专利名称：Hbv反义抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于调节基因表达并从而治疗疾病的反义寡核苷酸，特别是用于治疗动物(包括人类)的こ型肝炎病毒(HBV)和こ型肝炎病毒相关病症的反义寡聚体。更具体地，本发明的实施方案涉及用于治疗动物的HBV的具有修饰的核苷的反义寡聚体，更具体地，所述反义寡聚体包含具有2' 0-4' C-亚甲基桥接的糖类的核苷和具有本文另外所述的其它桥接的糖类的核苷，也称作锁定的核酸(LNA)，其用于治疗动物的HBV，更具体地，用于治疗人类的HBV。
背景技术：
こ型肝炎是肠胃外地(通过污染物，诸如血液和血液制品、污染的针头)、性地传播 的病毒病，并从受感染的或携帯者母体垂直传播给她们的后代。在世界上该疾病通常是垂直传播的那些地区中，在低年龄时产生高比例的受感染个体，变成こ型肝炎的慢性携帯者。据世界卫生组织估计，世界上超过20亿人已经被感染，毎年有约400万急性病例，毎年有100万人死亡，有3. 5-4亿慢性携帯者。大约25%的携帯者死于慢性肝炎、肝硬化或肝癌，几乎75%的慢性携帯者是亚洲人。こ型肝炎病毒是仅次于烟草的第二最重要的致癌物，造成所有原发性肝癌中的60%-80%。HBV的传染性是HIV的100倍。こ型肝炎病毒感染是ー个持续的医学问题，这是因为，象任何快速复制的传染物一祥，存在持续的突变，所述突变帮助HBV的一些亚群变成耐受现有的治疗方案。在目前，没有用于治疗受到HBV感染的人的有效治疗剂，它们在体内产生对病毒的血清转换，或它们在遭受こ型肝炎病毒感染的人中实现抗原的90%減少(与治疗之前的基线数目相比)。目前，美国肝脏病研究协会(AASLD)和欧洲肝脏研究协会(EASL)推荐的慢性HBV感染的治疗剂包括干扰素a (INF α )、聚こニ醇化的干扰素a _2a (Peg_IFN2a)、恩替卡韦和替诺福韦。但是，典型的干扰素疗法是48周，并产生严重的且使人厌恶的副作用，且在已经停止治疗以后24周，HBeAg血清转换范围是仅27_36%。HBsAg的血清转换甚至更低——在治疗停止以后立即观察到仅3%，在5年后向上增加至12%。核苷和核苷酸治疗剂恩替卡韦和替诺福韦可成功地減少病毒载量，但是HBeAg血清转换率和HBsAg损失率甚至低于使用IFNa治疗剂得到的相应值。也使用其它类似的治疗剂，包括拉米夫定(3TC)、替比夫定(LdT)和阿德福韦，但是对于核苷/核苷酸治疗剂，一般而言，抗药性的出现会限制治疗效果。因而，本领域需要发现和开发新的抗病毒治疗剂。更具体地，需要新的抗-HBV治疗剂，其能够增加HBeAg和HBsAg血清转换率。这些血清标志物会指示HBV感染的免疫学控制，并导致提高的预后，即肝病的预防和向肝硬化的进展、肝衰竭的预防、肝细胞癌(HCC)的预防、肝病有关的移植的预防和死亡的预防。最近的临床研究已经发现了血清转换与HBeAg的降低(Fried等人(2008)Hepatology 47:428)和 HBsAg 的降低(Moucari 等人(2009) Hepatology 49:1151)之间的关联。抗原水平的降低可能已经允许HBV感染的免疫学控制，因为认为高水平的抗原会诱发免疫耐受性。目前用于HBV的核苷疗法能够急剧降低HBV的血清水平，但是对HBeAg和HBsAg水平几乎没有影响。反义疗法与核苷疗法的差别在于，它可以直接地靶向抗原的转录物，从而降低血清HBeAg和HBsAg水平。因为在HBV感染后产生多个重叠的转录物，也存在单个反义寡聚体减少HBV DNA (除了 HBeAg和HBsAg 二者以外)的机会。反义疗法是遗传障碍或感染的一种治疗形式。当已知特定基因的遗传序列是特别疾病的原因时，无论所述基因是原始哺乳动物基因、癌基因，还是来自传染性生物体的基因(诸如来自细菌物种的基因、来自真菌的基因、来自寄生物的基因或来自病毒的基因)，可能合成核酸(DNA、RNA或化学类似物)的链，所述链会结合由所述基因产生的信使RNA (mRNA)并灭活它，从而有效地将该基因“关闭”。这是因为，mRNA必须单链化才能被翻译。或者，所述链可能靶向结合前-mRNA上的剪接位点，并修饰mRNA的外显子内容物[I]。如果具有相同序列(例外是，RNA中的U对应DNA中的T)的RNA形式被翻译成或可翻译成蛋白，DNA单链序列经常被称作有义链(或正(+ )义链)，互补链被称作反义链(或负(_)义链)。 在DNA双链内的有些区域编码基因(它们经常是指定表达的或翻译的蛋白中的氨基酸次序的指令)以及调节序列、剪接位点、非编码内含子和其它区域。对于要表达由DNA编码的蛋白的细胞，DNA的一条链充当用于合成RNA的互补链的模板。模板DNA链被称作转录链，它的序列与mRNA转录物互补或成反义，其具有与原始双链DNA的有义序列相同的序列。因为DNA是双链的，与反义序列互补的链被称作非转录链或有义链，且具有与mRNA转录物相同的序列(例外是，DNA序列中的T核苷碱基被RNA序列中的U核苷碱基替代)。与从DNA转录的RNA互补的核酸被称作“反义”寡核苷酸，因为它的碱基序列与基因的信使RNA (mRNA，S卩“有义”序列)互补。因而，具有5’-AAGGTC-3’的有义序列的DNA编码区会被转录生成具有5’ -AAGGUC-3’的有义序列的mRNA，所以所述有义序列的反义寡聚体会具有序列3’ -UUCCAG-5’(如果它包含RNA核苷碱基)或3’_TTCCAG_5’(如果所述反义寡聚体包含DNA核苷碱基)。目前，反义疗法的主要焦点涉及长度为大约20个核苷酸/核苷的寡聚体或寡核苷酸的应用，所述寡聚体或寡核苷酸合成为与负责靶蛋白的表达或翻译的特定“有义”(5’至3’方向)DNA或mRNA序列互补。在导入细胞中以后，所述反义寡核苷酸会通过Watson-Crick结合与它的对应mRNA序列杂交，形成异源双链体。形成双链体以后，由结合的mRNA的序列编码的蛋白的翻译受到抑制。存在寡核苷酸/mRNA双链体阻碍后续翻译的几种机理。几种不同的反义剂的被最广泛地接受的解释涉及涉及遍在酶RNA酶H对异源双链体中的mRNA的降解。RNA酶H被吸引至异源双链体，并切割结合的mRNA，同时保持寡核苷酸序列完整，这允许所述寡核苷酸继续寻找和结合对应的mRNA序列。通过反义疗法(其可以单独地发生，或与RNA酶H活性结合地发生)实现的翻译抑制的一些其它被接受的解释包括、但不限于阻断适当的核糖体装配(这使得核糖体复合物失去翻译能力)、阻断RNA剪接和/或阻碍mRNA的适当输出。被生物体用于控制基因表达(通过限制翻译)的表面上単独的方式称作基因干扰，其涉及“沉默”祀基因的短RNA序列的采用。这些短RNA序列称作小干扰RNA或siRNA。RNA干扰是ー个古老的遗传过程，其中可以关闭靶向的基因，即生产某些蛋白的“蓝图”。已知称作Dicer的酶在RNA干扰中起关键作用。Dicer是ー种核糖核酸酶,其识别双链RNA分子，并将它们切割成约20-25个核苷酸长的短dsRNA，所述短dsRNA通常具有在3’末端上的双碱基突出端。由Dicer产生的小dsRNA片段然后同化成大多蛋白复合物，它们引导dsRNA分子到达细胞中的目标地，在这里它们结合它们的靶mRNA序列并关闭基因。