特异靶向多肽自组装纳米载体、载药纳米颗粒及制备方法与流程

本发明属于自组装纳米材料领域，尤其涉及一种特异靶向多肽自组装纳米载体和纳米颗粒，以及它们的制备方法。

背景技术：

自组装过程是自然界亿万年进化过程中普遍存在的一种现象。DNA合成、RNA转录和调控、以及蛋白质的合成与折叠等生化过程都是自组装的过程。此外，大量复杂的、具有生物学功能的大分子体系都是通过分子自组装形成的，就连更完整和更复杂的生命有机体也是自组装形成的产物。自组装过程的根本驱动力是分子间弱的相互作用力，主要是非共价键。这些非共价键如氢键、范德华力、静电力、疏水作用、π-π堆积作用等的协同作用把原子、离子或分子连接在一起构建超分子结构。近年来，自组装技术已经成为纳米科技的重要手段，得到了快速发展。利用自组装技术制备纳米材料具粒径可控，分散性好；纯度高，废物少；产物较稳定，不易发生团聚现象；操作仪器简单等几方面优势。在医药研究领域中，利用自组装技术可以制备识别并定向杀死肿瘤细胞的纳米材料；还可用自组装技术在细胞内放入装配单体或组件使其在细胞内构成新的纳米结构，从而发挥更大的生物医药功能。

随着纳米技术与纳米科学的迅速发展，纳米结构的成药性越来越受到人们的关注与重视，尤其体现在纳米结构的生物相容性和安全性。目前用来构建自组装纳米结构的材料主要包括有机无机杂化材料、高分子接枝共聚物、多肽、核酸分子等。人工合成的材料可以构建自组装纳米结构，但长期使用会积累潜在的毒性。由于多肽是生物体自身的材料，结构简单、种类繁多、易于改性、具有相对的稳定性，并且与核酸相比，多肽具有结构多样性的特点，是自组装形成纳米材料的理想构造单元。此外，不同的功能多肽分子可以进行模块化功能集成，构建多功能天然药物载体；与脂质体相比，具有较快的响应性；并且具有良好的环境响应特异性，因此相对于其他自组装体系，多肽自组装纳米药物体系具有更广阔的应用前景。

随着城市化、工业化、老龄化的全球加速，生态环境恶化，恶性肿瘤的发病率越来越高，成为人类健康的头号杀手。恶性肿瘤一般具有复杂的微环境，其间大量的间质细胞及一些透明质酸和胶原蛋白等严重阻止了药物运输到肿瘤部位，从而使肿瘤具有低氧、微酸、某些蛋白特意表达等特殊理化性质，因此，基于其中特意高表达的受体或蛋白酶设计出高效靶向或响应微环境的’智能药物’，有效降低化疗药物及其联合用药的毒副作用，成为一种主流思路。多肽纳米药物最为简单方便的包药策略就是利用两亲性多肽通过分子间非共价相互作用力对药物进行包载输运。既能有效延长功能肽分子在动物体内的半衰期，又能有效提高功能肽的抗肿瘤疗效另一方面；针对肿瘤微环境的生物学特征，多肽纳米药物可以实现药物的靶向输运以及在肿瘤环境中的可控释放，为多肽类药物的开发及应用拓宽了前景。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种特异靶向多肽自组装纳米载体的制备方法，采用的技术方案是：在特异性靶向于肿瘤细胞表皮生长因子受体的靶向肽的N端偶联疏水性功能分子，得到两亲性多肽；使用有机溶剂溶解所述两亲性多肽，在超声条件下，将溶有两亲性多肽的有机溶剂分散于水中，所述两亲性多肽经自组装，即得所述纳米载体。

其中，所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述靶向肽可市购获得，也可采用本领域常用的Fmoc固相合成法制备得到。

优选地，所述疏水性功能分子为C_12-18的直链脂肪酸或胆固醇，优选为C_12-18的直链脂肪酸。在靶向肽的N段偶联疏水性功能基团可增强N端的疏水性，有利于后期的多肽自组装。重要的是，与胆固醇等疏水性结构相比，直链脂肪酸更容易与多肽反应，且不容易脱离，稳定性更好。同时，C_12-18的直链脂肪酸无其他侧链基团，不会影响自组装过程。

在具体的实施方式中，所述疏水性功能分子可采用十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸等。

优选地，制备两亲性多肽的方法为：将靶向肽溶于N,N-二甲基甲酰胺中，向其中加入所述疏水性功能分子和二异丙基乙胺，于室温下反应，反应结束后，向反应体系中加入乙醚，分离出现的白色沉淀，即得。

