具有脑靶向功能的多肽分子及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种具有脑靶向功能的多肽分子及其制备方法和应用。

背景技术：

目前，脑部相关疾病的发病率正呈现逐年上升的趋势，其中，脑瘤及脑转移瘤、缺血性脑损伤以及各类病毒炎症相关疾病的上升趋势尤其明显。

在对脑部相关疾病的治疗方面，血脑屏障被认为是阻止化疗药物进入脑组织进而影响疗效的主要原因。血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，是机体参与固有免疫的内部屏障之一，由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜所组成，能阻挡病原生物和其他大分子物质由血循环进入脑组织和脑室。这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。然而，正因如此，基本上100％的大分子药物，包括多肽、重组蛋白、单克隆抗体、基于RNA干扰技术的药物、基因治疗相关药物等都无法穿越血脑屏障，且大于98％的小分子药物也无法穿过血脑屏障。因此，血脑屏障在阻挡有害物质的同时，也对应用药物对脑部相关疾病的治疗产生了巨大的障碍。

肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，通常由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物都可以成为叫多肽。多肽也是蛋白质水解的中间产物。由于其具有极性末端和非极性末端，因此在体内有较高的利用度。由于多肽本身为内源性物质，所以毒性小，但是多肽直接作为药物依然在很多方面受到较大的限制，例如，多肽易氧化，且多肽中的肽键易水解断裂，导致其稳定性差，不能口服。近年来，多肽作为药物辅助功能的应用逐渐成为了新药研制的热点之一。细胞穿膜肽是20世纪中期开始认识到的一类具特殊功能的多肽分子，它们通常由5～30个氨基酸组成，典型的一般由8～16个氨基酸构成，具有生物膜穿透功能，还可携带其它分子甚至超分子颗粒进入细胞中。正是因为这种特殊的功能，它们被看作生物活性分子有效的细胞内转运工具，具有广泛的应用前景。因此，近些年来多肽和药物通过共价方式形成组合物的例子越来越多，例如：多肽Penetratin和阿霉素共价耦合用于治疗乳腺癌；多肽TAT和药物P53共价耦合用于治疗眼癌转移；多肽YTA4与甲氨蝶呤共价耦合治疗乳腺癌。但是，目前对于能够有效穿过血脑屏障并可作为释药载体，而对脑部相关疾病进行治疗的多肽研究并不确切。

因此，开发一种能够有效穿过血脑屏障，并通过化学合成的方法与多种能够治疗脑部相关疾病的药物进行偶联而作为释药载体，而达到药物脑靶向释放的目的多肽分子尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种具有脑靶向功能的多肽分子，以克服现有技术中存在的大分子无法穿越血脑屏障的技术问题。

本发明的第二个目的在于提供一种具有脑靶向功能的多肽分子的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种具有脑靶向功能的多肽分子作为释药载体的应用，以克服现有技术中存在的多肽直接作为药物稳定性差，且治疗脑部相关疾病的药物不能够完全达到脑靶向释放的技术问题。

本发明提供的一种具有脑靶向功能的多肽分子，所述多肽分子由4个氨基酸或者所述4个氨基酸的重复序列组成，所述多肽分子的氨基酸序列为：(CXQK)_n，其中，X为氨基酸，n为正整数。

进一步地，所述X为丙氨酸A。

进一步地，所述X为甘氨酸G。

进一步地，所述n的值为1、2、3、4或5。

进一步地，本发明还提供一种制备上述多肽分子的方法，采用液相合成或固相合成的方法。

进一步地，本发明还提供一种上述的具有脑靶向功能的多肽分子作为释药载体的应用。

进一步地，所述应用为将所述多肽分子与抗肿瘤药物，通过酸酐类化合物桥接为偶联物。

进一步地，所述应用为将所述多肽分子与治疗缺血性脑损伤的药物，通过酸酐类化合物桥接为偶联物。

进一步地，所述应用为将所述多肽分子与纳米银，通过酸酐类化合物桥接为偶联物。

进一步地，所述应用为将所述多肽分子与小分子多肽药物，通过酰胺键连接为偶联物。

本发明通过液相合成或固相合成的方法合成的一种具有脑靶向功能的多肽分子，能够穿过血脑屏障，且由于多肽分子不具有免疫原性，可避免引起人体不良免疫反应；本发明提供的多肽分子还可作为释药载体与治疗脑部疾病的相关药物偶联为偶联物，使治疗脑部相关疾病的药物能够通过血脑屏障直接作用于患处，能够有效提升脑部相关疾病的治愈率和治愈速度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a为本发明纳米银－多肽偶联物穿越血脑屏障体内评价实验中实验组的结果图；

