一种miR-26a抑制剂及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于分子生物学microRNA技术领域，涉及一种miR-26a抑制剂及其用于制 备治疗肺癌药物的应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌死亡率居全世界癌症死亡之首。世界范围内，大约80-85%的病例为非小细胞 肺癌(NSCLC)，非小细胞肺癌包括鳞状细胞癌（SCC)，腺癌(ADC)和大细胞癌(LCC)。尽管手 术、放化疗及分子靶向治疗在临床上已经广泛应用，但是晚期非小细胞肺癌的生存期短，病 死率仍旧很高。
[0003] microRNA是非编码小RNA，在转录后水平调节与其相对应靶基因的表达。随着实验 研究的深入，发现microRNA参与调节人类恶性肿瘤的发生发展，其中miR-26a与非小细胞肺 癌生长以及EGFR-TKIs耐药的关系引起越来越多的关注。阐明miR-26a在非小细胞肺癌中的 作用将有助于新药研发和个体化治疗。
【发明内容】
[0004] 发明人研究发现，肺腺癌组织较正常癌旁组织miR_26a的表达显著升高;肺腺癌细 胞系SPCAl、PC-9、H2170、SW900中miR-26a的表达较正常支气管上皮细胞BEAS-2B显著升高。 PTPN13是已知的抑癌基因，miR-26a通过转录后调控抑制PTPN13的表达而发挥促进非小细 胞肺癌生长的作用。研究发现PTPN13通过去磷酸化Src而抑制EGFR信号通路，PTPN13的高表 达可增强肺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性，因此，miR-26a抑制剂不仅具有抑制肺癌生长的 作用，而且可以提高耐药肺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性。进一步研究发现，miR-26a抑制剂 通过转染试剂转染入细胞后具有抑制miR-26a表达的作用，对于miR-26a表达高的肺癌细 胞，在抑制miR-26a表达后，可以抑制肺癌细胞的生长，并且增加肺癌细胞对EGFR-TKIs的敏 感性。
[0005] 本发明提供了一种miR-26a抑制剂。
[0006] 本发明所提供的miR-26a抑制剂核酸序列为AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。
[0007] 本发明还提供了 miR-26a抑制剂:AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA用于促进抑癌基因 PTPN13表达的应用。
[0008] 本发明同时还提供了 miR-26a抑制剂:AGCCUAUCCUGGAUUA⑶UGAA用于制备治疗肺 癌药物的应用。
[0009] 本发明进一步提供了 miR-26a抑制剂:AGCCUAUCCUGGAUUA⑶UGAA与吉非替尼联合 用于制备治疗肺癌药物的应用。
[0010] 本发明的miR-26a抑制剂抑制肺癌中miR-26a从而间接性解除miR-26a对抑癌基因 PTPN13的抑制作用，达到抑制肺癌生长的目的；同时本发明的miR-26a抑制剂具有吉非替尼 治疗肺癌的增敏作用。
[0011] l.miR-26a抑制剂合成:miR-26a抑制剂是化学合成的类似miR-26a反义序列的RNA 或DNA〇根据本发明所述的miR-26a序列UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU CCUAUCCUGGAUUA⑶UGAAUU，采用寡核苷酸生物合成技术，分别合成多个miR-26a抑制剂，通 过转染试剂转染入SPCA1细胞后，采用qRT-PCR的方法检测miR_26a的表达，选择抑制效率最 高的miR-26a抑制序列:AGCCUAUCCUG GAUUACUUGAA。
[0012] 2. miR_26a在肺腺癌组织及肺腺癌细胞系中的表达异常增高:采用qRT-PCR的方法 检测了 5对肺腺癌及其癌旁组织和6株非小细胞肺癌细胞系A549、SPCA1、PC-9、H2170、 SW900、H520中miR-26a的表达水平（以正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B作为对照）。结果发 现，肺腺癌组织及非小细胞肺癌细胞系A549、SPCA1和SW900中miR-26a表达较BEAS-2B细胞 显著升高，细胞系PC-9、H2170和H520中miR-26a表达与MAS-2B细胞无显著差异（图1)。 A549、SPCA1 和 SW900 为 EGFR-TKIs 耐药细胞系，而 PC-9、H2170 和 H520 为 EGFR-TKIs 敏感细胞 系，提示miR_26a高表达可能与肺癌EGFR-TKIs耐药有关。
