癸二醇作为硝化抑制剂的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于硝化抑制剂研究领域，具体涉及癸二醇作为硝化抑制剂的应用。
【背景技术】
[0002] 世界范围内的氮肥有90%是以NH4+的形式施用的，NH4+在土壤中容易被硝化微生 物转化为NOh后者不能被土壤吸附，易淋失，由此导致氮素的直接损失，同时还严重污染了 地下水和地表水，造成面源污染等环境问题。同时，土壤反硝化微生物在厌氧或部分厌氧条 件下通过反硝化作用将NOf转变为气态^和他0,造成土壤氮素的进一步损失，而N20是一种 温室气体，其增温潜势是C〇2的298倍，重要来源之一即农田生态系统中氮素的硝化、反硝化 过程。
[0003] 农业生态系统中平均氮肥利用率在30 %左右，70 %的氮肥损失主要来自上述硝 化、反硝化过程，这些氮素损失均与硝化作用有直接或间接联系。一些氮肥管理措施与缓控 释肥的使用在一定程度上减少了硝化作用的氮素损失，但其增加的人力、农资成本不可忽 视，效果也不尽理想。配合氮肥使用硝化抑制剂，有助于减少氮素损失，提高氮素利用率。在 诸多人工合成的硝化抑制物质中，仅2-氯-6-三氯甲基吡啶(1:抑口71'；[11)、双氰胺(000)和 3,4_二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)经过了详尽的大田评估，在一些农田中被投入使用。但包括 上述物质在内的人工合成的硝化抑制物质，或多或少具有使用不方便、性能不稳定、价格过 高、易造成地下水污染、影响自然生态系统的生物多样性等局限性。
[0004]生物硝化抑制剂的研究方兴未艾，与人工化学合成的硝化抑制剂相比，其来源于 植物根系分泌物或者提取物，是天然的化合物，对生态环境影响小，从中提取效果良好的生 物硝化抑制物质具有显著意义。已有文献报道在腐生臂形草和高粱中存在特定的硝化抑制 物质，通过对这些物质的挖掘，不仅有助于研究和理解自然生态系统中一些硝化抑制现象， 通过环境调控、育种等手段加强作物的硝化抑制能力和提高氮素利用率，还能对生物硝化 抑制物质进行产品开发，研制新型高效的环境友好的硝化抑制剂产品。
【发明内容】
[0005]解决的技术问题:本发明提供癸二醇作为硝化抑制剂的应用，物质包括1，9_癸二 醇等。该类物质通过抑制亚硝化微生物活性来抑制土壤、植物根际的硝化过程，提高氮素利 用率，减少硝态氮的淋失，进而减少反硝化过程的氮素损失和温室气体氧化亚氮的排放。本 发明的硝化抑制物质是来源于植物的化学结构稳定的脂溶性物质，改善了传统硝化抑制剂 具有的易流失、时效短以及可能造成环境污染的问题，提高了硝化抑制效率，节约了相对投 入成本。
[0006]技术方案:癸二醇在抑制亚硝化微生物的亚硝化活性中的应用。
[0007]癸二醇的结构式为：
或
[0008] 所述亚硝化微生物为欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)ATCC19718。
[0009] 一种减少农田氮素损失和提高氮肥利用率的组合物，有效成分为所述的癸二醇。 [0010]对19个水稻品种的根系分泌物进行收集、浓缩，利用欧洲亚硝化单胞菌测定其亚 硝化抑制活性。对其中具有显著效应的品种进一步筛选，挑选根系分泌物具有显著抑制效 应的品种和具有相反效果的品种，对其组分进行GC/MS鉴定。通过两者组分对比，在具有显 著抑制效应的水稻品种武运粳7的根系分泌物中，鉴定得到1，9_癸二醇（1,9-decanediol， 分子量174.28)，具有显著的亚硝化抑制能力，其80%抑制浓度为90yg·mL一1。
[0011] 有益效果：
[0012] (1)本发明化合物能在低剂量下高效抑制亚硝化微生物的活性，减少农田土壤硝 化过程造成的氮素损失和环境问题；
[0013] (2)本发明化合物是脂溶性化合物，化学结构稳定，在土壤和水体中不易流失，能 保证应用的稳定性和高效性。
[0014] (3)本发明提供一类源于植物的"绿色"生物硝化抑制剂，可以解决常规化学合成 硝化抑制剂时效短、效果差、易污染的问题，同时为构建高效抑制农田生态系统硝化过程、 提高氮素利用率的生物生态技术提供新的方法和思路。
【附图说明】
[0015]图1为本发明的水稻品种武运粳7根系分泌物组分的GC/MS分析谱图。本发明抑制 剂1，9-癸二醇为15.29min出峰的物质。
[0016]图2为本发明亚硝化抑制物质1,9-癸二醇的剂量-效应关系(mean土SE，n= 3); [00Π]图3为1，9_癸二醇及其同分异构体（浓度100yg·ml/1)的亚硝化抑制能力比较 (mean土SE，n= 3)，不同的小写字母表示组间有显著差异(Ρ〈0· 05,Duncantest)。
【具体实施方式】
[0018]以下实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发 明。
[0019]实施例1 1，9_癸二醇的剂量-效应关系
[0020] ^实验设计
[0021] (1)标准品：1，9_癸二醇标准品，定制于药明康德新药开发有限公司（WuXi AppTec)，干冰冷冻过程中（常温下为粘稠状液态物质)称取固体粉末溶解于DMS0中。