该复合物称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC具有ー种催化组分argonaute，它是在mRNA的序列与siRNA引导链的序列互补的情况下能够降解信使RNA (mRNA)的内切核酸酶。因此，Dicer、RISC和siRNA基因沉默系统是许多基础性的生物学事件的必需步骤，所述事件包括基因组重排、干细胞分化、脑发育和病毒防御。令人感兴趣地，已经确定，小dsRNA (siRNA)的大小是它们的功能的决定因素。如果dsRNA太大或太小，它们使它不能进入RISC复合物中，所以不会发生基因沉默。反义寡聚体与siRNA的差别在于几个方面，最重要的是，反义寡聚体是单链的。它们也是合成的，通常沿着磷酸酯主链被修饰，且经常在选定的核苷碱基位置中。在反义疗法领域，化学修饰的核苷向核酸分子中、特别是向核糖核酸分子(RNA)中 的导入，会提供克服外源地递送的天然RNA或DNA分子固有的体内稳定性和生物利用度的潜在限制的有力工具。例如，化学修饰的核酸分子的应用，可以使更低剂量的特定核酸分子实现给定的治疗效果，因为化学修饰的核酸分子倾向于具有更长的血清半衰期。此外，某些化学修饰可以提高核酸分子的生物利用度，这通过靶向特定细胞或组织和/或提高核酸分子的细胞摄取来实现。因此，即使化学修饰的核酸分子的活性比天然核酸分子降低(例如当与所有RNA核酸分子相比较时)，由于提高的分子稳定性和/或递送，修饰的核酸分子的总活性可以大于天然分子。ー种有用的化学修饰称作锁定的核酸(LNA)，其会在ー个或多个RNA或DNA核苷部分处导入2' 0-4' C-亚烷基桥，其中所述亚烷基桥是C^6亚烷基桥，更具体地是2' 0-4; C-亚甲基桥。在被宿主细胞摄取以后，当LNA掺入反义RNA或DNA寡聚体中吋，已经证实，它们会极大地增加反义RNA或DNA分子的稳定性，并从而极大地增加反义RNA或DNA的生物利用度。可以导入反义RNA或DNA寡聚体中来增加反义寡聚体的稳定性和生物利用度的其它有用的化学修饰包括硫代磷酸酯键或磷酸三酯键，它们取代单个RNA或DNA核苷酸之间的天然存在的磷酸ニ酯键。
发明内容
在本发明的第一个实施方案中，提供了ー种药物组合物，其包含根据本发明的RNA或DNA寡聚体或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯以及药学上可接受的稀释剂，所述RNA或DNA寡聚体与通过引用并入本文中的下述DNA序列的对应RNA转录物基本上互补CCTGC了GGTGGCTCCAGTTC (SEQ ID NO: 1};
AGAGTCTAGACTCGTGGTGGAOTCTCTCAATTTTCTAGGGG (SEQ ID N0:2);TCGATGTGTCTGCGGCGmTATCA了 (SEQ ID NO: 3|
CATCCTGC了GCTATGCCTCA了CTTCTT {SEQ ID NO: 4): CAAGGTATGTTGCCCGT {SEQ
ID NO: 5}: TGTATTCCCATCCCATC (SEQ ID NO; 6); CCTATGGGAGTGGGCCTCAG (SEQID NO: 7): TGGCICAGTTTACTAGTGC (SEQ ID NO: 8) GGGCTTTCCCCCACTGT {SEQID NO: 9} TCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT (SEQ ID NO: 10)；CGCACCTCTCTTTACGCGG (SEQ ID NO: 11); GGAGTGTGGATTCGCAC iSEQ ID NO
12}: if GAAGAAGAACTCCCTCGCCT (SEQ 丨D NO: 13};其中所述反义 RNA 或 DNA 分子包含多个修饰的核苷和/或核苷酸。
在本发明的第二个实施方案中，提供了ー种药物组合物，其包含根据本发明的RNA或DNA寡聚体或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯以及药学上可接受的稀释剂，所述RNA或DNA寡聚体与通过引用并入本文中的下述DNA序列的对应RNA转录物基本上互补
GAGAGAAGTCCACCAC (SEQ ID NO: 14) TGAGAGAAGTCCACCA (SEQ tD NO:15)GAGGCATAGCAGCAGG (SEQ ID NO: 16): TGAGGCATAGCAGCAG (SEQ ID NO: 17);GATGAGGCATAGCAGC {SEQ ID NO: 18) GATGGGATGGGAATAC (SEQ ID NO: 19};GGCCCACTCXCATAGG <SEQ ID NO 20)； AGGCCCACTCCCATAG {SEQ ID NO 21);或
CTGAGGCCCACTCCCA (SEQ ID NO; 22);其中所述反义RNA或DNA分子包含多个修饰的核苷和/或核苷酸。一个实施方案提供了一种反义寡聚体或其盐、溶剂化物、水合物或酷，其用于减少哺乳动物细胞或生物体中的こ型肝炎病毒DNA和HBV抗原的量，其中所述反义寡聚体是长度为10-26个核苷的连续序列，且具有如式I所示的序列
5’ -LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-N1-P-LNAr-P-LNArS,(式 I)
其中LNA是锁定的核酸；P是选自下述的核苷间连接磷酸ニ酷、磷酸三酷、硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酷、H-膦酸酯或烷基膦酸酯连接，所述连接是在LNA和邻近的N之间，或在N和邻近的N之间，或在N和邻近的LNA之间，或在LNA和邻近的LNA之间，从式(I)序列的5’至3’方向；且其中N选自G、C、A、T、U或Z核苷单元；n和r和p和q各自独立地是选自1、2或3的整数；1和m各自独立地是1-22的整数；且
其中Z选自肌苷、N7-甲基肌苷、N7-甲基胍、5-甲基尿苷、5-甲基-胞苷、5-氟尿苷、5-氟胸苷、黄苷、ニ氢尿苷、假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、7-甲基-7-脱氮鸟苷、7-乙基-7-脱氮鸟苷、N4-甲基胞苷、N4-こ基胞苷。特定实施方案提供了如本文所述的反义寡聚体，其中所述寡聚体的至少4个核苷单元可以是LNA单元。在有些实施方案中，所述LNA是具有2' -O-烷基-4' C连接的锁定的核酸単元，其中所述烷基可以是取代的或未取代的C^6烷基。在其它实施方案中，至少2个在连续核苷序列的核苷单元之间存在的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在ー些有关的实施方案中，在反义寡聚体的连续核苷序列的核苷单元之间存在的所有核苷间连接都可以是硫代磷酸酯核苷间连接。