[0013] 3.miR-26a促进肺癌细胞生长，miR-26a抑制剂增强EGFR-TKIs耐药细胞对TKIs的 敏感性:MTS生长实验发现在高表达miR-26a的SPCA1细胞中加入miR-26a抑制剂可抑制细胞 生长;在低表达miR-26a的PC-9细胞中加入miR-26a可促进细胞生长。进一步MTS研究发现应 用miR-26a抑制剂于吉非替尼耐药的SPCA1细胞，可增强SPCA1细胞对吉非替尼的敏感性;而 将miR-26a mimics应用于吉非替尼敏感的PC-9细胞中，可减弱PC-9细胞对吉非替尼的敏感 性（图2、3)。
[0014] 4.miR-26a抑制PTPN13的表达：生物信息学预测发现PTPN13 3'UTR有miR-26a的调 控序列。在PTPN13低表达的SPCA1细胞中，miR-26a抑制剂可促进SPCA1细胞PTPN13的mRNA表 达和蛋白表达。在PTPN13高表达的PC-9细胞中，miR-26a mimics可抑制PC-9细胞PTPN13的 蛋白表达。构建包含PTPN133'UTR的质粒，将miR-26a mimics与该质粒共转染于HEK293细胞 中，荧光素酶基因实验证实miR_26a可以抑制PTPN13的表达PTPN13 3'UTR突变的质粒则无 相应改变(图4)。
[0015] 5.PTPN13靶向p-Src使其脱磷酸化。miR-26a靶向PTPN13,而PTPN13必须调控EGFR 信号通路才能发挥TKIs增敏的作用。免疫共沉淀研究发现EGFR信号通路中的Src可与 PTPN13结合。PTPN13是磷脂酶，与Src结合可发挥磷脂酶去磷酸化的作用。生物信息学计算 发现PTPN13-Sr CpTyi416复合物的时间空间稳定性良好，并且PTPN13-Src复合物的结合位点 正是PTPN13的催化域和Src的pTyr416位点。在H520细胞中基因沉默PTPN13后Src pTyl:416的 磷酸化水平显著提高（图5)。
[0016] 6.miR-26a antagomir联合吉非替尼可使SPCA1细胞的肺移植瘤体积、重量明显缩 小（图6)。移植瘤小鼠分4组:对照组，吉非替尼组，miR-26a antagomir瘤内注射组和吉非替 尼灌胃联合miR-26a antagomir瘤内注射组。miR-26a抑制剂联合吉非替尼组肿瘤体积和重 量缩小最明显。
【附图说明】
[0017]图l.miR_26a在肺癌组织与细胞系中的表达差异;A.qRT-PCR法检测5对非小细胞 肺癌及其癌旁正常组织中miR_26a的表达水平；B . qRT-PCR法检测正常支气管上皮细胞 BEAS-2B和6种非小细胞肺癌细胞系中miR-26a的表达水平。
[0018]图2.miR-26a在吉非替尼耐药的SPCA1腺癌细胞系中的作用;A.miR-26a联合吉非 替尼可显著抑制SPCA1细胞的生长;B.miR-26a抑制剂(miR-26a antagomir)可增加SPCA1细 胞对吉非替尼的敏感性。
[0019] 图3.miR-26a在吉非替尼敏感的PC-9肺腺癌细胞系中的作用;A.miR-26a mimics 可促进PC-9细胞的生长;B.miR_26a mimics可降低PC-9细胞对吉非替尼的敏感性。
[0020] 图4.miR-26a抑制PTPN13的表达；A.PTPN13的3'端存在miR-26a的调控序列； B. miR-26a抑制剂可促进SPCA1细胞PTPN13的mRNA表达;C .miR-26a抑制剂可促进SPCA1细胞 PTPN13的蛋白表达;D.miR-26a mimics可抑制PC-9细胞PTPN13的蛋白表达;E.PTPN13的3' UTR及其突变质粒共转染于HEK93细胞中后荧光素酶报告质粒检测。
[0021] 图 5.PTPN13 靶向 p-Src 使其脱磷酸化；A. IP Src 可结合 ΡΤΡΝ13;Β·ΡΤΡΝ13-SrcpTyr416复合物的时间空间稳定性好;C.PTPN13-SrcpTyr416复合物的相互作用位点分 析;D.基因沉默PTPN13后Src的磷酸化水平显著提高。
[0022]图6.裸鼠SPCA1细胞移植瘤实验肿瘤生长变化;移植瘤小鼠分4组:对照组，吉非替 尼组，miR_26a antagomir瘤内注射组和吉非替尼灌胃联合miR_26a antagomir瘤内注射 组。A.miR-26a抑制剂联合吉非替尼组肿瘤体积最小;B.miR-26a抑制剂联合吉非替尼组肿 瘤重量最小。
【具体实施方式】
[0023] l.miR-26a抑制剂合成
