2001)。
为了检测上清液中的抗MASP-2抗体，微量滴定板(FluoroNunc，Nunc，Kamstrup，Denmark)用在100μl 15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mMNaN3、pH 9.6(包被缓冲液)中的1μg甘露聚糖(Nakajima和Ballou，1974)4℃过夜包被。用在200μl10mM Tris-HCl、140mM NaCl、1.5mM NaN3，pH7.4(TBS)中的200μg人血清白蛋白(HSA)在室温下1小时，封闭剩余的蛋白结合位点。
用含0.05％(v/v)Tween 20和5mM CaCl2的TBS(TBS/Tw/Ca2+)洗涤加样孔，随后用在100μl TBS/Tw/Ca2+中的0.5μg MBL/MASP制备物4℃下孵化过夜。
洗涤以后，向加样孔中添加在TBS/Tw/Ca2+中稀释了5倍的杂交瘤上清液，在室温下孵化2小时。通过添加在100μlTBS/Tw、25μMEDTA中的用铕(Perkin Elmer，Gaithersburg，USA)标记的50ng兔抗大鼠Ig抗体(Dako，Glostrup，Denmark)(Hemmila等，1984)，来检测结合的抗MASP-2抗体。置室温下1小时后，洗涤加样孔，通过添加200μl增强溶液(Perkin Elmer)，在DELFIA荧光计(PerkinElmer)上读取时间分辨的荧光作用，来检测结合的铕。选择出的阳性培养物通过有限稀释克隆两次，在60％(v/v)DMEM、30％(v/v)胎牛血清、10％(v/v)DMSO中冷冻。
在SDS-PAGE上分离MBL/MASP制备物，随后印迹到PVDF膜上。在印迹上测试选定的抗体对MASP-2的识别。
如以下的实施例2中描述的，通过筛选对MASP-2催化的C4沉积作用的抑制来鉴定抑制性抗体。
产生选择出的抗体的杂交瘤细胞系的培养物上清液在10,000g离心15分钟，用10mM Na2HPO4、10mM EDTA，pH 7对上清液进行缓冲。使一百毫升上清液流经1ml抗牛Ig柱(每毫升CNBr活化的琼脂糖4B珠(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)5mg抗牛Ig(Dako))，所述柱在含10mM EDTA的1.5mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mMKCl、pH 7.4(PBS)(PBS/EDTA)中平衡。流出物经过1ml蛋白G琼脂糖(AmershamBioscience)柱，所述柱预先用0.1M甘氨酸、pH 2.5洗涤，用PBS/EDTA再平衡。柱用30ml PBS/EDTA洗涤，用0.1M甘氨酸、pH 2.5洗脱。将洗脱物以0.5ml的馏分收集到40μl 1M Tris-HCL、pH 8.5中。
实施例2对抑制MASP-2催化的C4沉积作用的分析该分析由三个步骤组成(1)制备甘露聚糖包被的微量滴定孔，(2)使rMBL和rMASP-2与甘露聚糖包被的加样孔结合，(3)筛选对MASP-2催化的C4沉积作用的抑制。
1)制备甘露聚糖包被的微量滴定孔96孔微量滴定板(FluroNunc，Nalgene Nunc Int.，Denmark)用包被缓冲液(Na2CO33.18g/L；NaHCO35.86g/L；利用HCl调整pH值到9.6)中的甘露聚糖(10mg/L，Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)包被，4℃过夜。在TBS(10mM Tris、150mM NaCl，利用HCl调整pH值到7.4)中洗涤加样孔两次。然后在添加了1mg/mL人白蛋白(State Serum Institute，Copenhagen Denmark)的如上的缓冲液中在室温下孵化1小时来封闭加样孔。在TBST+Ca2+(10mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.05％Tween 20、利用HCl调整pH值到7.4，以后称之为洗涤缓冲液)中洗涤加样孔3次，就可以使用。
2)rMBL和rMASP-2与甘露聚糖包被的加样孔的结合通过在额外添加1mg/mL人白蛋白(State Serum institute，CopenhagenDenmark)的上述洗涤缓冲液中在4℃下孵化过夜，将0.8ng/孔的重组纯化的人His-标记的MASP-2和1ng/孔的重组纯化的人MBL结合到甘露聚糖包被的微量滴定孔上。在洗涤缓冲液中洗涤加样孔3次，就可使用。
3)筛选对MASP-2催化的C4沉积作用的抑制在额外添加1mg/mL人白蛋白(State Serum Institute，CopenhagenDenmark)的上述洗涤缓冲液中，向结合至甘露聚糖包被的微滴定加样孔的rMBL/rMASP-2中添加需筛选抑制活性的物质(例如，杂交瘤细胞培养物上清液、纯化的抗体)。在洗涤缓冲液中洗涤加样孔3次，与在巴比妥钠(5mM)、NaCl(181mM)、CaCl2(2.5mM)、MgCl2(1.25mM)、pH 7.4的缓冲液中的纯化的人补体成分C4(约1.5-2ng/mL)37℃孵化1.5小时，在使用前添加1mg/mL的人白蛋白(State Serum Institute，Copenhagen Denmark)。在洗涤缓冲液中洗涤加样孔3次，添加0.89mg/L生物素化的兔抗人补体成分C4c(Dako，Denmark，根据标准程序进行生物素化)。在室温下孵化加样孔1小时，在洗涤缓冲液中洗涤3次。以0.1mg/L的浓度将铕标记的链霉抗生物素蛋白(Wallac，Turku，Finland)添加到上述洗涤缓冲液中，不同之处在于不添加钙并包括50μM EDTA。在室温下孵化加样孔1小时，在洗涤缓冲液中洗涤3次。加样孔通过增加100μJ Delfia增强溶液(Perkin Elmer Wallac，Norton，USA)显影，在定轨摇床上室温下孵化5分钟。在Wallac Victor 2dMulti计数器1420(Wallac，Turku，Finland)上对加样孔计数。
与没有添加抑制物质的加样孔相比降低的计数值可以视为抑制作用。