在ー些具体的实施方案中，η、P、r和q各自独立地是1或2，且I和m各自独立地是2、3、4、5或6，且在ー些具体的实施方案中，n、p、r和q各自独立地是1，且I和m各自独立地是6。在其它具体的实施方案中，提供了一种反义寡核苷酸，其中所述序列可以是SEQ ID NO 14、16、16 或 20 中的任ー个。在具体实施方案中，上述的反义寡聚体可以与SEQ ID NO. 1_13中的任ー个基本上互补，且所述こ型肝炎病毒可以是人こ型肝炎病毒，且所述细胞或生物体可以是人。在有关的具体实施方案中，所述こ型肝炎病毒可以是人地理学基因型中的任ー种A (欧洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亚、中国、越南);C (东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南)；D (地中海地区、中东、印度)；E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亚)；G (美国、法国)；或H (中美洲)。在具体实施方案中，上述的反义寡聚体可以具有与SEQ ID NO. 14_22中的任ー个基本上互补的序列，且所述こ型肝炎病毒可以是人こ型肝炎病毒且所述细胞或生物体可以是人。在有关的具体实施方案中，所述こ型肝炎病毒可以是人地理学基因型中的任ー种A(欧洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亚、中国、越南);C (东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南)；D (地中海地区、中东、印度)；E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亚)；G (美国、法国)；或H (中美洲)。ー个具体的实施方案提供了ー种用于治疗哺乳动物的こ型肝炎病毒感染的药物制剂，其包含有效量的如上所述的任意核酸反义寡聚体或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或酯以及药学上可接受的稀释剂。这样的药物制剂的反义寡聚体可以与SEQ ID NO:1-13中的任ー个基本上互补，或可以具有与SEQ ID NO 14-22中的任ー个基本上互补的序列，且可以另外包含药学上可接受的载体。本发明的另ー个实施方案提供了ー种用于治疗哺乳动物的こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相关病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的如上所述的任意药物组合物施用给有此需要的哺乳动物，从而治疗所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相关病症。在有关的实施方案中，所述哺乳动物是人，所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相关病症是来自人こ型肝炎病毒的こ型肝炎病毒感染。更具体地，所述人こ型肝炎病毒可以是人地理学基因型中的任ー种A (欧洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亚、中国、越南);C (东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南);D (地中海地区、中东、印度);E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亚)；G (美国、法国)；或H (中美洲)。
有关的实施方案提供了ー种用于治疗哺乳动物的こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相关病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的如上所述的任意药物组合物施用给如上所述的有此需要的哺乳动物，其中所述人こ型肝炎病毒相关病症可以是黄疸、肝癌、肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、弥散性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征或血清性肝炎。在有关的实施方案中，所述方法可以另外包括与额外治疗剂组合地施用反义寡聚体，其中所述反义寡聚体和所述额外治疗剂在単一制剂中一起施用，或在不同制剂中分开施用，且其中所述核酸寡聚体和所述第二种治疗剂的施用并行地或相继地进行。在其它有关的实施方案中，所述额外治疗剂可以是HBV剂、HCV剂、化学治疗剂、抗生素、止痛剂、非类固醇类抗炎(NSAID)剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗恶心剂、止泻剂或免疫抑制剂。
在特别有关的实施方案中，所述额外HBV剂可以是干扰素a-2b、干扰素a _2a和干扰素alphacon-Ι (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二种反义寡聚体；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韦(ETV);富马酸替诺福韦双索酯(TDF);替比夫定(LdT);阿德福韦；或HBV抗体治疗剂(单克隆的或多克隆的)。在其它特别有关的实施方案中，所述额外HCV剂可以是干扰素a _2b、干扰素a -2a和干扰素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的);利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂(例如，ViroPharma的VP50406系列)；HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；或HCV单克隆或多克隆抗体治疗剂。另ー个实施方案提供了一种用于减少受こ型肝炎病毒感染的哺乳动物中的HBVDNA的量和HBV抗原的量的方法，所述方法包括将治疗有效量的如上所述的药物组合物施 用给有此需要的哺乳动物，从而与治疗之前哺乳动物中HBV DNA的量和HBV抗原的量相比，減少所述こ型肝炎病毒感染和所述こ型肝炎抗原。在有些实施方案中，所述哺乳动物可以是人，所述こ型肝炎病毒可以是人こ型肝炎病毒。更具体地，所述人こ型肝炎病毒可以是人地理学基因型中的任ー种A (欧洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亚、中国、越南);C(东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南);D (地中海地区、中东、印度);E (非洲);F (美洲土著人、波利尼西亚);G (美国、法国)；或H (中美洲)。在具体实施方案中，提供了一种用于减少受こ型肝炎病毒感染的哺乳动物中的HBV DNA的量和HBV抗原的量的方法，所述方法包括将治疗有效量的如上所述的药物组合物施用给有此需要的哺乳动物，从而与治疗之前哺乳动物中HBV DNA的量和HBV抗原的量相比，減少所述こ型肝炎病毒感染和所述こ型肝炎抗原，其中与施用反义寡聚体之前的量相比，DNA的量减少了 90%。