其中，所述靶向肽与所述疏水性功能分子的摩尔比为1：(8-10)。

超声条件是影响自组装效果的一个关键因素，一般而言，超声功率越大、频率越高，自组装效果越好，得到的纳米载体粒径越均一。优选地，本发明自组装的超声条件为：在超声频率30-50kHz，功率80-120W条件下，超声8-15min。

优选地，溶解所述两亲性多肽的溶剂选自二甲基亚砜、二氯甲烷、甲醇中的一种，最优为二甲基亚砜。

本发明的第二个目的是提供采用上述任意一种制备方法得到的纳米载体。

所述纳米载体为球形结构，粒径为20-30nm。该纳米载体粒径较小，有助于肿瘤细胞内吞，并具有体内稳定性，不容易被降解。该纳米载体具有肿瘤部位特异靶向性，是一种生物安全、理想的药物载体。多肽自组装纳米材料无毒、生物兼容性好；自组装过程中不生成共价健，没有逆反应，形成高度有序的纳米结构，具有广阔的应用前景。

本发明的第三个目的是提供一种特异靶向多肽自组装纳米载药颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备两亲性多肽：取特异性靶向于肿瘤细胞表皮生长因子受体的靶向肽，使其与疏水性功能分子反应，即得；

(2)制备纳米载药颗粒：将所述两亲性多肽溶解在含有疏水性药物的有机溶剂中，得混合液；超声条件下将所述混合液分散于水中，所述两亲性多肽在自组装过程中包裹所述疏水性药物，即得。

其中，所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述靶向肽可市购获得，也可采用本领域常用的Fmoc固相合成法制备得到。本发明以肿瘤细胞表达较多的表皮生长因子受体为靶点，纳米载体可以特异结合表皮生长因子受体，通过受体介导的内吞使纳米载体进入肿瘤细胞，相较于其他的靶点，如整合素、FAP-α等，表皮生长因子受体是大部分肿瘤细胞均阳性表达的受体，以此为靶点，可提供纳米载体的普适性。

优选地，所述疏水性功能分子为C_12-18的直链脂肪酸或胆固醇，优选为C_12-18的直链脂肪酸。

在具体的实施方式中，所述疏水性功能分子可采用十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸等。最优选为十八烷酸。十八烷酸碳链长，疏水性强，自组装过程中能够作为疏水端位于纳米载体内部，在包载药物后，产物具有最佳的稳定性和较高的包载效率。

优选地，步骤(1)的具体操作为：将靶向肽溶于N,N-二甲基甲酰胺中，向其中加入所述疏水性功能分子和二异丙基乙胺，于室温下反应，反应结束后，向反应体系中加入乙醚，分离出现的白色沉淀，即得。

其中，所述靶向肽与所述疏水性功能分子的摩尔比为1：(8-10)。

优选地，步骤(2)中，所述有机溶剂选自二甲基亚砜、二氯甲烷、甲醇中的一种。其中，以二氯甲烷或甲醇为溶剂时，自组装过程中易挥发，且甲醇和二氯甲烷有较强的细胞毒性。因此，本发明最优选的溶剂为二甲基亚砜。以二甲基亚砜为溶剂时，两亲性多肽可顺利自组装包载药物，药物的包封率可达80％以上，且得到的自组装纳米颗粒粒径均一，稳定性好，并具有良好的生物相容性。

优选地，步骤(2)中，所述有机溶剂与水的体积比为1：(100-200)。

优选地，所述疏水性药物与所述两亲性多肽的摩尔比为1：(5-20)。

优选地，本发明自组装的超声条件为：在超声频率30-50kHz，功率80-120W条件下，超声8-15min。

优选地，所述制备方法还包括自组装结束后，静置反应体系，采用透析法除去未包载的疏水性药物的步骤。其中，所述透析法在水中进行。

本发明的两亲性多肽对疏水性药物具有非常好的包封率。其中，所述两亲性多肽可包载单一的疏水性药物，也可同时包载两种及以上疏水性药物，具体可依据实际应用而定。所述疏水性药物可为抗肿瘤药物，如用于胰腺癌的一线化疗药物吉西他滨和已经进入三期临床的抗BRCA突变的奥拉帕尼等。