实施例3分析在全血清中对MASP-2催化的C4沉积作用的抑制在上述巴比妥缓冲液中将需分析的血清样品稀释250倍(终浓度)，添加C4(1.5-2ng/mL，终浓度)。添加需要筛选抑制活性的物质(例如，纯化的抗体)，在37℃孵化样品5分钟至2小时。正常的孵化是15分钟。向如上述制备的甘露聚糖包被的微量滴定加样孔中添加100μl，在37℃孵化1.5小时。在上述洗涤缓冲液中洗涤加样孔3次，添加0.89mg/L生物素化的兔抗人补体成分C4c(Dako，Denmark，根据标准程序进行生物素化)。在室温下孵化加样孔1小时，在洗涤缓冲液中洗涤3次。以0.1mg/L的浓度将铕标记的链霉抗生物素蛋白(Wallac，Turku，Finland)添加到上述洗涤缓冲液中，不同之处在于不添加钙并包括50μM EDTA。在室温下孵化加样孔1小时，在洗涤缓冲液中洗涤3次。加样孔通过增加100μL Delfia增强溶液(Perkin Elmer Wallac，Norton，USA)显影，在定轨摇床上室温下孵化5分钟。在Wallac Victor 2dMulti计数器1420(Wallac，Turku，Finland)上对加样孔计数。
附图3说明了在利用以保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体、PBS或甘露糖进行抑制分析后获得的Eu3计数值。在所有测试的血清中抗体能够很大程度抑制C4沉积作用。
附图4说明了以抗体浓度的函数的方式，以保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体在全血清中对C4沉积作用的抑制。
实施例4药物组合物根据本发明的药物组合物的一个剂量单位可以包含300mg MASP-2抗体，所述抗体由以保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞系生产，按照实施例1中所描述的进行纯化，配制在10mM Tris-缓冲液、pH 7.4和140mM NaCl中。
药物组合物经过Planova 75N和Planova 35N滤膜过滤以除去任何病毒，用0.22μm滤膜无菌过滤。
这种制剂适于向人类成年人肠胃外施用。
实施例5抑制性的抗huMASP-2鼠单克隆抗体的生产和表征免疫接种免疫四只小鼠(6-8周龄)。总共进行四次注射注射(每动物每次注射50μg抗原)。在0天用等份(v/v)的完全弗氏佐剂和10μg His-标记的人MASP2(N039-76C)注射小鼠。随后用等份(v/v)不完全弗氏佐剂和抗原进行三次强化，强化间隔三周。利用针对MASP-2的ELISA测试选出在最后一次注射10天后反应最好的小鼠。
杂交，融合利用常规的方法进行融合。利用PEG(聚乙二醇)将反应最好的动物的脾的淋巴细胞与细胞系Sp2/O-Ag-14融合，获得的杂交瘤接种到在HAT培养基中的96孔平板上。
在筛选之前更换培养基2-3次。通常的，杂交瘤克隆在3-5周内就可用于筛选。通过C4沉积作用分析测试上清液中抑制性抗体的存在。通过有限稀释对杂交瘤进行亚克隆。
根据抑制活性筛选出785个初级克隆，选出50个抑制性克隆用于亚克隆。再次筛选亚克隆的抑制性，对显示出最大抑制活性的克隆再次进行亚克隆。在2到3次亚克隆之后，保留了4个感兴趣的抑制性克隆(见以下表1)。
抑制C-4沉积作用的分析缓冲液B1/HSA巴比妥钠(5mM)、NaCl(181mM)、CaCl2(2.5mM)、MgCl2(1.25mM)，pH 7.4的巴比妥钠缓冲液，在使用前添加1mg/mL人白蛋白(State Serum Institute，Copenhagen Denmark)。
分析由三个步骤组成(1)制备甘露聚糖包被的微量滴定孔，(2)抗体与人血清的预孵化，(3)测量MASP-2催化的C4沉积作用。
制备甘露聚糖包被的微量滴定孔96孔微量滴定板(FluroNunc，Nalgene Nunc Int.，Denmark)用包被缓冲液(Na2CO33.18g/L；NaHCO35.86g/L；利用HCl调整pH值到9.6)中的甘露聚糖(10mg/L，Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)包被，在室温下过夜。在TBS(10mM Tris、150mM NaCl，利用HCl调整pH＝7.4)中洗涤加样孔两次。然后在唯一不同之处在于添加了1mg/mL人白蛋白(StateSerum Institute，Copenhagen Denmark)的如上的缓冲液中在室温下孵化1小时来封闭加样孔。在TBST(10mM Tris、150mMNaCl、0.05％Tween 20、利用HCl调pH＝7.4)中洗涤加样孔3次，就可以使用。
抗体与人血清的预孵化需测试的抗体在B1/HSA中连续稀释。将每个稀释度的100μL转移到96孔Nucleon表面平板的加样孔中。将×125稀释的(最终250×)100μL完全人血清与纯化的人补体成分C4(约3-4mg/L)一起添加到每个加样孔中。在37℃孵化15分钟。然后将100μL抗体-人血清混合物转移到先前制作的甘露聚糖包被的平板上。
MASP-2催化的C4沉积作用的测量然后在37℃孵化甘露聚糖包被的平板1.5小时。在洗涤缓冲液TBST+Ca(10mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.05％Tween 20、利用HCl调pH＝7.4)中洗涤加样孔3次，添加在TBST+Ca中稀释了的0.89mg/L生物素化的兔抗人补体成分C4c(Dako，Denmark，根据标准程序进行生物素化)。在室温下孵化加样孔1小时，在洗涤缓冲液中洗涤3次。以0.1mg/L的浓度将铕标记的链霉抗生物素蛋白(Wallac，Turku，Finland)添加到上述洗涤缓冲液中，不同之处在于不添加钙并包括50μM EDTA。在室温下孵化加样孔1小时，在洗涤缓冲液中洗涤3次。加样孔通过添加100μL Delfia增强溶液(Perkin Elmer Wallac，Norton，USA)显影，在定轨摇床上室温下孵化5分钟。在Wallac Victor 2dMulti计数器1420(Wallac，Turku，Finland)上对加样孔计数。