图1b为本发明纳米银－多肽偶联物穿越血脑屏障体内评价实验中对照组的结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种具有脑靶向功能的多肽分子，该多肽分子由4个氨基酸或者所述4个氨基酸的重复序列组成，氨基酸的序列为：

CAQK(SEQ ID NO 1)或

CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)或

CAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 3)或

CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)或

CGQK(SEQ ID NO 5)或

CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)或

CGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 7)或

CGQKCGQKCGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 8)。

上述多肽分子本身不具有生理活性，但是具有透过血脑屏障的作用，此外，本发明还涉及该多肽分子的制备方法及其作为释药载体的应用。

本发明提供的具有脑靶向功能的多肽分子采用液相合成或固相合成两种方式实现。

本发明提供的液相合成多肽的方法为：

选用的氨基酸为：H－Cys(Trt)－OH、Fmoc－Gly－OH、Fmoc－Gln－OH、H－Lys(Boc)－Ome；

选用的缩合剂为：HOAT(1－羟基－7－偶氮苯并三氮唑)或HOBT(1－羟基苯并三氮唑)或HOCT(1－羟基－1H－1，2，3－三唑－4－羧酸乙酯)或DIC(N，N＇－二异丙基碳二亚胺)；

选用的溶剂为：DCM(二氯甲烷)；

选用的缩合碱为：DIEA(N，N－二异丙基乙胺)或者DMAP(4－二甲氨基吡啶)；

选用的脱保护试剂为：哌啶；

C末端按照H－Lys(Boc)－Ome、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Gly－OH、H－Cys(Trt)－OH的顺序进行缩合反应，氨基酸比例为1：1，从C末端到N末端依次偶联，缩合剂与氨基酸的比例1：1－1：1.2，缩合剂与缩合碱比例为1：2，使多肽分子在合成的过程中依次从C末端向N末端延伸。

本发明提供的固相合成多肽的方法为：

选用的固相树脂为：wang树脂、2－cl－trt树脂，树脂替代度0.4－0.8；

选用的保护氨基酸为：Fmoc－Lys(Boc)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH；

选用的脱保护试剂为：哌啶，哌啶在所使用溶液中的浓度为15％－50％；在一个优选的实施方式中，哌啶在所使用溶液中的浓度为20％；

选用的偶联试剂为：

HATU(2－(7－氧化苯并三氮唑)－N，N，N＇，N＇－四甲基脲六氟磷酸酯)

/HOBT/DIEA(DMAP)、HBTU(O－苯并三氮唑－四甲基脲六氟磷酸酯)

/HOBT/DIEA(DMAP)、HCTU(6－氯苯并三氮唑－1，1，3，3－四甲基脲六氟磷酸酯)

/HOBT/DIEA(DMAP)、DIC/HOBT/DIEA(DMAP)，其中DIEA可由DMAP替代；

选用的切割试剂为：TFA(三氟乙酸)/TIS(三异丙基硅烷)/H₂O，比例为：95：2.5：2.5；

选用HPLC纯化粗肽。

本发明提供的具有脑靶向功能的多肽分子可作为释药载体，如：将本发明提供的多肽分子通过酸酐类化合物与抗肿瘤药物桥接为偶联物；将本发明提供的多肽分子通过酸酐类化合物与治疗缺血性脑损伤的药物桥接为偶联物；将本发明提供的多肽分子通过酸酐类化合物与纳米银桥接为偶联物；将本发明提供的多肽分子通过酰胺键与小分子多肽药物连接为偶联物。

酸酐类化合物为丁二酸酐，戊二酸酐或马来酸酐。

以本发明提供的多肽分子为释药载体，使治疗脑部相关疾病的药物能够通过血脑屏障直接作用于患处，能够有效提升脑部相关疾病的治愈率和治愈速度。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中所使用的氨基酸均购自上海吉尔公司，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

液相合成CGQK(SEQ ID NO 5)