研究发现，当所述两亲性多肽的N端偶联有C_12-18的直链脂肪酸时，保证重量比为1:1的奥拉帕尼和吉西他滨效果突出，得到的载药纳米颗粒可用于胰腺导管腺癌的治疗。

本发明的第四个目的是提供上述任意一种方法制备得到的特异靶向多肽自组装载药纳米颗粒。

所述载药纳米颗粒为球形结构，粒径均一，约为60-80nm。

本发明利用靶向肿瘤细胞的靶向肽和疏水性功能分子偶联得到两亲性多肽，通过自组装方式对抗肿瘤药物进行包载以形成纳米颗粒，该纳米颗粒在靶向于肿瘤细胞后暴露出靶向肽，靶向于肿瘤细胞，并通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞，释放药物，抑制DNA合成及修复，对肿瘤细胞进行双重杀伤，抑制肿瘤生长。本发明的两亲性多肽具有高度有序的纳米结构，为自组装纳米材料，自组装过程中不产生共价键，没有逆反应，用于肿瘤治疗具有无毒，生物兼容性好的优势。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

本发明涉及到的原料和试剂均可市购获得。

本发明取得了如下积极效果：与自由化疗药物比较，包载有疏水性药物(如抗肿瘤药物)的自组装载药纳米颗粒对肿瘤部位具有更好的选择性输运效果，并具有较高的最大耐受剂量，且副作用小，有望作为一种新型纳米药物应用于临床，具有良好的药物开发潜力。

附图说明

图1是实施例1制备得到的纳米载体在水溶液中的形貌图像；

图2是实施例1制备得到的纳米载体的粒径分布；

图3是实施例2载药后纳米颗粒的形貌图像；

图4是实施例2中得到的纳米颗粒载药后的稳定性图像；其中，左侧为载药后1h的形貌图像，右侧为载药后48h的形貌图像；

图5是实施例2载药纳米颗粒的生物学实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作。

其中，可被肿瘤部位表皮生长因子受体识别的靶向肽为本领域已知肽段，可市购获得。或者，可采用本领域公知的Fmoc固相合成法制备得到。本发明提供一种具体的制备方法，本领域技术人员可以理解，该方法并不用于限定本发明，如下制备方法中涉及到的原料可市购获得，例如购自吉尔生化(上海)有限公司、西格玛奥德里奇公司。

(1)取1.01克二氯三苯甲基氯树脂至多肽合成装置，加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺浸泡树脂半小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂N,N-二甲基甲酰胺。

(2)称取0.2克Fmoc-Gly-OH用5毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入2毫升催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温下让Fmoc-Gly-OH与树脂相互作用约1.5小时，使其充分固定在树脂上。用N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，加入甲醇搅拌30分钟，封闭树脂上未反应的活性位点，并再次用N,N-二甲基甲酰胺溶胀树脂。然后用体积比为1:4的哌啶：N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)进行保护基的脱除，反应3次，前两次各持续3分钟，第三次持续20分钟。之后再用5mL的N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤树脂5次，每次持续1分钟，直到N,N-二甲基甲酰胺洗液的pH显中性。

(3)称取0.92克Fmoc-Ile(tBu)-OH，0.72克2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯，0.27克1-羟基苯并三唑，用10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到多肽合成装置中，再加入2毫升催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温下让Fmoc-Gly(tBu)-OH与树脂相互作用约2小时，使其充分连接到上一个氨基酸上，N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，取少许树脂加入10％茚三酮的无水甲醇中加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂颜色无明显变化，则说明第二个氨基酸已完全同上一个氨基酸偶联，若树脂变蓝甚至发黑，则说明第二个氨基酸没有与前一个氨基酸完全反应，需重复连接。

(4)重复以上步骤分别缩合(Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asn-OH Fmoc-Gln(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Thr-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Gly(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(Boc)-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-His-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Gly(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH。用体积比为1:4的哌啶:N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)进行保护基的脱除之后，加入0.21g无水乙酸/4mL吡啶的混合液，反应两次、每次2小时。做完茚三酮测试，确保无水乙酸已经完全封闭了多肽的N末端，再用5mL的二氯甲烷重复洗涤树脂5次，每次持续1分钟。

(5)将多肽从树脂上裂解下来，具体过程如下：首先配制裂解液：9.5mL三氟乙酸+0.85mL1,2-乙二硫醇+0.5mL茴香硫醚+0.5mL去离子水。将树脂放入上述混合液中进行裂解反应3小时，之后过滤掉树脂，在收集到的液体中加入乙醚，立即出现白色沉淀。然后，离心分离上述悬浊液，转速为5000rpm、离心时间5分钟，除去上清液，进行冷冻干燥，收集白色多肽粉末，即得靶向肽，命名为P-1。