Western印迹人血清(0.15μg/泳道)在NuPage 4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移到PVDF膜上。用0.5％明胶在孵化缓冲液(5X250mM Tris；750mMNaCl；25mM EDTA；0.5％IGEPAL CA-630，pH 7.4)中封闭印迹，与单克隆抗体一同孵化，随后与HRP-共轭的兔抗小鼠IgG(DAKO Po260)孵化。用SuperSignal West Pico Chemiluminescent试剂盒(Pierce Inc.)检测印迹。
MASP-2竞争性ELISA包被缓冲液PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，8.1mMNa2HPO4，用NaOH调pH＝7.2)封闭缓冲液包含1mg/ml HSA的TBS(10mM Tris，150mM NaCl，利用HCl调pH＝7.4)洗涤缓冲液TBST+Ca(10mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.05％Tween 20，利用HCl调pH＝7.4)ELISA平板的包被在包被缓冲液[PBS，pH 7.2]中将MASP-2抗原稀释到1μg/ml。向微量滴定板的每个加样孔添加100μl MASP-2包被溶液。平板在室温下孵化1小时。清空微量滴定板，用封闭缓冲液填满平板的加样孔，在室温下孵化1小时。清空微量滴定板，用洗涤缓冲液填满每个加样孔。清空微量滴定板。重复三次。用洗涤缓冲液填满加样孔，保存在4℃。
用洗涤缓冲液适当地稀释鼠抗体(最终0.2和1.0μg/ml)。在洗涤缓冲液中稀释生物素化的NimoAb101(最终0.2μg/ml)。向MASP-2包被的平板添加稀释的鼠抗体(100μl/加样孔)。平板在室温下孵化1小时。清空微量滴定板。
通过用洗涤缓冲液完全填满加样孔并清空来洗涤微量滴定板。该步骤重复两次以总共三次洗涤。
以0.1mg/L的浓度将铕标记的链霉抗生物素蛋白(Wallac，Turku，Finland)添加到上述洗涤缓冲液中，不同之处在于不添加钙并包括50μMEDTA。加样孔在室温下孵化1小时。清空微量滴定板，用洗涤缓冲液洗涤加样孔三次。加样孔通过添加100μL Delfia增强溶液(Perkin Elmer Wallac，Norton，USA)显影，在定轨摇床上室温下孵化5分钟。在Wallac Victor 2dMulti计数器1420(Wallac，Turku，Finland)上对加样孔计数。
结果表1指出了如上述鉴定的生产抑制性抗体的四个杂交瘤。
表1
新抗体的效力将四个描述的杂交瘤克隆转换到无血清生长，通过MEP HyperCel提纯从培养物上清液中纯化抗体。如上述通过C4-沉积作用分析确定在完全人血清中抑制凝集素途径的能力。结果在附图5中显示。
从该数据可以断定，在抑制MASP-2活性方面，该抗体(035)比NimoAb101至少更有效3.9倍，而抗体(029)至少更有效30倍。对照抗体(002)是在筛选最有可能与MASP-2的N-末端结合的抗体过程中获得的非抑制性抗体。抗体(046)和(048)也能抑制，但比NimoAb101的效力要低。
表位作图Western印迹进行Westerns以区别抗体对N-末端A链(二聚作用和MBL结合部分)或对C-末端B链(MASP-2的丝氨酸蛋白酶部分)的结合。在还原SDS-PAGE上电泳人血清，用四种抗体分离物进行免疫检测。全长未活化的MASP-2将展现出74kDa的带，A链和B链分别展现出47kDa和27kDa的带。附图6显示利用不同的鼠抗体在人血清中对MASP-2的Western印迹的结果。
从印迹可以断定，所有四个抗体都识别27kDa带(B链)，而A链(47kDa)不能被检出。因而所有四种抗体都识别B链上的线性表位。
竞争性ELISA为了阐明这些抗体是否与大鼠抗体NimoAb101共用相同的表位，我们进行了竞争性ELISA。利用生物素化的NimoAb101与两种不同浓度(0.2和1.0μg/ml)的小鼠抗体竞争，ELSA针对重组His-标记的MASP-2。
结果在附图7中显示。抗体与NimoAb101竞争越多，EU3+信号越低。从而可以断定，抗体029(NimoAb108)和035(NimoAb104)很好地与NimoAb101抗体竞争，因而它们肯定共用了表位的至少一部分。
实施例6鉴别和克隆在以ECACC保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞中表达的抗体NimoAb101的VH和VL区域。
抗体的特异性存在于重链和轻链的可变域中的互补决定区(CDR)。为了表征单克隆抗体Nimoab101，克隆了VH和VL结构域可变区。
使用的缩写
VH＝Ig的重链可变区；VL＝Ig的轻链可变区CDR＝互补决定区；CDR1、CDR2和CDR3＝三个位于VH或VL的区域，从氨基末端数起。
FR＝构架区；FR3＝在VH或VL上的第三个构架区，从氨基末端数起scFv＝单链Fv片段；cDNA(互补DNA)＝在碱基序列上与RNA链互补的单链DNA分子5′RACE＝cDNA5′端的快速扩增材料和方法总RNA和mRNA的分离将以ECAAC号03050904保藏的细胞系的杂交瘤细胞分配到4个试管中。使细胞沉淀，移除上清液。
将两个试管在-80℃冷冻。
将两个试管用于利用GenEluteTM哺乳动物总RNA试剂盒RTN70提纯RNA。分光光度测定RNA浓度。也利用使用NucleoSpinRNA II试剂盒目录号740955.20Macherey-Nagel的总RNA提纯法来提纯总RNA。分光光度测定产物。
用NucleoTrapmRNA试剂盒目录号740655Macherey-Nagel从总RNA中分离Poly(A)RNA。
纯化的mRNA在H2O(无RNase)中洗提，立即保藏在-80℃。
cDNA的构建5’RACE利用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)根据厂家的说明进行cDNA末端的5′快速扩增(RACE)。GRT被用于逆转录(RT)，用G3进行扩增。