在有关的方法中，所述HBV抗原可以是HBsAg，或可以是HBeAg，更具体地，可以充分地減少HBV抗原的量以导致血清转换，所述血清转换定义为血清HBeAg不存在+血清HbeAb存在(如果监测HBeAg作为血清转换的决定因子)，或者定义为血清HBsAg不存在(如果监测HBsAg作为血清转换的决定因子)，所述存在和不存在由商业ELISA系统的目前可得到的检测限确定。在更具体的实施方案中，如上所述的方法可以另外包括与额外治疗剂组合地施用反义寡聚体，其中所述反义寡聚体和所述额外治疗剂在単一制剂中一起施用，或在不同制剂中分开施用，且其中所述核酸寡聚体和所述第二种治疗剂的施用并行地或相继地进行。在特别有关的实施方案中，所述额外治疗剂可以是HBV剂、HCV剂、化学治疗剂、抗生素、止痛剂、非类固醇类抗炎(NSAID)剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗恶心剂、止泻剂和免疫抑制齐U。在更特别有关的实施方案中，所述额外HBV剂可以是干扰素a-2b、干扰素a_2a和干扰素alphacon-Ι (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第ニ种反义寡聚体；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韦；替诺福韦；替比夫定(LdT);阿德福韦；或HBV抗体治疗剂(单克隆的或多克隆的)，且所述额外HCV剂可以是干扰素a-2b、干扰素a _2a和干扰素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)；利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂(例如，ViroPharma的VP50406系列);HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；或HCV抗体治疗剂(单克隆的或多克隆的)。另ー个实施方案提供了一种用于促进受HBV感染的哺乳动物的こ型肝炎病毒的血清转换的方法，所述方法包括将治疗有效量的如上所述的药物组合物施用给受こ型肝炎感染的哺乳动物；监测HBeAg + HBeAb在哺乳动物血清样品中的存在，或监测HBsAg在哺乳动物血清样品中的存在，以致于血清样品中HBeAg的不存在+ HbeAb的存在(如果监测HBeAg作为血清转换的决定因子)或血清样品中HBsAg的不存在(如果监测HBsAg作为血清转换的决定因子)(所述存在和不存在由商业ELISA系统的目前检测限确定)，指示哺乳动物的血清转换。对于本文所述的任意实施方案，所述实施方案提供了一种治疗こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相关病症的方法、一种用于减少受こ型肝炎病毒感染的哺乳动物中的HBVDNA的量和HBV抗原的量的方法或一种用于促进受HBV感染的哺乳动物的こ型肝炎病毒的血清转换的方法，其中所述方法包括施用本文所述的反义寡聚体、施用反义寡聚体，无论是单独地还是组合地，也无论存在于药物制剂中还是简单地存在于稀释剂中，所述施用可以是ロ服的、□腔的、直肠的、肠胃外的、腹膜内的、真皮内的、透皮的或气管内的给药。
通过參照下面的详细描述，并參照附图，可以更容易地理解本发明的前述特征，在附图中
图I是HBV感染的自然史的简图。图2是被视作HBeAg阳性的具有代偿疾病的HBV患者的简图。图3是被视作HBeAg阴性的具有代偿疾病的HBV患者的简图。图4是HBV转录的示意图，它显示了由HBV基因组编码的主要转录物(包括前核心蛋白和核心蛋白、RNA-和DNA-依赖性的DNA聚合酶(逆转录酶活性)、X蛋白和大、中和小S蛋白以及聚腺苷酸尾巴)、转录物的相对长度以及大、中和小S蛋白转录物的重叠区。也指示了 HBV DNA的+和-链。图5显示了对比来自HBV的多个基因型的基因组DNA的序列之间的同一性百分比的计算生物学分析，其按照HBV基因组区域进行绘制。图6是已经鉴别出的不同HBV地理学基因型的表。具体实施方案的详细描述
定义.如在本说明书和附随的权利要求书中所使用的，下述术语应当具有指出的含义，除非上下文另有要求
本文使用的术语“有效量”是指，包括核酸寡聚体的药物或药品或药剂的量，其会引起组织、系统、动物或人的生物学或医学应答，所述应答是例如研究人员或临床医师所追求的。此外，术语“治疗有效量”是指，与尚未接受这样的量的对应受试者相比，导致下述效果的任意量改善的治疗，愈合，预防或改善疾病、障碍或副作用，或疾病或障碍的进展速率降低。该术语在它的范围内也包括有效地增强正常生理功能的量。本文使用的术语“基本上互补”是指，使用标准的Watson-Crick碱基对A_T、A_U和G-C，所述反义寡聚体序列具有与它的靶有义序列完全互补的序列。另外，术语基本上互补包括使用非标准的Watson-Crick碱基对，反义寡聚体序列与它的靶有义序列完全互补，所述非标准的Watson-Crick碱基对包括、但不限于G:U、I:U、I:A、I:C、X:A、X:C、R:C、R:T、R:U、m7I:U、m7I-A、m7I:C、m7G:U、m7G:C、m5U:A、5-FU:A、5-FT:A、m5C:G、D:A、Ψ:Α 和 Ψ :C0本文使用的G是鸟苷，I是肌苷，A是腺苷，C是胞苷，U是尿苷，T是胸苷，X是黄苷，R是利巴韦林，m7G是N7-甲基鸟苷，m7I是N7-甲基肌苷，5FU是5-氟尿苷，5FT是5-氟胸苷，D是ニ氢尿苷，m5U是5-甲基尿苷，m5C是5-甲基胞苷，和Ψ是假尿苷。术语“基本上互补”也包括这样的反义寡聚体其在序列中具有ー个或多个合成的核苷碱基，所述核苷碱基表现出与DNA或RNA靶核酸序列中的天然存在的核苷碱基的假互补性。导致与天然核酸序列的假互补性的核苷碱基的实例包括2_氨基腺嘌呤或2-氨基腺苷(nA)、2-硫代胸腺嘧啶或2-硫代胸苷(sT)、7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤或7-烷基-7脱氮鸟苷(7al-7daG)和N4-烷基胞嘧啶或N4-烷基胞苷(N4_alC ;其中烷基=甲基或こ基)。非Watson-Crick碱基对nA:T和A: sT是稳定的碱基对，7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤与C配对(7al-7daG:C)以及N4-烷基胞嘧啶与G配对(N4_alC:G)也是稳定的。当所有4个合成的核苷碱基nA、sT、7al-7daG和N4_alC都掺入给定的ASO中时，得到的ASO序列在很大程度上没有ニ级结构，且会结合具有假互补性的靶核酸。在本发明的实施方案中，ー个或 多个合成的核苷碱基可以存在于ASO序列中，在ASO和靶核酸序列之间产生ー个或多个非Watson-Crick “假互补的”碱基对。应当理解，具有ー个或多个假互补的碱基从而与靶核酸序列上的核苷碱基形成一个或多个假碱基对的AS0，被视作与靶核酸序列基本上互补。术语“基本上”，诸如当用于短语“基本上具有SEQ ID NO X的序列的寡核苷”中吋，在本文中用于表示，可以与书写的SEQ ID NO X的互补序列碱基配对的任意序列，但是其可以在序列中含有ー个或多个合成的核苷碱基，所述核苷碱基表现出与DNA或RNA靶核酸序列中的天然存在的核苷碱基的假互补性。