合成所用试剂选择：

(1)氨基酸：H－Cys(Trt)－OH、Fmoc－Gly－OH、Fmoc－Gln－OH、H－Lys(Boc)－Ome；

(2)缩合剂：DIC或者HOBT；

(3)溶剂：DCM；

(4)缩合碱：DMAP；

(5)脱保护试剂：哌啶；

(6)切割液：TFA/TIS/H₂O，比例为：95：2.5：2.5；

反应在圆底烧瓶中进行，用磁子搅拌，第一步反应：

将H－Lys(Boc)－Ome、Fmoc－Gln－OH，缩合剂、缩合碱按照1：1：1：1的比例同时加入到烧瓶中搅拌，控温在25℃下反应4小时，加入脱保护剂至浓度为20％，反应30分钟，旋蒸除去反应溶液，加入溶剂DCM进行下一步反应：将Fmoc－Gly－OH、缩合剂、缩合碱按照1：1：1的比例加入烧瓶中，控温在25℃下反应4小时，旋蒸除去反应溶液后，再将H－Cys(Trt)－OH、缩合碱按照1：1的比例，和DCM加入到烧瓶中，控温在25℃下反应4小时后旋蒸，加入切割液，搅拌2小时，旋蒸去除切割液，HPLC纯化，纯化条件：梯度液相，流动相A：1％TFA/乙腈；流动相B：1％TFA/H₂O，20min从10％流动相A到60％流动相B。

实施例2

固相合成CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用SyroII公司生产的Biotage型仪器进行CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)的合成。操作方法按照生产商的仪器说明书进行。

合成所用试剂选择：

(1)固相树脂：2－cl－trt树脂，树脂替代度0.75；

(2)保护氨基酸：Fmoc－Cys(Boc)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH；

(3)脱保护试剂：哌啶，哌啶在所使用溶液中的浓度为15％－50％；在一个优选的实施方式中，哌啶在所使用溶液中的浓度为20％；

(4)偶联试剂：HATU/HOBT/DIEA，比例为1：1：2

(5)切割试剂：TFA/TIS/H₂O，比例为：95：2.5：2.5；

选用HPLC纯化粗肽。纯化条件：梯度液相，流动相A：1％TFA/乙腈；流动相B：1％TFA/H2O，20min从10％流动相A到60％流动相B。利用MS确定所得纯品分子量，用HPLC确定样品纯度，纯度大于95％经脱盐及冷冻干燥得到CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQIDNO 4)多肽分子冻干粉。

实施例3

固相合成CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用SyroII公司生产的Biotage型仪器进行CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)的合成。操作方法按照生产商的仪器说明书进行。

合成所用试剂选择：

(1)载体树脂：Fmoc－Lys－wang－rink，替代度：0.8

(2)保护氨基酸：Fmoc－Cys(Boc)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH，反应中所用保护氨基酸5倍过量。

(3)脱保护试剂：哌啶/N，N－二甲基甲酰胺，比例为20：80。

(4)偶联试剂：DIC/HOBT，比例为1：1.5。

(5)切割试剂：TFA/TIS/水，比例为：95：2.5：2.5。

将制得的多肽使用HPLCC18半制备柱进行纯化，检测条件为：检测波长：214nm，流动相A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：水(含0.1％三氟乙酸)，洗脱条件：30分钟内由35％A－50％A，利用MS确定所得纯品分子量，用HPLC确定样品纯度，纯度大于95％经脱盐及冷冻干燥得到CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)多肽分子冻干粉。

实施例4

本发明提供的多肽分子CAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 3)与抗肿瘤药物紫杉醇的偶联方法

50mL反应瓶中加入1.50g(1.72mmol)紫杉醇，0.52g(5.20mmol)丁二酸酐，30mLTHF(四氢呋喃)，滴加0.66g(5.12mmol)DIEA，27℃搅拌6h，蒸干溶剂得蜡状物，加水搅拌，有黄色固体析出，抽滤，水洗两次，干燥，得黄色固体1.15g，所得黄色固体为紫杉醇－丁二酸酐偶联物。

50mL反应瓶中加入0.22g(0.32mmol)紫杉醇－丁二酸酐偶联物，0.10g(0.31mmol)O－苯并三氮唑－N，N，N＇，N＇－四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，5mLDMF，氮气保护，滴加0.08g(0.62mmol)DIEA，27℃搅拌1h后，加入0.10g多肽，27℃搅拌3h后，终止反应。使用MS－IT－TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗产物，既得多肽分子与抗肿瘤药物紫杉醇的偶联物。

实施例5

本发明提供的多肽分子CAQK(SEQ ID NO 1)与治疗缺血性脑损伤药物洛伐他汀的偶联方法

在本实施例中，CAQK(SEQ ID NO 1)采用固相合成的方法，载体树脂选用Fmoc－Lys(Mtt)－wang，替代度为0.8，保护氨基酸选用Fmoc－Cys(trt)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH，本实施例所使用的脱保护试剂为：哌啶/N，N－二甲基甲酰胺，比例为20：80，本实施例所使用的偶联试剂为：DIC/HOBT，比例为1：1.5。在本实施例中，固相合成CAQK(SEQ ID NO 1)后，先不进行整体切割，利用1％1TFA/DCM先切割Lys(Mtt)的侧链Mtt，利用丁二酸酐与Lys暴露的氨基进行耦合，DCM洗涤5次后，使用HATU/HOBT与洛伐他汀偶联，偶联之后进行切割，所使用的切割试剂为：TFA/TIS/水，比例为：95：2.5：2.5。