在该方法中使用的基因特异性引物是
质粒构建PCR片段的克隆亲本质粒pCR2.1-TOPO(In Vitrogen TOPO TA克隆试剂盒)利用Topo反应将纯化的PCR片段克隆到载体中。
序列分析利用标准测序引物M13F和M13R，按两种方向，对来自VL的四个重组克隆的质粒袖珍制备物、和来自VH的六个重组克隆的质粒袖珍制备物的DNA进行插入物测序。利用VNTI重叠群表达，将来自每个质粒的两个各自的序列装配到重叠群中。将重叠群共有序列的可信部分输入到NTI DNA数据库文件中。
鉴定和翻译有关的IgG开放阅读框。
序列比对和blast检索计算机分析利用重叠群序列组件用来自Informax Inc.的VectorNTI进行序列分析。
利用NCBI主页(http://www.ncbi.nlm.nib.gov)和欧洲生物信息学研究所(EBI)(http://www.ebi.ac.uk/Tools/homology.html)进行BLAST检索。
蛋白质比对利用ALIGN组件用来自Informax Inc.的VectorNTI软件包进行所有的比对。用CLUSTALW和GeneDoc进行IgG VL和VH蛋白的多重比对和编辑。
结果和讨论抗体Nimoab101是针对人MASP-2的CCP1-CCP2-SP亚基产生的。利用从文献(1)修改的与恒定区CHl和CL杂交的引物，和与衔接子杂交的引物，其中衔接子已掺入到cDNA基因的5′末端，通过对杂交瘤mRNA的PCR，我们扩增了Fab片段的基因。纯化的VL和VH PCR产物被克隆入pCR2.1-TOPO载体，用M13F和M13R引物测序。所有的VH序列和所有的VL序列都是相同的。序列在附图8到10中显示。
Kabat CRD定义轻链CDR1残基24-34CDR2残基50-56CDR3残基89-97
重链CDR1残基31-35CDR2残基50-65CDR3残基95-102将序列与以公开的抗体可变区数据对比表明，NimoAb101VL基因包含编码19个氨基酸残基的前导肽的57个核苷酸的前导序列，而NimoAb101VH基因具有60个碱基长度的前导序列，编码20个残基的前导肽。
轻链是(大鼠-小鼠-人)κ链亚型的典型成员，而重链与数据库中的其他重链不同。其在CDR H3(残基100以后，Kabat编号方式)中有6个氨基酸的插入。
参考文献1)Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains，发表于the Spinger Verlag Laboratory Manual on Antibody Engineering，编辑StefanDuebel和Roland Kontermann生物保藏以下生物材料已经被保藏在布达佩斯条约认可的保藏机构。
能产生针对MASP-2、可抑制MASP-2活性的抗体的杂交瘤细胞系，已经以保藏号03050904保藏在欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)，Salisbury，Wiltshire SP4OJG，United Kingdom。该细胞系是来自大鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合物的杂交瘤细胞系。这个杂交瘤细胞系生产单克隆抗体，在此称为NimoAb101或NimoAb101N128-71B。细胞于2003年5月9日保藏。
称为M0545YM035S2(在此也称M0545YM035)的杂交瘤细胞系已经被保藏在德国微生物和细胞培养物保藏所(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany。该细胞系是来自大鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合物的杂交瘤细胞系。鉴定参考是N162-91A-01到12。该杂交瘤细胞系生产单克隆抗体，在此被称为NimoAb104或“035”或Ab035。细胞于2004年5月6日保藏。
称为M0545YM029S2(在此也称M0545YM029)的杂交瘤细胞系已经被保藏在德国微生物和细胞培养物保藏所(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany。该细胞系是来自鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合物的杂交瘤细胞系。鉴定参考是N162-90C-01到12。该杂交瘤细胞系生产单克隆抗体，在此被称为NimoAb108或“029”或Ab029。细胞于2004年5月6日保藏。
称为M0545YM046S2(在此也称M0545YM046)的杂交瘤细胞系已经被保藏在德国微生物和细胞培养物保藏所(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany。该细胞系是来自鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合物的杂交瘤细胞系。鉴定参考是N162-90D-01到12。该杂交瘤细胞系生产单克隆抗体，在此被称为NimoAb109或“046”或Ab046。细胞于2004年5月6日保藏。
称为M0545YM048S2(在此也称M0545YM048)的杂交瘤细胞系已经被保藏在德国微生物和细胞培养物保藏所(DSMZ)，MascheroderWeg 1b，D-38124Braunschweig，Germany。该细胞系是来自鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合物的杂交瘤细胞系。鉴定参考是N162-90E-01到12。该杂交瘤细胞系生产单克隆抗体，在此被称为NimoAb110或“048”或Ab048。细胞于2004年5月6日保藏。
参考文献Hemmila，I.，Dakubu，S.，Mukkala，V.M.，Siitari，H.and Lovgren，T.(1984)Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays.AnalBiochem 137，335-43.