导致与天然核酸序列的假互补性的核苷碱基的实例包括2_氨基腺嘌呤或2-氨基腺苷(nA)、2-硫代胸腺嘧啶或2-硫代胸苷(sT)、7_烷基-7-脱氮鸟嘌呤或7-烷基-7脱氮鸟苷(7al-7daG)和N4-烷基胞嘧啶或N4-烷基胞苷(N4-alC ;其中烷基=甲基或こ基)。非Watson-Crick碱基对nA:T和A: sT是稳定的碱基对，7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤与C配对(7al-7daG:C)以及N4-烷基胞嘧啶与G配对(N4_alC:G)也是稳定的。当所有4个合成的核苷碱基nA、sT、7al-7daG和N4_alC都掺入给定的ASO中时，得到的ASO序列在很大程度上没有ニ级结构，且会结合具有假互补性的靶核酸。在本发明的实施方案中，ー个或多个合成的核苷碱基可以存在于ASO序列中，在ASO和靶核酸序列之间产生ー个或多个非Watson-Crick “假互补的”碱基对。应当理解，具有ー个或多个假互补的碱基从而与靶核酸序列上的核苷碱基形成一个或多个假碱基对的AS0，被视作基本上具有书写的SEQ ID NO X的序列，其针对给定的靶核酸序列。本文使用的术语“核酸寡聚体”是指，包含至少2个且不超过100个连贯地连接的共价结合的核苷或核苷酸单元的核酸分子。每个单独的核苷或核苷酸单元可以包含核糖或脱氧核糖，因而所述寡聚体可以包含核糖和脱氧核糖的组合。可以连接核酸寡聚体中的核苷酸或核苷，使得所述寡聚体包含传统的磷酸ニ酯连接，或者所述寡聚体可以包含ー个或多个磷酸三酯连接、膦酸酯连接、烷基膦酸酯连接、硫代磷酸酯连接或ニ硫代磷酸酯连接。另外，所述核酸寡聚体可以包含一个或多个修饰的核苷，包括2’ 0-4’ C连接的核苷，且额外地或替代地，所述核酸寡聚体可以包含ー个或多个具有在2’ -位的其它修饰的核苷，所述其它修饰包括2’ -O-烷基修饰诸如2’ -O-甲基修饰、2’ -O-こ基修饰或其它2’ -修饰。本文使用的术语LNA (锁定的核酸)包括具有在核苷糖单元的2’ -位和4’ -位之间的化学连接的核酸単体(即如果根据普遍接受的寡核苷酸的5’至3’方向性命名法进行描述，核酸单体的呋喃糖具有2’ 0-4’ C连接或4’ C-2’ 0连接)，包括但不限于如下描绘的(A) a -L-亚甲基氧基(4，-CH2-0-2，) LNA、(B) ^ -D-亚甲基氧基(4，-CH2-0_2，) LNA、(C)亚乙基氧基(4’ -(CH2)2-0-2J ) LNA、⑶氨基氧基(4’ -CH2-O-N(R)-2’ ) LNA 和(E)氧基氣基(4’ _CH2_N (R) _0_2 ’ ) LNA。
本文使用的LNA化合物包括、但不限于在糖的4’和2’位之间具有至少一个桥的化合物，其中每个桥独立地包含I个或2-4个连接的基团，所述基团独立地选自^[C(R1)(R2) ] n_、_C (R1) =C (R2) -、-C (R1) =N-> -C (=NR1) -、-C (=0) -、-C (=S) -、-O-、-Si (R1) 2_、-S (=0)x-和-N(R1)-;其中x是0、1或2 ;n是1、2、3或4 ;每个RjPR2独立地是H、保护基、羟基、C「C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C2tl芳基、杂环基团、取代的杂环基团、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7·脂环基团、取代的C5-C7脂环基团、卤素、OJp NJ1J2'SJp NyCOOJ1、酰基(C(=0)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(^)2-J1)或 sulfoxyl (SbO)-J1);且每个 J1 和 J2 独立地是H、C1-C12 烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-Cm芳基、取代的C5-C2tl芳基、酰基(C(=0)-H)、取代的酰基、杂环基团、取代的杂环基团、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。在LNA的定义内包括的具体4’ C- 2’ 0桥的实例包括HC(R1) (R2)Jn-, -[C(R1)(R2) L-O^-C(R1R2)-N(R1)-O-或-C(R1R2)-O-N(R1)-桥。在 LNA 的定义内包括的其它桥是4，_CH2_2，、4，_ (CH2) 2_2，、4，_ (CH2) 3_2，、4，_CH2_0_2，、4，_ (CH2)2U,、4，_CH2_0_N (R1) _2，和4’ -CH2-N(R1)-O^'-桥，其中每个R1独立地是H、保护基或C1-C12烷基。根据本发明，在LNA的定义内还包括这样的LNA :其中，核糖基糖环的2’ -羟基连接至所述糖环的4’碳原子上，从而形成亚甲基氧基(4’ -CH2-0-2’)连接，以形成二环糖部分。所述连接可以是桥接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(-CH2-)基团，术语亚甲基氧基(4’ -CH2-0-2’)LNA用于二环部分上；在亚乙基在该位置的情况下，使用术语亚乙基氧基(4’-CH2CH2-0-2’)LNA。在本文使用的LNA的含义内，也包括a-L-亚甲基氧基(4’ -CH2-0-2’)，即亚甲基氧基(4’ -CH2-0-2’ ) LNA的一种异构体。本文使用的术语“2' -0-烷基-4' C连接”表示，在锁定的核酸(LNA)中的2’ -0-4’ -C (或4’ C-2’ 0，如果根据普遍接受的寡核苷酸的5’至3’方向性命名法进行描述)化学连接或桥。所述烷基连接可以是取代的或未取代的烷基，其中本文使用的“烷基”表示-[C(R1) (R2) ]n_，其中n是1、2、3、4、5或6 ;每个R1和R2独立地是H、保护基、羟基、C1-C12 烷基、取代的 C1-C12 烷基、C2-C12 烯基、取代的 C2-C12 烯基、OJ1'NJ1J2'SJ1'N3AOOJ1、酰基(C(=0)-H)，且每个J1和J2独立地是=HX1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。本文使用的术语“HBV”是指哺乳动物乙型肝炎病毒，包括人乙型肝炎病毒。该术语包括乙型肝炎病毒(特别是人乙型肝炎病毒)的地理学基因型以及乙型肝炎病毒的地理学基因型的变异株。本文使用的“乙型肝炎相关病症”或“HBV相关病症”是指，乙型肝炎感染、暴露或疾病会恶化、造成、有关、伴随或引起的任意疾病、生物学状况、医学状况或事件。术语乙型肝炎相关病症包括黄疸、肝癌、肝炎症、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、弥散性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征、血清性肝炎、HBV病毒血症和具有症状的病症，所述症状可以包括下述的任一项或全部流感样疾病、虚弱、疼痛、头痛、发热、食欲缺乏、腹泻、黄疸、恶心和呕吐、在身体的肝区的疼痛、泥色或灰色大便、全身瘙痒和深色尿，并伴有乙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒抗原存在的阳性检测，或对乙型肝炎病毒抗原特异性的抗体的存在的阳性检测。本发明的反义寡核苷酸(ASO)可以以非溶剂化物形式和溶剂化物形式存在。术语‘溶剂化物’在本文中用于描述分子复合物，其包含本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的溶剂分子(例如乙醇)。当所述溶剂是水时，采用术语‘水合物’。药学上可接受的溶剂化物包括水合物和其它溶剂化物，其中结晶的溶剂可以同位素地替换，例身D2O, d6-丙酮、d6-DMS0。