[0022] (2)微生物菌株：欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonaseuropaea)(NBRC14298 = ATCC19718)，购于日本技术评价研究所生物资源中心（BiologicalResourceCenter, NITE,Japan)〇
[0023](3)微生物培养基：HEPES培养基，1L液体培养基中含(NH4)2SO42·5g，KH2P〇4〇·5g， HEPES11.92g,NaHC030.5g,MgS〇4 · 7H20 100mg,CaCl2 · 2H20 5mg,Fe-EDTA75mg,pH7.8-8.0〇
[0024] (4)微生物的培养:将欧洲亚硝化单胞菌接种于HEPES培养基中，30°C、200rpm、黑 暗条件下摇菌培养(好氧），每次转接后7-9天进入稳定期。
[0025] (5)亚硝化活性抑制实验
[0026]收集培养7天的菌液，5000g离心20min，重新悬浮于新鲜无菌的HEPES培养基中直 至0D600约为1.0，其浓缩倍数为40~50倍。取1.5mL灭菌离心管，依次加入195yL无菌水、5μ LI，9_癸二醇的DMS0溶液（空白则仅加入DMS0)、100yL新鲜无菌HEPES培养基，以及200yL重 悬菌液，2 5 °C黑暗水浴培养2小时。随后往该混合体系中加入2 0μL0 . 1Μ烯丙基硫脲 (Allylthiourea)以终止亚硝化反应。取反应后的混合液200-400yL加入10mL的比色管中， 用去离子水稀释至约5mL，加入lmL对氨基苯磺酸溶液，摇勾后放置2-8min，再加入lmL盐酸 N-(l-萘基)-乙二胺溶液，摇匀，用水稀释至10mL定容。以去离子水做参比，在540nm波长处 测定吸光值。以同样的方法做MV的标线，借此定量样品体系中生成的Ν0Γ，通过以下公式 计算样品抑制率。该测定方法是改进的Griess法，可参考国标《大气降水中亚硝酸盐测定Να-萘基)_ 乙二胺光度法》。
[0027]
[0028] 1.2实验结果
[0029] 实验结果见图2，1，9_癸二醇在2(^8.1111/1浓度时亚硝化抑制率大于20%，1(： 5()(半 抑制浓度）为50yg·mL-SeDsqMO%抑制浓度）为90yg·mL-llSOyg·mL-1时抑制率达95%， 其在20yg·ml/1以上具有良好的抑制效果。
[0030]实施例2 1，9_癸二醇与其他硝化抑制剂的亚硝化抑制能力比较 [0031 ] 1.1实验设计
[0032] (1)标准品：2-氯-6_三氯甲基吡啶(附1^&口5^;[11)、双氰胺(00))、2-氨基-4-氯-6- 甲基嘧啶(AM)、对羟基苯丙酸甲酯、香豆酸甲酯、亚油酸、亚麻酸、亚油酸甲酯，其中香豆酸 甲酯购于1'01公司（1'01^0，加口311)，其余试剂均购于3丨811^-41(11'；[(311公司（31:丄011丨8，]\10， USA)。上述试剂，除D⑶溶于水外，其余均溶于DMS0中。
[0033] (2)D⑶溶于水，其空白中不加入DMS0,其他实验操作步骤同实施例1。
[0034] 1.2实验结果
[0035]实验结果见表1，1，9_癸二醇的ED8Q值与合成硝化抑制剂AM、相近，高于双氰胺，低 于Nitrapyrin;与生物硝化抑制剂亚油酸、亚麻酸相近，高于亚油酸甲酯，低于对羟基苯丙 酸甲酯和香豆酸甲酯。与其他硝化抑制剂相比，1，9_癸二醇具有可观的亚硝化抑制能力。
[0036] 表 1
[0037]
[0038]实施例3 1，9-癸二醇及其同分异构体的亚硝化抑制能力比较[0039] 1.1实验设计
[0040] (1)标准品：1，10-癸二醇、1，2-癸二醇购于TCI公司（Tokyo，Japan)，溶于DMS0中。
[0041] (2)实验操作步骤同实施例1。
[0042] 1.2实验结果
[0043]实验结果见图3，1,9-癸二醇的同分异构体在100yg·ml/1浓度下均有较好的亚硝 化抑制能力，1，9_癸二醇等中长链饱和醇作为硝化抑制剂，具有良好的应用前景。
【主权项】
1. 癸二醇在抑制亚硝化微生物的亚硝化活性中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于癸二醇的结构式为：3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述亚硝化微生物为欧洲亚硝化单胞菌 (Nitrosomonas europaea)。4. 一种减少农田氮素损失和提高氮肥利用率的组合物，其特征在于有效成分为权利要 求2所述的癸二醇。
【专利摘要】癸二醇作为硝化抑制剂的应用，本发明化合物能在低剂量下高效抑制亚硝化微生物的活性，减少农田土壤硝化过程造成的氮素损失和环境问题；本发明化合物是脂溶性化合物，化学结构稳定，在土壤和水体中不易流失，能保证应用的稳定性和高效性。本发明提供一类源于植物的“绿色”生物硝化抑制剂，可以解决常规化学合成硝化抑制剂时效短、效果差、易污染的问题，同时为构建高效抑制农田生态系统硝化过程、提高氮素利用率的生物生态技术提供新的方法和思路。
【IPC分类】C05G3/08
【公开号】CN105439782
【申请号】CN201510926728
【发明人】施卫明, 孙力, 陆玉芳
【申请人】中国科学院南京土壤研究所
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月14日