Jones，P.T.，Dear，P.H.，Foote，J.，Neuberger，M.S.，Winter，G.，1986.Replacing the complementarity-determining regions in a human antibodywith those from a mouse.Nature，321，522-525Liu，H.，Jensen，L.，Hansen，S.，Petersen，S.V.，Takahashi，K.，Ezekowitz，A.B.，Hansen，F.D.，Jensenius，J.C.and Thiel，S.(2001)Characterization and quantification of mouse mannan-binding lectins(MBL-Aand MBL-C)and study of acute phase responses.ScandJ Immunol 53，489-97.
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序列表<110>内蒂穆恩公司(NatImmune A/S)<120>抗MASP-2抗体<130>P 772 PC00<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>686<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>SEQ ID 1Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr1 5 10 15Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser20 25 30Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr35 40 45Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe50 55 60Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser65 70 75 80Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp85 90 95Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser100 105 110
Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr115 120 125Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val130 135 140Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu145 150 155 160Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn165 170 175Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg180 185 190Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu195 200 205Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile210 215 220Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu225 230 235 240Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly245 250 255Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn260 265 270Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly275 280 285
Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala His Ala Cys Pro Tyr Pro Met290 295 300Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu305 310 315 320Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln325 330 335Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly340 345 350Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro355 360 365Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly370 375 380Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe385 390 395 400Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly405 410 415Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro420 425 430Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly435 440 445Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly450 455 460
Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr465 470 475 480Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp485 490 495Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala500 505 510Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly515 520 525Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile530 535 540Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser545 550 555 560Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr565 570 575Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile580 585 590Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro595 600 605Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly610 615 620Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu
625 630 635 640Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly645 650 655Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val660 665 670Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe675 680 685<210>2<211>142<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 2Met Ser Phe Ser Asn Thr Leu Val Phe Leu Leu Phe Leu Leu Lys Gly1 5 10 15Ile Leu Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Leu Val Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Asn Phe Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Ile Tyr His Ala65 70 75 80Asp Thr Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr His Ser Arg Tyr Ile Pro Tyr Leu115 120 125Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser130 135 140<210>3<211>132<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 3Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr1 5 10 15Asp Ala Ile Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Cys20 25 30Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Ala Ser Asp Asp35 40 45Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ser Pro50 55 60Gln Leu Leu Ile Phe Asp Gly Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Met Lys85 90 95Ser Leu Gln Phe Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn
100 105 110Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg115 120 125Ala Asp Ala Ala130<210>4<211>156<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 4Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met Asn Trp Ile20 25 30Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser35 40 45Gly Gly Thr Tyr Ile Tyr His Ala Asp Thr Leu Lys Gly Arg Phe Thr50 55 60Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser65 70 75 80Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr85 90 95His Ser Arg Tyr Ile Pro Tyr Leu Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro115 120 125Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr145 150 155<210>5<211>159<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 5Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Cys Ala Ser Leu Gly Glu1 5 10 15Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Ala Ser Asp Asp Ile Tyr Ser Asn Leu20 25 30Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe35 40 45Asp Gly Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Met Lys Ser Leu Gln Phe Glu65 70 75 80Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr85 90 95Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Met Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly115 120 125Ala Thr Val Val Cys Phe Val Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile Ser130 135 140Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Gln Arg Asp Gly Val Leu145 150 155<210>6<211>9<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 6Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 7Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Ile1 5<210>8<211>14<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 8Gly Pro Tyr His Ser Arg Tyr Ile Pro Tyr Leu Met Asp Ala1 5 10
<210>9<211>11<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 9Arg Ala Ser Asp Asp Ile Tyr Ser Asn Leu Ala1 5 10<210>10<211>7<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 10Asp Gly Asn Arg Leu Ala Asp1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>SEQ ID 11Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr1 5<210>12<211>26<212>DNA<213>人工的<220><221>misc_feature<223>PCR引物<400>12ctcattcctg ttgaagctct tgacga 26<210>13<211>21
<212>DNA<213>人工的<220><221>misc_feature<223>PCR引物<400>13aggcttgcaa tcacctccac a 21
PCT/RO/134表 PCT/RO/134表(1998年7月)
PCT/RO/134表(1998年7月)
PCT/RO/134表(1998年7月)
PCT/RO/134表(1998年7月)
PCT/RO/134表(1998年7月)
保藏的微生物Deposited Microbial Organisms以下条款适用在本专利申请中所涉及到的所有被保藏的微生物.