在本发明要求保护的化合物的范围内，包括式(I)化合物的所有立体异构体、几何异构体和互变异构形式，包括表现出超过一类异构现象的化合物和它们中的一种或多种的混合物。本发明的ASO可以作为前药施用。因而，本文所述的ASO的某些衍生物(它们本身可能几乎不具有或不具有药理学活性)在施用到身体中或上时，通过例如水解裂解，可以转化成具有希望的活性的、与SEQ ID NO: 1-13基本上互补的AS0。这样的衍生物称作‘前药，。根据具体反义核酸寡聚体的性质，可以使用任意常规方法将ASO施用给宿主，所述方法能够导致希望的靶细胞中靶病毒转录物、病毒基因组量或载量的减少。因而，可以将反义寡聚体掺入到用于治疗性施用的多种制剂中。更具体地，本发明的反义寡聚体可通过与适当的药学上可接受的载体或稀释剂组合制成药物组合物，且可制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂及气雾剂。如此，反义寡聚体的施用可以以多种方式完成，包括口服的、口腔的、直肠的、肠胃外的、腹膜内的、真皮内的、透皮的或气管内的给药等。在药物剂型中，ASO可以单独地施用，或与其它药学活性剂适当结合地以及联合地施用。下述的方法和赋形剂仅仅是示例性的，绝不是限制性的。本文所述的ASO可以与常规的药用载体、赋形剂等(例如，甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、交联羧甲纤维素钠、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等)联合施用。如果需要的话，所述药物组合物也可以含有小量无毒的辅料，诸如润湿剂、乳化剂、增溶剂、PH缓冲剂等(例如，醋酸钠、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸盐、三乙醇胺油酸盐等)。对于口服制剂，ASO可单独应用，或与适当添加剂联合应用，以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与下述添加剂联合应用常规添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁；和如果需要的话，稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和矫味剂。可以如下将ASO制成注射用制剂通过将ASO溶解、悬浮或乳化在水性溶剂或非水溶剂(如植物油或其它相似油、合成脂族酸甘油酯、高等脂族酸酯或丙二醇)中，并且如果需要的话，使用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。例如，可以如下制备药学上可施用的液体组合物将至少一种ASO和任选的药学佐剂溶解、分散或以类似方式分布在载体(例如，水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、二醇类、乙醇等)中，以形成溶液或混悬液。可以制备常规形式的注射剂，作为液体溶液或混悬液，作为乳剂，或呈适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。在这样的肠胃外组合物中含有的ASO的百分比高度地依赖于其具体性质以及ASO活性和受试者的需要。但是，可以采用活性成分占溶液的0. 01%至10%的百分比，如果所述组合物是将在以后稀释至上述百分比的固体，则可以更高。在某些实施方案中，所述组合物包含在溶液中的约0. 2-2%的活性剂AS0。ASO剂可以用于通过吸入来施用的气雾剂制剂中。本发明的ASO可配制到加压的可接受的推进剂中，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。对于吸入递送，可以将ASO配制为液体溶液，混悬液，气雾喷射剂或干粉，并装载到合适的给药用分配器中。存在几种类型的药物吸入装置一喷雾器吸入器、计量剂量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。喷雾器装置会产生高速空气流，其造成治疗剂(它们配制成液体形式)喷洒为雾，所述雾被递 送至患者的呼吸道中。MDI通常是包装了压缩气体的制剂。在致动后，所述装置通过压缩气体释放出量过的量的治疗剂，从而提供施用一定量药剂的可靠方法。在通过DPI装置呼吸过程中，DPI会分配自由流动的粉末形式的治疗剂，所述粉末可以分散在患者的吸气气流中。为了实现自由流动的粉末，用诸如乳糖等赋形剂配制治疗剂。量过的量的治疗剂以胶囊的形式储存，并在每次致动时分配。此外，ASO剂可通过与多种基质(如乳化基质或水溶性基质)混合而制成栓剂。本发明的ASO可通过栓剂经直肠施用。栓剂可包括在体温融化、但在室温固化的赋形剂，如可可脂、碳蜡及聚乙二醇。一般而言，通过用于类似用途的ASO剂的被接受的给药模式中的任一种，施用治疗有效量的提供的ASO剂。反义寡聚体(即，活性成分)的实际量取决于多种因素，诸如要治疗的疾病的严重性、受试者的年龄和相对健康、使用的ASO的功效、给药途径和形式、以及其它因素。所述药物组合物可以每天施用超过I次，诸如每天I次或2次。在具体实施方案中，所述ASO药物制剂每周施用I次或2次，根据需要持续24、36或48周或更长的疗程，以有效地治疗HBV感染，包括减少病毒载量、减少病毒抗原、产生血清转换、支持受试者免疫应答和/或降低HBV DNA水平和正常化丙氨酸转移酶(ALT)水平。可提供用于口服或直肠给药的单位剂型，如糖浆剂、酏剂和混悬液，其中每个剂量单元(例如一茶匙、一汤匙、一个片剂或一粒栓剂)含有预定量的组合物，所述组合物含有一种或多种抑制剂。类似地，用于注射或静脉内给药的单位剂型可包含在组合物中的抑制剂，所述组合物作为在无菌水、生理盐水或其它药学上可接受的载体中的溶液。本文使用的术语“单位剂型”是指，适合作为用于人及动物受试者的单元剂量的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的本发明化合物，其计算为与药学上可接受的稀释齐U、携带者或媒介物联合足可产生希望的作用的量。本发明的新颖单位剂型的规范取决于应用的具体化合物及欲达到的效果和在宿主中与每种化合物相关的药效学。