] 即，可以使用所需抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方 法进行免疫，利用通常的细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的母细胞融合，通过通常的 筛选法筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤），从而制作。
[0074]抗原的制备可以根据例如使用了动物细胞的方法（日本特表2007-530068)和/或 使用了杆状病毒的方法(例如，国际公开第W098/46777号等）等来进行。当抗原的免疫原性 低时，可以使其与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合而进行免疫。抗原也可以与佐剂 一起施与而进行免疫。
[0075] 本发明的抗体进一步还可以作为将其抗体基因由杂交瘤克隆化，整合到适当的载 体中，并将其导入宿主，使用基因重组技术而产生的基因重组型抗体而得到（参照例如 Car1, A.K.Borrebaeck, James,ff.Larrick,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES , Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。具体来说，由 杂交瘤的mRNA使用逆转录酶来合成抗体的可变区（V区）的cDNA。如果可得到编码目的抗体 的V区的DNA，则将其与编码所希望的抗体恒定区（C区）的DNA连接，将连接产物整合到表达 载体中。或者也可以将编码抗体的V区的DNA整合到包含抗体C区的DNA的表达载体中。上述 DNA以在表达控制区域、例如增强子、启动子的控制下表达的方式整合到表达载体中。接着 可以用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。
[0076] 本发明的抗CAPRIN-1抗体的特征是优选为单克隆抗体，单克隆抗体包含人单克隆 抗体、非人动物单克隆抗体(例如小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、鸡单克 隆抗体等）、嵌合单克隆抗体等。单克隆抗体可以通过培养杂交瘤来制作，所述杂交瘤通过 将来自用CAPRIN-1蛋白质或其片段免疫的非人哺乳动物（例如小鼠、产生人抗体的小鼠、 鸡、兔等)的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合而得到。嵌合抗体是将来源于不同动物的序列组合 而制作的抗体，例如是包含小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区 的抗体等。嵌合抗体的制作可以使用公知的方法来进行，例如可以通过将编码抗体V区的 DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其整合到表达载体中并导入宿主，而使其产生，从而得 到。
[0077] 此外，在后述实施例中，制作了多种人源化单克隆抗体和人-兔嵌合单克隆抗体， 确认了强抗肿瘤效果。这些单克隆抗体均在重链可变区（VH区域)包含序列号1的氨基酸序 列所示的CDR1、序列号2的氨基酸序列所示的CDR2和序列号3的氨基酸序列所示的CDR3,在 轻链可变区(VL区域)包含序列号4的氨基酸序列所示的CDR1、序列号5的氨基酸序列所示的 CDR2和序列号6的氨基酸序列所示的CDR3。这些单克隆抗体分别包括:包含具有序列号7的 氨基酸序列的VH区域和具有序列号11的氨基酸序列的VL区域的人源化抗体#0、包含具有序 列号8的氨基酸序列的VH区域和具有序列号11的氨基酸序列的VL区域的人源化抗体#1、包 含具有序列号8的氨基酸序列的VH区域和具有序列号12的氨基酸序列的VL区域的人源化抗 体#2、包含具有序列号8的氨基酸序列的VH区域和具有序列号13的氨基酸序列的VL区域的 人源化抗体#3、包含具有序列号7的氨基酸序列的VH区域和具有序列号12的氨基酸序列的 VL区域的人源化抗体#4、包含具有序列号7的氨基酸序列的VH区域和具有序列号13的氨基 酸序列的VL区域的人源化抗体#5、包含具有序列号7的氨基酸序列的VH区域和具有序列号 15的氨基酸序列的VL区域的人源化抗体#6、包含具有序列号8的氨基酸序列的VH区域和具 有序列号15的氨基酸序列的VL区域的人源化抗体#7、包含具有序列号9的氨基酸序列的VH 区域和具有序列号15的氨基酸序列的VL区域的人源化抗体#8、包含具有序列号10的氨基酸 序列的VH区域和具有序列号14的氨基酸序列的VL区域的人源化抗体#9、包含具有序列号10 的氨基酸序列的VH区域和具有序列号15的氨基酸序列的VL区域的人源化抗体#10、以及包 含具有序列号20的氨基酸序列的VH区域和具有序列号21的氨基酸序列的VL区域的人-兔嵌 合抗体。
[0078]人源化抗体是也称为重构(reshaped)人抗体的改变抗体。人源化抗体通过将来源 于免疫动物的抗体的互补决定区移植到人抗体的互补性决定区中来构建。其一般的基因重 组方法也是已知的。