For all deposited microbial organisms mentioned in the present patentapplication the following applies.
欧洲EUROPE在欧洲专利所指定的国家中，直至该欧洲专利被授权并公开，或直至该申请被驳回、或撤回、或被视为撤回之日，被保藏的微生物样本方可仅以发放样本给专家的方式，所述专家由样本要求人委任，并得到i)申请人和/或ii)欧洲专利局许可(无论何种情况适用)。(欧洲专利公约实施细则第28条第4款)In respect to those designations in which a European Patent is sought asample of the deposited microorganism will be made available until thepublication of the mention of the grant of the European patent or until the dateon which application has been refused or withdrawn or is deemed to bewithdrawn，only by the issue of such a sample to an expert nominated by theperson requesting the sample，and approved either i)by the Applicant and/or ii)by the European Patent Office，whichever applies.(Rule 28(4)EPC).
加拿大CANADA申请人要求直至一申请被授予加拿大专利，或直至该申请被驳回、或放弃并不再恢复、或撤回之日，加拿大专利委员方可批准将本申请所涉及的被保藏的生物材料的样本提供给由专利委员委任的一位独立专家。申请人必须于为国际申请公开所做的技术准备结束之前以书面声明的形式通知国际局。
The applicant requests that，until either a Canadian patent has been issued onthe basis of an application or the application has been refused，or isabandoned and no longer subject to reinstatement，or is withdrawn，theCommissioner of Patents only authorizes the furnishing of a sample of thedeposited biological material referred to in the application to an independentexpert nominated by the Commissioner，the applicant must，by a writtenstatement，inform the lnternational Bureau accordingly before completton oftechnical preparations for publication of the international application.
挪威NORWAY申请人在此要求直至一申请公开予公众查阅(通过挪威专利局)，或直至挪威专利局在未经公开予公众查阅的情况下作出最终决定，对本领域专家提供样本的行为才能生效。申请人必须最迟于该申请根据《挪威专利法》第22节和33节(3)款的规定被公开之时，向挪威专利局提交该生效请求。如果申请人已经提交了该请求，任何由第三方作出的索要样本的请求必须指明所要使用的专家。该专家可以是被列在由挪威专利局拟定的公认专家的名单之上的任何人，也可为在个案中得到申请人认可的任何人。
The applicant hereby requests that，until the application has been laid open topublic inspection(by the Norwegian Patent Office)，or has been finally decidedupon by the Norwegian Patent Office without having been laid open inspection，the furnishing of a sample shallon ly be effected to an expert in the art.Therequest to this effect shall be filed by the applicant with the Norwegian PatentOffice not later than at the time when the ap plication is made available to thepublic under Sections 22and 33(3)of the Norwegian Patents Act.If such arequest has been filed by the applicant，any request made by a third party forthe furnishing of a sample shall indicate the‘expert to be used.That expertmay be any person entered on the list of recognized experts drawn up by theNorwegian Patent Office or any person approved by the applicant in theindividual case.
澳大利亚AUSTRALIA申请人在此做出通告只有在申请被授予专利权之前，或者在申请失效、被驳回或撤回之前，提供微生物样本给与本发明无利益关系的本领域技术人员的行为才能生效(澳大利亚专利法实施细则3.25(3)款)。
The applicant hereby gives notice that the furnishing of a samp le of amicroorganism shal only be effected prior to the grant of a patent，or prior tothe lapsing，refusal or withdrawal of the application，to a person who is a skilledaddressee without an interest in the invention(Regulation 3.25(3)of theAustralian Patents Regulations).
芬兰FINLAND申请人在此要求直至一申请公开予公众查阅(通过芬兰国家专利与注册委员会)，或直至芬兰国家专利与注册委员会在未经公开予公众查阅的情况下作出最终决定，对本领域技术人员提供样本的行为才能生效。
The applicant hereby requests that，until the application has been laid open topublic inspection(by the National Board of Patents and Registration)，or hasbeen finally decided upon by the National Board of Patents and Registrationwithout having been laid open to public inspection，the furnishing of a sampleshall only be effected to an expert in the art.
英国UNITED KINGDOM申请人在此要求仅对专家提供微生物样本。申请人必须于该申请国际公开的技术准备结束之前向国际局提交该生效请求。
The applicant hereby requests that the furnishing of a sample of amicroorganism shall only be made available to an expert.The request to thiseffect must be filed by the applicant with the lntemational Bureau before thecompletion of the technical preparations for the international publication of theapplication.
丹麦DENMARK申请人在此要求直至一申请公开予公众查阅(通过丹麦专利局)，或直至丹麦专利局在未经公开予公众查阅的情况下作出最终决定，对本领域专家提供样本的行为才能生效。申请人必须最迟于该申请根据《丹麦专利法》第22节33(3)款的规定被公开之时，向丹麦专利局提交该生效请求。如果申请人已经提交了该请求，任何由第三方作出的索要样本的请求必须指明所要使用的专家。该专家可以是被列在由丹麦专利局拟定的公认专家的名单之上的任何人，也可为在个案中得到申请人认可的任何人。
The applicant hereby requests that，until the application has been laid open topublic inspection(by the Danish Patent Office)，or has been finally decidedupon by the Danish Patent office without having been laid open to publicinspection，the furnishing of a sample shall only be effected to an expert in theart.The request to this effect shall be filed by the applicant with the DanishPatent Office not later that at the time when the application is made availableto the public u nder Sections 22and 33(3)of the Danish Patents Act.If such arequest has been filed by the applicant，any request made by a third party forthe furnishing of a sample shall indicate the expert to be used.That expert maybe any person entered on a list of recognized experts drawn up by the DanishPatent Office or any person by the applicant in the individual case.