实施例6

本发明提供的多肽分子与纳米银的偶联方法

取6.1mg鞣酸和1g柠檬酸三钠溶于50ml水中制备为缓冲液，待用。

取252mg AgNO₃粉末，溶解于2.5L水中，60℃下搅拌加热，然后加入上述待用的缓冲液50mL。加热至沸腾，并保持沸腾状态20分钟，制成纳米银溶液。

在本发明提供的多肽分子CAQK(SEQ ID NO 1)或CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)或CAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 3)或CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)或CGQK(SEQ ID NO 5)或CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)或CGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 7)或CGQKCGQKCGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 8)的氨基上形成马来酸酐修饰，利用赖氨酸侧链与马来酸酐直接耦合，比例为多肽：马来酸酐：DIEA＝1：1：1，然后与纳米银进行反应，纳米银与多肽直接混合。反应物在UV－400nm下进行收集，得到纳米银－多肽偶联物。

实施例7

本发明提供的多肽分子CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)与小分子多肽药物胸腺五肽偶联物的制备方法

在本实施例中，载体树脂选用Fmoc－Lys(Trtt)－wang，替代度为0.65，所选用的保护氨基酸为Fmoc－Cys(trt)－OH、Fmoc－Gly－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Trtt)，本实施例所使用的脱保护试剂为：哌啶/N，N－二甲基甲酰胺，比例为20：80，本实施例所使用的偶联试剂为：DIC/1－羟基苯并三唑(HOBT)，比例为1：1.5。固相合成CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)后，直接偶联胸腺五肽，胸腺五肽购买自：上海吉尔生化有限公司，偶联之后进行切割，所使用的切割试剂为：TFA/TIS/水，比例为：95：2.5：2.5。

为了有助于充分的说明本发明提供的具有脑靶向功能的多肽分子作为释药载体的效果，现结合具体的实验详细介绍如下。

需要注意的是，如未明确指出，本实验例中提到的试剂、仪器或者设备均为常规的试剂、仪器或者设备，所用到的方法，均为常规的方法。

偶联物透过血脑屏障的体外评价

本实验中，采用的细胞为：Hela，SK－BR－3，NIH3T3(购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)，将细胞接种于24孔板中，浓度为2×10⁵/孔，培养过夜，将实施例4、实施例5或实施例7提供的任意一种偶联物用PBS溶解，与细胞孵育使其终浓度为10umol/L。

本实验中，使用免疫荧光染色，染色步骤如下：

(1)用4％的甲醛在4℃下固定细胞10分钟；

(2)用3％冷Triton－X100缓冲液在4℃渗透细胞20分钟；

(3)用2％的BSA封闭缓冲液在室温下封闭细胞30分钟；

(4)羊抗人－FLAGmAb在室温下孵育细胞1小时；

(5)用2mg/mL Streptavidin－Alexa499在室温下孵育细胞1小时；

以上每步均用PBS冲洗至少两遍。

(6)用0.3％Triton－X100缓冲液洗20分钟；

(7)置细胞于显微镜及共聚显微镜下观察。

实验结果表明：细胞内均有染色，即表明偶联物可通过细胞膜。

纳米银－多肽偶联物穿越血脑屏障的体内评价

本实验采用小鼠脑内荧光方法，进行纳米银－多肽偶联物的血脑屏障穿越功能的评价。

实验组小鼠尾静脉注射实施例6提供的35nM的纳米银－多肽偶联物，注射体积为1ml，6小时后，组织样本进行HE染色及显微镜观察。

对照组小鼠尾静脉注射生理盐水，注射体积为1ml，6小时后，组织样本进行HE染色及显微镜观察。

观察发现多肽偶联后大大提高了纳米银在脑中的富集，实验结果如图1a和图1b。

由本实验结果可证实，本发明提供的具有脑靶向功能的多肽分子能够介导纳米银穿越血脑屏障。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津世传生物科技有限公司

<120> 具有脑靶向功能的多肽分子及其制备方法和作为释药载体的应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Ala Gln Lys

1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys

1 5 10 15

Cys Ala Gln Lys

20

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Cys Gly Gln Lys

1

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys

1 5 10

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys

1 5 10 15

Cys Gly Gln Lys

20