药学上可接受的赋形剂(如媒介物、佐剂、载体或稀释剂)是公众易于获得的。此夕卜，药学上可接受的辅料(如PH调节剂及缓冲剂、张度调节剂、稳定剂、湿润剂等)是公众易于获得的。本领域技术人员会容易地理解，剂量水平可随具体的ASO剂、递送媒介物的性质等而变化。本领域技术人员通过多种方法易于确定给定的ASO的优选剂量。用于施用本文所述的ASO治疗剂的递送方法的实例，以及药物制剂、溶剂化物、水合物、盐和酯的细节，是本领域技术人员众所周知的，且描述在文献中。使用将ASO剂导入靶细胞中的任意方便的方法，可以将有效量的ASO抑制剂导入革巴细胞中。方法包括根据本领域可得到的标准方案，使用诸如lipofectamine、聚阳离子胺(诸如精胺、精脒)等试剂，以及包括电穿孔、显微注射、脂质体包囊和更多的方法。在有些情况下，对于ASO向靶细胞中的摄入而言，没有外源剂是必需的。将有效量的ASO剂导入哺乳动物细胞中，会导致HBV靶基因表达的调节(即降低)，导致HBV载量的减少、HBV DNA的减少、正常化的ALT活性、血清转换、治愈和提高的免疫应答。 最后，制剂和剂量的选择取决于多种因素，诸如给药模式和药品的生物利用度。本发明的方法可以在任意哺乳动物细胞中起作用，其中代表性的目标哺乳动物细胞包括，但不限于下述动物的细胞有蹄类动物(ungulates)或有蹄(hooved)动物,例如，牛、山羊、猪、绵羊等；啮齿类动物，例如，仓鼠、小鼠、大鼠等；兔形目动物，例如，兔；灵长类动物，例如，猴、狒狒、人等；和类似的动物。所述ASO组合物可以有利地与其它抗病毒剂联合地和/或替代地组合和/或使用，所述其它抗病毒剂是治疗剂或预防剂，且不同于主题化合物。所述组合物也可以有利地与药剂联合地组合和/或使用，所述药剂治疗经常与病毒感染(其对本发明的化合物敏感)有关的病症，诸如抗-HCV剂或免疫抑制剂。在某些实施方案中，与主题组合物的联合施用会增强这样的药剂的效能。因此，当与其它抗病毒剂联合地组合或施用时，本发明的化合物在某些实施方案中的使用剂量可以小于当单独使用时预期的量，或小于联合治疗的计算量。本发明的ASO和ASO组合物也可以与增强身体的免疫系统的药剂一起使用，包括低剂量的环磷酰胺、胸腺刺激素、维生素和营养补剂(例如，抗氧化剂，包括维生素A、C、E、￠-胡萝卜素、锌、硒、谷胱甘肽、辅酶Q-IO和紫锥花属)和疫苗，例如，免疫刺激复合物(ISC0M)，其包括组合了抗原的多聚体呈现和佐剂的疫苗制剂。如本领域技术人员会理解的，剂量取决于要治疗的疾病状态的严重性和应答性，和持续数天至数月的疗程，或直到实现治愈或实现疾病状态的减少。通过测量患者体内的ASO活性剂积累，可以计算出最佳剂量方案。最佳剂量可以随单个寡核苷酸的相对功效而变化。一般而言，可以基于在体外和在体内动物模型中发现有效的EC50来估测它。一般而言，剂量是0.01 yg至I g/kg体重，可以每天给药I次或多次，每周I次，每月I次，或每年I次，或甚至每2-10年I次，或连续输注数小时至数个月。基于测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度，可以估测给药的重复率。在成功的治疗以后，可能希望使患者经历维持疗法，以预防疾病状态的复发。更具体地，疗程会持续大约48周，每周给药I次，作为皮下注射，剂量为约0. 01 Ii g/kg体重至约I g/kg体重。本发明的实施方案涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的反义寡聚体作为活性成分。应当理解，根据本发明的药物组合物包括稀释剂，并任选地包含药用载体，且所述药物组合物任选地包含其它化合物，诸如化疗化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、镇痛药、NSAID、麻醉品、抗生素、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物和/或免疫调节化合物。本发明的寡核苷酸可以“原样”使用，或以多种药学上可接受的盐的形式使用。本文使用的术语“药学上可接受的盐”表示这样的盐所述盐保留本文鉴别出的寡核苷酸的希望的生物活性，并表现出微小的不希望的毒理学效应。这样的盐的非限制性实例可以用有机氨基酸和用金属阳离子(诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等)或用从氨、N，N- 二苄基亚乙基-二胺、D-葡糖胺、四乙基铵或亚乙基二胺得到的阳离子形成的碱加成盐形成。在本发明的一个具体实施方案中，所述寡核苷酸可以是前药形式。寡核苷酸(在它们的天然形式时，其通常具有通过磷酸二酯主链连接的单个核苷酸)通常与基本上去质子化的磷酸根氧一起在PH 7存在，所以是带负电荷的分子。因为细胞膜在性质上是亲脂的，与中性的或亲脂的等效物相比，寡核苷酸的细胞摄取经常会减少。一种解决方案是，使用前药方案(参见例如 Crooke, R. M. (1998), Crooke, S. T. Antisense research andApplication. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131,第 103-140 页)。药学上可接受的粘合剂和佐剂也可以构成配制的药物的一部分。本发明的药物组合物包括、但不限于溶液、乳剂和含有脂质体的制剂。这些组合物可以从多种组分制备，所述组分包括、但不限于预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。通过载体介导的递送，可以增强ASO组合物向组织的递送，所述载体包括、但不限于 阳离子型脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树枝状聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、纳米颗粒和微球(Dass, C R. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27) 根据制药工业众所周知的常规技术，可以制备本发明的药物制剂，其可以方便地呈现在单位剂型中。这样的技术包括使活性成分与药用载体或赋形剂相缔合的步骤。一般而言，如下制备制剂使活性成分与液体载体或粉碎的固体载体或二者均匀地且密切地缔合，然后，如果必要的话，使产物成形。本发明的组合物可以配制成许多可能的剂型中的任一种，例如，但不限于、片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂和栓剂。本发明的组合物也可以配制为在水性介质、非水性介质或混合介质中的混悬液。水性混悬液可以另外含有增加混悬液粘度的物质，所述物质包括，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。所述混悬液也可以含有稳定剂。本发明的化合物也可以与活性药品相缀合，所述活性药品例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药、抗细菌药或抗生素和抗癌药。