[0024] 根据miR-26a序列UUCAAGUAAUCC AGGAUAGGCUCCUAUCCUGGAUUACUUGAAUU，采用寡核 苷酸生物合成技术，分别合成多个miR_26a反义寡核苷酸，通过转染试剂转染入SPCA1细胞 后，采用qRT-PCR的方法检测miR_26a的表达，选择抑制效率最高的miR_26a抑制序列： AGCCUAUCCUG GAUUACUUGAA。
[0025] 2 .qRT-PCR 检测 miR_26a 的表达
[0026] 非小细胞肺癌组织以及与其相对应的癌旁正常肺组织均取自手术标本，组织样本 由手术医师取出后立即置于之前已经准备好的液氮罐中保存。BEAS-2B、SW900、H2170、H520 细胞系均购自于六了〇：4549、3?041、？(：-9均由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室 提供，A549细胞培养在含有10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，BEAS-2B、SPCA1、PC-9、 SW900、H2170、H520均培养在含有10%胎牛血清(FBS)的改良型1640培养基中。采用TRIzol method(Life Technologies)提取非小细胞肺癌、癌旁组织、正常肺上皮细胞、肺癌细胞总 RNA，米用miScript Reverse Transcription Kit反转为cDNA，米用qRT-PCR检测miR_26a的 表达。
[0027] 3.细胞转染miR-26a抑制剂或mimics后MTS实验检测细胞增殖水平
[0028] SPCA1 细胞转染microRNA antagomir NC(对照）与人miR26a抑制剂（miR26a antagomir)，PC_9细胞转染microRNA antagomir NC与人miR26a mimics。以SPCA1 或PC-9细 胞铺6孔板，8-12小时观察细胞汇合度达70%，细胞状态良好。用400ul无血清1640分别稀释 20ul antagomir NC，人miR26a antagomir、人miR26a mimics。轻混转染试剂，并吸取6ul (每孔）加入稀释的antagomir NC、人miR26a antagomir、人miR26a mimics中，用移液器混 勾静置20min。每孔中加入400ul的microRNA-转染试剂混合物(逐滴加入），轻摇6孔板混勾。 根据需要再分别加入吉非替尼15μΜ，于37°C，5%C0 2孵育箱孵育48小时后行MTS实验。
[0029] (1)观察细胞生长状态良好，以0.25%胰蛋白酶常规消化收集细胞，根据实验要求 计数板计数，根据计数结果将细胞浓度调至8X104/ml，移液器轻混匀细胞悬液后，取lOOul 分别加到到96孔板中，注意边缘用无菌PBS填充，对照组加lOOul培养基。
[0030] (2)置37°C，5%二氧化碳孵育箱孵育4小时，倒置显微镜下观察。
[0031] (3)每孔加入20ulMTS液(PMS50ul+MTS液lml)，37Γ孵育3小时。
[0032] (4)测定490nm各孔吸光值，0、24、48、72、96小时重复上述实验。
[0033] (5)同时设置空白孔(培养基和MTS液，无细胞），对照孔(不加处理培养基和MTS液， 有细胞），每组设3个复孔。
[0034] 4.miR-26a 抑制 PTPN13 的表达
[0035] (1)生物信息学预测PTPN13 3'UTR有miR-26a的调控序列。
[0036] (2)在PTPN13低表达的SPCA1细胞中，采用qRT-PCR方法检测miR_26a抑制剂对 PTPN13的mRNA表达的影响。
[0037] (3)在PTPN13低表达的SPCA1细胞中，采用Western-blot方法检测miR-26a抑制剂 对PTPN13蛋白表达的影响。
[0038] (4)在PTPN13高表达的PC-9细胞中，米用Western-blot方法检测miR_26a mimics 对PTPN13蛋白表达的影响。
[0039] (5)构建包含PTPN13 3'UTR的质粒，将miR-26a mimics与该质粒共转染于HEK293 细胞中，荧光素酶基因实验证实miR_26a可以抑制PTPN13的表达。PTPN13 3'UTR突变的质粒 则无相应改变。具体方法如下：
[0040] 以BEAS-2B基因组DNA为模板，前述生工所合成PTPN13 3'UTR引物为引物行PCR后 琼脂糖凝胶电泳见612出白色光亮条带，拍照后以带酶切位点（EcoRI、PstI)引物行50ul体 系PCR后胶回收光亮区，并与双酶切胶回收的SV40-PGL3basic载体连接后行转化、挑克隆后 置于含有氨苄的LB培养基中，37°C摇床振摇孵育16小时行菌液为模板PCR，以含有光亮区的 菌液加含有氨苄的LB5ml37°C摇床振摇孵育16小时后提取质粒，定量后行双酶切鉴定。