瑞典SWEDEN申请人在此要求直至一申请公开予公众查阅(通过瑞典专利局)，或直至瑞典专利局在未经公开予公众查阅的情况下作出最终决定，对本领域专业人员提供样本的行为才能生效。申请人必须在从优先权日起16个月期限届满前向国际局提交该生效请求(最好列在由PCT申请人指南第I册附件Z生成的PCT/RO/134表中)。如果申请人已经提交了该请求，任何由第三方作出的索要样本的请求必须指明所要使用的专家。该专家可以是被列在由瑞典专利局拟定的公认专家的名单之上的任何人，也可为在个案中得到申请人认可的任何人。
The applicant hereby requests that，until the application has been laid open topublic inspection(by the Swedish Patent Office)，or has been finally decidedupon by the Swedish Patent Office without having been laid open to publicinspection，the furnishing of a sample shall only be effected to an export in theart.The request to this effect shall be filed by the applicant with theInternational Bureau before the expiration of 16months from the priority date(preferably on the Form PCT/RO/134reproduced in annex Z of Volume l of thePCT Applicant’s Guide).If such a request has been filed by the applicant anyrequest made by a third party for the furnishing of a sample shall indicate theexpert to be used.That expert may be any person entered on a list ofrecognized experts drawn up by the Swedish Patent Office or any personapproved by an applicant in the individual case.
荷兰NETHERLANDS申请人要求直至一荷兰专利的授权公告被公开，或直至该申请被驳回、或撤回、或失效之日，微生物仅可以通过以发放样本的方式根据《荷兰专利法规》第3IF(1)款的规定由专家获得。申请人必须于该申请根据《荷兰专利法》第22C节或第25节的规定被公开之前，向荷兰工业产权局提交该生效请求，以这两个日期中较早的一日期为准。
The applicant hereby requests that until the date of a grant of a Netherlandspatent or until the date on which the application is refused or withdrawn orlapsed，the microorganism shall be made available as provided in the 3IF(1)ofthe Patent Rules only by the issue of a sample to an expert.The request to thiseffect must be furnished by the applicant with the Netherlands lndust rialProperty Office before the date on which the application is made available tothe public under Section 22C or Section 25of the Patents Act of the Kingdomof the Netherlands，whichever of the two dates occurs earlier.
权利要求
1.特异性地识别和结合MASP-2的C-末端部分中的表位的抗体或其功能等同物，其中所述抗体或其功能等同物特异性地识别表位的至少一部分，所述表位被选自下述的一个或多个参照抗体识别vi 以保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；vii 命名为M0545YM029的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；viii 命名为M0545YM035的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；ix 命名为M0545YM046的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；或x命名为M0545YM048的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
2.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体是鼠单克隆抗体。
4.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体已经被人源化。
5.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体是人单克隆抗体。
6.根据权利要求1的抗体，其中所述功能等同物是抗体的结合片段。
7.根据权利要求6的抗体，其中所述片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv片段。
8.根据权利要求1的抗体，其中所述功能等同物是单链抗体。
9.根据权利要求1的抗体，其中所述功能等同物是模拟抗体的小分子模拟物。
10.根据权利要求1的抗体，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。
11.根据权利要求1的抗体，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由丝氨酸蛋白酶结构域组成。
12.根据权利要求1的抗体，其中MASP-2是如SEQ ID 1所确定的人MASP-2。
13.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸363到686组成。(＝CCP2，丝氨酸蛋白酶)
14.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体特异性地识别和结合MASP-2片段中的表位，所述MASP-2片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸445到686组成。(＝丝氨酸蛋白酶)
15.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体能抑制C4沉积作用。
16.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体能在全血清中抑制C4沉积作用。
17.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体能在全血清中抑制C4沉积作用，达到比对照C4沉积作用的20％还要低。
18.根据权利要求15到17的任何一个的抗体，其中所述抗体能在全血清中抑制C4沉积作用，所述全血清来自具有C4解沉积活性的个体。
19.根据权利要求18的抗体，其中所述抗体以浓度范围1μg/ml到500μg/ml存在。
20.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含或由与SEQ ID 4有至少90％同源性的序列组成。
21.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含或由与SEQ ID 5有至少90％同源性的序列组成。
22.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含或由与SEQ ID 4有至少90％同源性的序列组成，所述轻链可变区包含或由与SEQ ID 5有至少90％同源性的序列组成。