[0079] 具体来说，通过PCR法，由以末端部具有重叠部分的方式制作的数个寡核苷酸，合 成以将例如小鼠抗体、兔抗体和/或鸡抗体的互补决定区与人抗体的框架区连接的方式设 计的DNA序列。将所得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，接着整合到表达载体中，将其 导入宿主而使其产生，从而得到人源化抗体(参照欧洲专利申请公开第EP239400号、国际公 开第W096/02576号）。介由互补决定区连接的人抗体的人抗体的框架区可以选择使互补性 决定区形成良好的抗原结合部位的框架区。根据需要，也可以替换抗体的可变区中的框架 区的氨基酸，以使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合部位(Sato K.et al.， Cancer Research 1993,53:851_856)。另外，也可以替换为来源于各种人抗体的框架区（参 照国际公开第W099/51743号）。
[0080] 在制作嵌合抗体或人源化抗体时，可以将可变区（例如，FR)和/或恒定区中的氨基 酸用其他氨基酸替换等。
[0081] 氨基酸的替换是1个或多个、例如小于15个、小于10个、8个以下、7个以下、6个以 下、5个以下、4个以下、3个以下、或2个以下的氨基酸、优选1~9氨基酸的替换，替换抗体应 与未替换抗体在功能上等同。
[0082] 这里，"在功能上等同"是指成为对象的抗体与本发明的抗体具有同样的生物学或 生物化学活性，具体来说，是指具有毒害肿瘤的功能、以及在对人应用时本质上不发生排斥 反应等。作为这样的活性，可以列举例如细胞增殖抑制活性、或结合活性。
[0083] 作为用于制备与某多肽在功能上等同的多肽的本领域技术人员熟知的方法，已知 在多肽中导入突变而进行氨基酸替换的方法。例如只要是本领域技术人员，就能够使用定 点诱变法（1^811；[11101:0-601:011，1'.6七31.，（1995)66116 152,271-275、201161'，]\〇.，已11(1 Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100 ,468-500、Kramer，W.et al.，（1984)Nucleic Acids Res·12，9441-9456、Kramer，W.and Fritz，HJ.，（1987)Methods Enzymol·154，350-367、 Kunkel，TA.，（1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82,488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol .85,2763-2766)等，在本发明的抗体中导入适当氨基酸替换，由此制备与该抗体在 功能上等同的抗体。
[0084] 在导入氨基酸替换时，期望替换是保守的氨基酸替换。保守的氨基酸替换是电荷、 侧链、极性、芳香族性等性质类似的氨基酸之间的替换。性质类似的氨基酸例如可以分类为 碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸）、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸）、无电荷极性氨基酸 (甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸）、无极性氨基酸(亮氨酸、 异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸）、支链氨基酸(亮氨酸、缬氨 酸、异亮氨酸）、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。
[0085]作为抗体修饰物，可以列举例如与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。在本发 明的抗体修饰物中，不限定所结合的物质。为了得到这样的抗体修饰物，可以通过对所得的 抗体实施化学修饰来得到。这些方法在本领域已经被确立。
[0086]识别CAPRIN-1蛋白质或其包含的CAPRIN-1片段多肽的抗体，可以利用本领域技术 人员公知的方法得到。例如，可以通过下述方法等来得到:通过通常的方法(例如表位作图 (epitope mapping)、后述的表位鉴定的方法等)确定由抗CAPRIN-1抗体所识别的CAPRIN-1 蛋白质的表位，以具有该表位中所含的氨基酸序列的多肽为免疫原来制作抗体的方法;确 定通过通常的方法制作的抗体的表位，选择表位与抗CAPRIN-1抗体相同的抗体的方法等。 [0087]本发明的抗体是与CAPRIN-1具有免疫反应性的抗体、特异性地识别CAPRIN-1的抗 体、或者与CAPRIN-1特异性地结合的抗体，并且是显示对癌的细胞毒活性、或肿瘤增殖抑制 作用的抗体。该抗体优选是具有能够在施与该抗体的对象动物中几乎避免或完全避免产生 排斥反应那样的结构的抗体。作为这样的抗体，例如在对象动物为人时，可以列举人抗体、 人源化抗体、嵌合抗体(例如、人-兔嵌合抗体）、单链抗体、双特异性抗体等。这些抗体是作 为重链和轻链的可变区来源于人抗体的抗体;重链和轻链的可变区包含来源于非人动物抗 体的互补性决定区（CDRUCDR2和CDR3)和来源于人抗体的框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)的抗 体;或重链和轻链的可变区来源于非人动物抗体、且重链和轻链的恒定区来源于人抗体的 抗体的重组型抗体。优选的抗体是前2种抗体。