实施例1

一种特异靶向多肽自组装纳米载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备两亲性多肽分子：取50mg采用上述方法制备得到的靶向肽P-1，溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，向其中加入350mg十八烷酸、2毫升催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温条件下反应12小时。停止反应后将液体滴加入无水乙醚中，立即出现白色沉淀。离心(转速为5000rpm，离心时间5min)分离上述悬浊液除去上清液，对得到的产品进行冷冻干燥，收集白色粉末，即得两亲性多肽分子。

(2)制备纳米载体：室温下，将两亲性多肽分子溶解于20uL的二甲基亚砜溶液中，在超声条件下将其分散于1mL水溶液中，超声10min，取出稳定1h，即得。

实施例2

一种特异靶向多肽自组装载药纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备两亲性多肽分子：取50mg采用上述方法制备得到的靶向肽P-1，溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，向其中加入350mg十八烷酸、2毫升催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温条件下反应12小时。停止反应后将液体滴加入无水乙醚中，立即出现白色沉淀。离心(转速为5000rpm，离心时间5min)分离上述悬浊液除去上清液，对得到的产品进行冷冻干燥，收集白色粉末，即得两亲性多肽分子，命名为P-2。

(2)制备载药纳米颗粒：室温下，按药物与两亲性多肽分子的摩尔比为1:(5-20)计，将1mg两亲性多肽分子和疏水性化疗药物溶解于20uL的二甲基亚砜溶液中，在超声条件下将其分散于1mL水溶液中，超声10min，取出稳定1h，在大体积去离子水中透析2h，以除去未包载的化疗药物，即得，命名此载药纳米颗粒为NPs。

实施例3

一种特异靶向多肽自组装纳米颗粒的制备方法，该实施例的制备方法同实施例2，区别仅在于将十八烷酸替换为十二烷酸。

实施例4

一种特异靶向多肽自组装纳米颗粒的制备方法，该实施例的制备方法同实施例2，区别仅在于将十八烷酸替换为十四烷酸，且靶向肽采用市售产品。

实验例1形态观察

使用电镜观察实施例1的纳米载体，发现制备的纳米载体为大小较均一、稳定的球形结构(参考附图1)，平均粒径约为20-30nm(参考附图2)，表面电势约为-10毫伏。

采用电镜观察实施例2载药后的载药纳米颗粒，其粒径变大，平均粒径约为60-80nm(参考附图3)。

实验例2纳米颗粒稳定性

对实施例2制备得到的载药纳米颗粒的药物稳定性进行了测试，将其放置48h，然后用生物透射电镜观察其形貌，结果如图4所示，从图中可以看出：载药前后纳米颗粒的形貌几乎没有变化，证明合成的纳米颗粒稳定性良好，可用于体内实验。

实验例3包封率测定

测定方法：

(1)绘制标准工作曲线：分别称取43.6uM溶于2ml所需量的奥拉帕尼和吉西他滨，溶解于2ml二甲基亚砜中，等比稀释10个浓度，每个浓度为1mL，利用紫外分光光度计测定二甲基亚砜中奥拉帕尼和吉西他滨在紫外吸收峰值处的吸光度；绘制标准工作曲线。

(2)将实施例1的1ml纳米颗粒NPs水溶液冻干，之后溶解在1mL二甲基亚砜中，利用紫外分光光度计测定二甲基亚砜溶液中抗肿瘤药物的吸光值；

(3)将步骤(2)测得的吸光值带入标准工作曲线中，通过计算，得到奥拉帕尼和吉西他滨的包载质量；

(4)根据溶液中抗肿瘤药物的浓度计算纳米颗粒对奥拉帕尼和吉西他滨的包封率。其中，包封率＝(化疗药物的包载质量/化疗药物原始加入量)×100％。

经计算，该纳米颗粒对化疗药物的包封率可达80％。

实验例4生物学实验

实验方法为：利用BRCA突变的细胞系canpan-1，将培养状态良好的细胞接种于96孔板中，24h后分别给不同浓度的载药纳米颗粒(包载吉西他滨和奥拉帕尼)，同时以不同浓度的吉西他滨和奥拉帕尼作为对照，在37℃孵育48h，吸走带有药物的培养基，加入10％CCK-8的无血清培养基，37℃孵育2-4h，利用酶标仪检测其在450nm处的吸收，根据吸光度值作图，计算IC50。

实验结果：该实验在细胞水平对治疗效果进行了验证(结果如图5所示)，和单药相比，载药纳米颗粒明显降低了药物的IC50(致死细胞50％时的浓度)，具有良好的靶向治疗效果。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 国家纳米科学中心

<120> 特异靶向多肽自组装纳米载体、载药纳米颗粒及制备方法

<130> KHP161117661.3

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr His Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Gln Asn Val Ile

1 5 10