23.包含重链可变区的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含或由与SEQ ID 4有至少90％同源性的序列组成。
24.包含轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区包含或由与SEQ ID 5有至少90％同源性的序列组成。
25.包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含或由与SEQ ID 4有至少90％同源性的序列组成，所述轻链可变区包含或由与SEQID 5有至少90％同源性的序列组成。
26.包含一个或多个选自以下的CDR的抗体或其抗原结合片段1)SEQ ID 6的重链的CDR1；2)SEQ ID 7的重链的CDR2；3)SEQ ID 8的重链的CDR3；4)SEQ ID 9的轻链的CDR1；5)SEQ ID 10的轻链的CDR2；或6)SEQ ID 11的轻链的CDR3。
27.生产特异性识别和结合MASP-2的C-末端部分中的表位的抗体或其功能同源物的方法，包括向哺乳动物施用MASP-2的C-末端部分或其片段或其功能同源物的步骤。
28.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由EGF、CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。
29.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由CUB2、CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。
30.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或其片段包含或由CCP1、CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。
31.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或其片段包含或由CCP2和丝氨酸蛋白酶结构域组成。
32.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或片段包含或由丝氨酸蛋白酶结构域组成。
33.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由SEQ ID 1的氨基酸136到686组成。(＝EGF、CUB2、CCP1、CCP2、丝氨酸蛋白酶)
34.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分包含或由SEQ ID 1的氨基酸183到686组成。(＝CUB2、CCP1、CCP2、丝氨酸蛋白酶)
35.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸293到686组成。(＝CCP1、CCP2、丝氨酸蛋白酶)。
36.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸363到686组成。(＝CCP2，丝氨酸蛋白酶)
37.根据权利要求27的方法，其中所述MASP-2的C-末端部分或片段包含或由SEQ ID 1的氨基酸445到686组成。(＝丝氨酸蛋白酶)。
38.根据权利要求27的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物。
39.根据权利要求27的方法，其中所述方法进一步包括从所述哺乳动物分离抗体生产细胞，从所述抗体生产细胞制备杂交瘤细胞，培养所述杂交瘤，和分离所述杂交瘤生产的抗体。
40.根据权利要求27到39的任何一个的方法，其中所述表位是可被选自以下的一个或多个参考抗体识别的表位i以保藏号03050904保藏的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；ii 命名为M0545YM029的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；iii 命名为M0545YM035的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；iv 命名为M0545YM046的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体；或v命名为M0545YM048的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
41.根据权利要求40的方法，其中所述方法进一步包括鉴定和选择识别所述表位的抗体。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法进一步包括通过进行以下步骤选择识别所述表位的测试抗体1)提供包含可被所述参考抗体识别的表位的MASP-2或其片段；和2)向所述MASP-2中添加测试抗体和所述参考抗体，其中测试抗体或参考抗体用可检测的标记物标记，或两种抗体都用不同的可检测标记物标记；和3)检测MASP-2上可检测标记物的存在4)从而检测测试抗体是否能替换参考抗体5)选择能替换参考抗体的测试抗体。
43.根据权利要求27到42的任何一个的方法，其中所述方法进一步包括测试所述抗体是否能抑制C4沉积作用，和选择的抗体是否能抑制C4沉积作用。
44.根据权利要求27到42的任何一个的方法，其中所述方法进一步包括测试所述抗体是否能在全血清中抑制C4沉积作用，和选择的抗体是否能在全血清中抑制C4沉积作用。
45.根据权利要求27到44的任何一个的方法生产的抗体。
46.抑制MASP-2的活性的方法，包含步骤1)提供包含MASP-2的组合物；2)提供根据权利要求1到25和44中任何一个的抗体；3)将所述组合物与所述抗体一同孵化，从而抑制MASP-2活性。
47.根据权利要求46的方法，其中所述组合物是血清。
48.一种药物组合物，包含根据权利要求1到26和45中任何一个的抗体或其功能等同物和药学上可接受的赋形剂。
49.用于医治临床状况的药物，包含作为活性成分的根据权利要求1到26和45中任何一个的抗体或其功能等同物。
50.根据权利要求49的药物，其中所述临床状况是缺血性/再灌注性损伤。
51.医治临床状况的方法，包含向需医治的个体施用治疗有效剂量的、根据权利要求1到26和45中任何一个的抗体或其功能等同物。
52.根据权利要求51的医治方法，其中所述临床状况是慢性炎症性疾病。
53.根据权利要求51的医治方法，其中所述临床状况是自体免疫炎症状况。
54.根据权利要求51的医治方法，其中所述临床状况是以由于程序性细胞死亡导致的大块细胞丧失为特征的临床状况。
55.根据权利要求51的医治方法，其中所述临床状况是缺血性/再灌注性损伤。
56.根据权利要求55的方法，其中所述损伤是PTCA(经皮腔内冠状动脉成形术)或CABG(冠状动脉旁路移植术)的结果。
57.根据权利要求55的医治方法，其中所述损伤是急性心肌梗塞或脑缺血的结果。
58.根据权利要求51的医治方法，其中所述临床状况选自类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。
59.根据权利要求1到26和45中任何一个的抗体或其功能等同物的用途，用于制备用于医治需医治个体中的临床状况的药物。
60.根据权利要求59的用途，其中所述临床状况是缺血性/再灌注性损伤。
61.根据权利要求60的用途，其中所述损伤是PTCA(经皮腔内冠状动脉成形术)或CABG(冠状动脉旁路移植术)的结果。
62.根据权利要求60的用途，其中所述损伤是急性心肌梗塞或脑缺血的结果。
63.根据权利要求59的用途，其中所述临床状况选自类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。
全文摘要
本发明涉及抗MASP－2抗体和其功能等同物。特别地，本发明涉及能抑制MASP－2的功能的MASP－2抗体。本发明还公开了MASP－2表位，其中识别所述表位的抗体对于抑制MASP－2活性是特别有用的。本发明还涉及生产所述抗体的方法，抑制MASP－2活性的方法，以及包含该MASP－2抗体的药物组合物。
文档编号A61P37/06GK1798769SQ200480015520
公开日2006年7月5日 申请日期2004年5月12日 优先权日2003年5月12日
发明者弗莱明·拉森, 乌拉·沃勒斯 申请人:内蒂穆恩公司