[0088] 这些重组型抗体可以如下制作。由杂交瘤等产生抗体的细胞克隆化编码针对人 CAPRIN-1的单克隆抗体(例如，人单克隆抗体、小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆 抗体、鸡单克隆抗体等）的DNA，将其作为模板利用RT-PCR法等来制作编码该抗体的轻链可 变区和重链可变区的DNA，例如，可以基于Kabat EU numbering system(Kabat等、 Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service, National Institute of Health，Bethesda，Md. (1991))来确定轻链和重链的各可变区的 序列、或各CDR1、CDR2、CDR3的序列、或各?1?1、？1?2、？1?、？1?4的序列。
[0089] 进一步地，使用基因重组技术（Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press( 1989))或DNA合成仪来制作编码这些各 可变区的DNA或编码各互补决定区的DNA。其中，产生上述人单克隆抗体的杂交瘤可以通过 在对产生人抗体的动物(例如，小鼠）免疫人CAPRIN-1后，使从该免疫动物切除的脾细胞与 骨髓瘤细胞融合来制作。与此分别地，根据需要使用基因重组技术或DNA合成仪来制作编码 来源于人抗体的轻链或重链的可变区和恒定区的DNA。
[0090] 在人源化抗体的情况下，通过将编码来源于人抗体的轻链或重链的可变区的DNA 中的CDR编码序列替换成与它们对应的来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡等） 的抗体的CDR编码序列，能够制作编码人源化抗体的DNA。例如，在将来源于人抗体的CDR编 码序列替换成了来源于小鼠抗体的CDR编码序列的人源化抗体的情况下，可变区从N末端侧 开始由人FR1、小鼠 CDR1、人FR2、小鼠 CDR2、人FR3、小鼠 CDR3和人FR4依次构成。
[0091] 在嵌合抗体的情况下，通过将编码来源于除人以外的动物(例如、小鼠、大鼠、兔、 鸡等）的抗体的轻链或重链的可变区的DNA分别与编码来源于人抗体的轻链或重链的恒定 区的DNA连接，能够制作编码嵌合抗体的DNA。
[0092]在单链抗体的情况下，该抗体是将重链可变区和轻链可变区通过连接物以直线状 连接而成的抗体，通过将编码重链可变区的DNA、编码连接物的DNA、和编码轻链可变区的 DNA结合，能够制作编码单链抗体的DNA。这里，重链可变区和轻链可变区都来源于人抗体， 或者来源于仅互补决定区被来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡等)的抗体的互 补决定区替换而得的人抗体。另外，连接物包含12~19个氨基酸，可以列举例如15个氨基酸 的（G4S)3(G._B.Kim等，Protein Engineering Design and Selection 2007,20(9):425-432) 〇
[0093]在双特异性抗体(例如，diabody)的情况下，该抗体是可与2个不同的表位特异性 地结合的抗体，例如通过将编码重链可变区A的DNA、编码轻链可变区B的DNA、编码重链可变 区B的DNA、和编码轻链可变区A的DNA以该顺序进行结合(其中编码轻链可变区B的DNA与编 码重链可变区B的DNA可介由编码如上所述的连接物的DNA来结合），能够制作编码双特异性 抗体的DNA。这里，重链可变区和轻链可变区都来源于人抗体，或者来源于仅互补决定区被 来源于除人以外的动物（例如小鼠、大鼠、兔、鸡等）的抗体的互补决定区替换而得的人抗 体。
[0094]可以将如上所述制作的重组DNA整合到1个或多个适当的载体中，将其导入宿主细 胞（例如，哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等），进行（共）表达，从而制作重组型抗体 (P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY^P.Shepherd and C.Dean.Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS；J.ff.Coding., Monoclonal Antibodies principles and practice·，1993 ACADEMIC PRESS)〇
[0095] 作为通过上述方法制作的本发明的抗体，可列举例如，后述的实施例中获得的含 有包含序列号1、2和3的重链可变区和包含序列号4、5和6的轻链可变区的以下的抗体(a)~ ⑴。
[0096] (a)包含序列号8的重链可变区和序列号15的轻链可变区的抗体
[0097] (b)包含序列号10的重链可变区和序列号15的轻链可变区的抗体
[0098] (c)包含序列号7的重链可变区和序列号15的轻链可变区的抗体
[0099] (d)包含序列号8的重链可变区和序列号13的轻链可变区的抗体 [0100] (e)包含序列号7的重链可变区和序列号12的轻链可变区的抗体 [0101 ] (f)包含序列号8的重链可变区和序列号12的轻链可变区的抗体 [0102] (g)包含序列号7的重链可变区和序列号13的轻链可变区的抗体 [0103 ] (h)包含序列号10的重链可变区和序列号14的轻链可变区的抗体
[0104] (i)包含序列号8的重链可变区和序列号11的轻链可变区的抗体
[0105] (j)包含序列号7的重链可变区和序列号11的轻链可变区的抗体