[0041 ] 以HEK293细胞铺24孔板，10小时后观察细胞均匀，汇合度达70%，将PTPN133 'UTR-612野生型质粒及PTPN13 3'UTR突变质粒与miR-26a共转染于HEK293细胞中，48小时后行荧 光素酶报告基因实验，每组设5个复孔，结果发现转染了 PTPN13野生型miR-26a组 Luc i f eras e较对照组明显下降，说明为miR_26a可以革巴向作用于PTPN13。
[0042] 5.PTPN13靶向p-Src使其脱磷酸化
[0043] (1)采用anti-Src抗体做免疫共沉淀，采用anti-PTPN13抗体做Western-blot，发 现EGFR信号通路中的Src可与PTPN13结合。
[0044] (2)采用生物信息学计算研究发现PTPN13-SrcpTyl:416复合物的时间空间稳定性良 好，并且PTPN13-Src复合物的结合位点正是PTPN13的催化域和Src的pTyr416位点。
[0045] (3)采用基因沉默技术在H520细胞中靶向沉默PTPN13的表达，采用Western-blot 技术检测Src ρΤ〃416的磷酸化水平。
[0046] 6.裸鼠移植瘤实验检测SPCA1细胞移植瘤的生长
[0047]采用SPCA1细胞皮下注射法做裸鼠移植瘤实验，实验分为如下4组：
[0048] (1 )NC组(仅接种SPCA1瘤细胞的裸鼠）；
[0049] (2)吉非替尼灌胃组；
[0050] (3)miR_26a antagomir瘤内注射组；
[0051 ] (4)miR_26a antagomir瘤内注射联合吉非替尼灌胃组。
[0052]人肺癌细胞SPCA1培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，其中加入含100IU/ml 青霉素及l〇〇IU/ml链霉素的双抗100ul/100ml，培养于37°C，5%二氧化碳孵育箱中，细胞培 养传达状态良好，消化离心PBS清洗收集(去除二抗影响），细胞以1 X 1071半小时内接种于裸 鼠腋下，每组设5只，约4-5天可见移植瘤长出，待肿瘤长至约100mm 3时进行实验，吉非替尼 组以吉非替尼灌胃（25mg/kg/day)，miR_26a抑制剂组予miR_26a antagomir瘤内注射(40ug 多点注射，2次/周），吉非替尼及miR-26a抑制剂共同作用组上述吉非替尼灌胃及miR-26a抑 制剂瘤内注射同时进行;每3天以游标卡尺测量瘤体积大小，按公式V=(宽 2 X长度/2)计算 移植瘤体积。
[0053] 所有实验结果均取均数土标准差表示，以SPSS13.0软件进行处理，采用配 对t检验或单因素方差分析。统计结果P<0.05定为具有统计学意义。
【主权项】
1. 一种 miR-26a 抑制剂，该 miR-26a 抑制剂核酸序列为 AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。2. 权利要求1所述miR-26a抑制剂用于促进抑癌基因 PTPN13表达的应用。3. 权利要求1所述miR-26a抑制剂用于制备治疗肺癌药物的应用。4. 权利要求1所述miR-26a抑制剂与吉非替尼联合用于制备治疗肺癌药物的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种miR?26a抑制剂及其应用。所提供的miR?26a抑制剂核酸序列为AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。所提供的应用包括miR?26a抑制剂用于促进抑癌基因PTPN13表达的应用；miR?26a抑制剂用于制备治疗肺癌药物的应用；miR?26a抑制剂：AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA与吉非替尼联合用于制备治疗肺癌药物的应用。本发明的miR?26a抑制剂抑制肺癌中miR?26a的表达从而间接性解除miR?26a对抑癌基因PTPN13的抑制作用，达到抑制肺癌生长的目的；同时本发明的miR?26a抑制剂具有吉非替尼治疗肺癌的增敏作用。
【IPC分类】A61K31/5377, A61K31/7105, A61K48/00, A61P35/00
【公开号】CN105709240
【申请号】CN201610167807
【发明人】李圣青, 许淑娣, 杨志伟, 王涛, 贾林涛, 张胜利
【申请人】中国人民解放军第四军医大学