[0106] (k)包含序列号9的重链可变区和序列号15的轻链可变区的抗体
[0107] (1)包含序列号20的重链可变区和序列号21的轻链可变区的抗体
[0108] 这里，序列号1、2和3所示的氨基酸序列分别是兔抗体的重链可变区的⑶R1、CDR2 和⑶R3，序列号4、5和6所示的氨基酸序列分别是兔抗体的轻链可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3。
[0109] 另外，本发明的人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体是例如以下的抗 体⑴~(xiv) 0
[0110] (i)重链的可变区包含序列号1、2和3的氨基酸序列和来源于人抗体的框架区的氨 基酸序列或其替换体，以及轻链的可变区包含序列号4、5和6的氨基酸序列和来源于人抗体 的框架区的氨基酸序列或其替换体的抗体。
[0111] (ii)重链的可变区包含序列号1、2和3的氨基酸序列和来源于人抗体的框架区的 氨基酸序列或其替换体，且重链的恒定区包含来源于人抗体的氨基酸序列，以及轻链的可 变区包含序列号4、5和6的氨基酸序列和来源于人抗体的框架区的氨基酸序列或其替换体， 且轻链的恒定区包含来源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0112] (iii)重链的可变区包含序列号8的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗 体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号15的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来 源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0113] (iv)重链的可变区包含序列号10的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗 体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号15的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来 源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0114] (v)重链的可变区包含序列号7的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗体 的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号15的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来源 于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0115] (vi)重链的可变区包含序列号8的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗 体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号13的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来 源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0116] (vii)重链的可变区包含序列号7的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗 体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号12的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来 源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0117] (viii)重链的可变区包含序列号8的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人 抗体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号12的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含 来源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0118] (ix)重链的可变区包含序列号7的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗 体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号13的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来 源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0119] (X)重链的可变区包含序列号10的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗 体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号14的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来 源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0120] (xi)重链的可变区包含序列号8的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗 体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号11的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来 源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0121] (xii)重链的可变区包含序列号7的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗 体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号11的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来 源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0122] (xiii)重链的可变区包含序列号9的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人 抗体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号15的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含 来源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0123] (xiv)重链的可变区包含序列号20的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人 抗体的氨基酸序列，以及轻链的可变区包含序列号21的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含 来源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
[0124] 此外，人抗体重链和轻链的恒定区和可变区的框架区的序列例如可以由NCBI (美 国：GenBank、UniGene等）获得，例如关于人IgGl重链恒定区，可以参照注册号J00228的序 列，关于人IgG2重链恒定区，可以参照注册号J00230的序列，关于人IgG3重链恒定区，可以 参照注册号X03604的序列，关于人IgG4重链恒定区，可以参照注册号K01316的序列，关于人 轻链κ恒定区，可以参照注册号V00557、X64135、X64133等的序列，关于人轻链λ恒定区，可以 参照注册号Χ64132、Χ64134等的序列。
[0125] 上述抗体优选具有细胞毒活性，由此可以发挥抗肿瘤效果(或者抗肿瘤活性）。
[0126] 进而，上述抗体只要具有特异性地识别CAPRIN-1这样的特异性，则各抗体的互补 决定区的序列、框架区的序列和/或恒定区的序列中，可以有1个或数个氨基酸的替换、缺失 或添加。这里数个是指优选为1~9个。
[0127] 本发明的抗体对CAPRIN-1蛋白质或其片段的亲和常数如(1^/^。^)优选至少为5乂 108Μ-\至少为10 9Μ-\至少为5Χ109Μ-\至少为101QM-\至少为5X101QM-\至少为10 ηΜ-\至 少为5Χ10ηΜ-\至少为1012Μ-\或者至少为10 13Μ-\或者至少为ΙΟ1%-1。
[0128] 作为本发明的抗体所发挥的对表达CAPRI Ν-1的癌细胞的抗肿瘤效果的机制之一， 有表达CAPRIN-1的细胞的效应细胞抗体依赖的细胞毒活性(ADCC)。将本发明的抗体的重链 恒定区的氨基酸替换1个或数个，或者除去与结合于重链恒定区的N-糖苷键糖链中的N-乙 酰葡糖胺结合的岩藻糖，能够增强本发明的抗体的由ADCC产生的抗肿瘤活性。进而，通过组 合上述重链恒定区的氨基酸替换和岩藻糖除去，能够进一步增强本发明的抗体的由ADCC产 生的抗肿瘤活性。
[0129] 另外，本发明中的除去了与结合于重链恒定区的N-糖苷键糖链中的N-乙酰葡糖胺 结合的岩藻糖的抗体既可以是单独的该抗体，另外也可以是与结合了岩藻糖的抗体的组合 物。在该抗体的组合物中，优选除去了岩藻糖的抗体是主成分。
[0130] 将重链恒定区的氨基酸替换了 1个或数个的抗体，可以参照例如国际公开第 W02004/063351号、国际公开第W02011/120135号、美国专利8388955号、国际公开第W02011/ 005481号、美国专利6737056号、国际公开第W02005/063351号来制作。除去了在重链恒定区 中的N-糖苷键糖链中的N-乙酰葡糖胺上附加的岩藻糖的抗体或产生该抗体的细胞，可以参 照例如美国专利6602684号、欧州专利1914244号、美国专利7579170号来制作。除去了与结 合于重链恒定区的N-糖苷键糖链中的N-乙酰葡糖胺结合的岩藻糖的抗体和结