另外，本发明的ASO序列可以与药品一起施用，或与药品联合地单独地施用，作为联合治疗，所述药品可用于治疗癌症、炎症、疼痛、细菌、真菌感染和/或寄生物感染、酒精中毒、物质滥用、糖尿病，或者所述药品可用于治疗其它病毒感染诸如HIV、HCV等。乙型肝炎病毒感染存在两种一般类型急性的和慢性的。已经经历HBV感染的受试者也可以恢复，并变成无症状的携带者。当暴露于乙型肝炎病毒的人开始出现病毒性肝炎的征象和症状时，发生急性乙型肝炎。称作潜伏期的该时段平均是90天，但是可以短至45天，或长至6个月。对于大多数人而言，该感染会造成轻度至中度的不适，但是会自行消失，因为身体的免疫应答会成功地战胜病毒。但是，有些人，特别是免疫系统受损的人，诸如遭受AIDS、接受化学疗法、服用免疫抑制药物或服用类固醇的人，具有非常严重的问题(作为急性HBV感染的结果)，并发展成更严重的病症，诸如暴发性肝衰竭。当人最初遭受急性感染、但是随后不能战胜感染时，发生慢性乙型肝炎。该疾病变成慢性还是完全消退，主要取决于受感染的人的年龄。约90%的在出生时受到感染的婴儿会发展成慢性疾病。但是，随着人老化，慢性感染的风险降低，所以20%-50%的儿童和小于10%的少年或成年人会从急性感染发展成慢性感染。慢性HBV感染是本发明的实施方案的主要治疗目标，尽管本发明的ASO组合物也能够治疗HBV相关病症，诸如炎症、纤维化、肝硬化、肝癌、血清性肝炎和其它。如图I所示，总结了 HBV感染的自然史，如果患者在幼童时期接触HBV，该儿童在将来形成免疫耐受性的机会是95%，且所述病症会发展成慢性肝炎；然而，如果成年患者接触HBV,所述病症将来变成慢性的机会仅是5%。慢性HBV感染存在4个阶段。第一阶段是免疫耐受期，这时表现出微小的肝脏纤维化和炎症，伴有高HBV DNA和正常的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。第二阶段是免疫清除期，这时肝脏的活动性炎症可通过组织学检查观察到，其还可以包括波动的ALT活性水平和波动的HBV DNA水平。随后可能是第三个不活动的带病原状态阶段，这时受感染的受试者可能在组织学检查中表现出轻度肝炎和微小纤维化。也报道了第四个阶段，称作HBV的复活。该最后一个阶段的特征在于，肝脏的活动性炎症，这通过活组织检查观察到，尽管乙型肝炎e抗原(HBeAg)阴性和抗-HBeAg阳性。慢性HBV疾病具有几种类型。第一种类型称作HBeAg阳性的或“野生型”HBV感染，其被表征为抗-HBeAg阴性的，且表现出〉20,000 IU/mL O IO5拷贝/mL)的HBV DNA的量。第二种类型称作HBeAg阴性的或“突变型核心"HBV感染，其被表征为抗-HBeAg阳性的，且表现出>2，000 IU/mL O IO4拷贝/mL)的HBV DNA的量。在图2和3中，显示了这两类慢性HBV感染和历史上推荐的治疗方案。图2显示了表现出HBeAg阳性的或“野生型’MBV感染的患者的分类和历史上推荐的治疗。在左边，是具有小于20，000 IU/mL (<105拷贝/mL)的HBV病毒DNA水平的患者，其中没有推荐治疗，但是进行监测，以确保HBV DNA水平没有增加。在右边，是具有>20，000IU/mL的HBV病毒DNA水平的患者。对于这些患者，每3_12个月监测具有正常丙氨酸转移酶(ALT)活性的患者的ALT活性的任何变化，并考虑进行活组织检查(取决于年龄)。治疗表现出升高的ALT活性的患者至血清转换，尽管实际上，现有的HBV治疗剂使小于20-30%的患者实现了血清转换。目前推荐的HBV治疗剂包括恩替卡韦(ETV)和富马酸替诺福韦双索酯(TDF)和peg-干扰素，作为首选。 图3显示了表现出HBeAg阴性的或“突变型核心”HBV感染的患者的分类和历史上推荐的治疗。在左边，是具有小于2，000 IU/mL (<104拷贝/mL)的HBV病毒DNA水平的患者，其中没有推荐治疗，但是进行监测，以确保JfflV DNA水平没有增加。在右边，是具有彡2，000 IU/mL的HBV病毒DNA水平的患者。对于这些患者，监测具有正常丙氨酸转移酶(ALT)活性的患者的ALT活性的任何变化，并考虑进行活组织检查。治疗表现出升高的ALT活性的患者至HBsAg血清转换，如果可能的话，使用目前推荐的HBV治疗剂，包括恩替卡韦(ETV)和富马酸替诺福韦双索酯(TDF)和peg-干扰素，作为首选。遭受急性HBV感染的患者会针对病毒抗原产生剧烈的、多克隆的和多特异性的细胞毒性的T淋巴细胞(CTL)应答，而慢性感染的患者具有弱的或不可检测的CTL应答。当活化弱的HBV-特异性的免疫应答(其强度足以破坏HBV感染的肝细胞)时，发生肝炎。关于引起T细胞低应答性或耐受性的机理知之甚少，但是有人认为，它可能涉及下述机理阴性选择(新生儿);免疫学忽略；诸如调节性T细胞(Tregs)等共刺激分子的周边无反应性或缺少；耗尽(PD-1的增量调节)。所有这些提议的机理的一个共同因素是，在患者中持续的高抗原水平。HBV抗原HBeAg是一种分泌型、非颗粒形式的HBV核心蛋白。HBV抗原HBeAg和HbcAg共有基本氨基酸序列，所以表现出在T细胞水平的交叉反应性。病毒装配或复制不需要HBeAg，尽管研究表明，慢性感染的建立可能需要它们。HBeAg-阴性突变体对新生儿的感染经常导致暴发性急性感染，而不是慢性HBV感 染(Terezawa等人(1991) Pediatr. Res. 29:5),而WHeAg-阴性突变体对幼土拨鼠的感染会导致远远更低的慢性WHV感染率(Cote等人(2000) Hepatology 31:190)。HBeAg可能通过灭活核心特异性的T细胞(通过删除或克隆无反应)而起耐受原的作用(Milich等人(1998) J. Immunol. 160:8102)。在抗病毒疗法和HBeAg血清转换以后，在HBV病毒载量和抗原的减少与T细胞对抑制性受体程序化死亡-I (PD-1 ;也称作roCDl，是活化的T细胞的一种负调节剂)的表达的降低之间存在正相关(Evans等人(2008) Hepatology 48:759)。HBV表面抗原或HBsAg是传染性的HBV病毒颗粒的包膜蛋白，但是也作为非传染性的颗粒分泌，其血清水平是HBV病毒颗粒的1000倍。受感染的人或动物中的HBsAg的血清水平可以高达 1000 li g/mL(Kann 和 Gehrlich (1998) Topley & Wilson’s Microbiologyand Microbial Infections,第9版.745)。在急性HBV感染中，HBsAg在血清中的半衰期(或血清t,)是8. 3天(Chulanov等人(2003) J. Med. Virol. 69: 313)。骨髓树突细胞对HBsAg的内化，会抑制共刺激分子(即B7)的增量调节，并抑制T细胞刺激能力(den Brouw等人(2008) Immunology 126:280)，在HBsAg存在下，来自慢性感染的患者的树突细胞也表现出共刺激分子的表达、IL-12的分泌和T细胞的刺激中的缺陷(Zheng等人(2004) J.Viral Hepatitis 11:217)。来自CHB患者的HBsAg特异性的⑶8细胞表现出改变的四聚体结合。这些⑶8细胞不是无反应性的，但是可能具有赋予部分耐受性或忽略的TCR拓扑学(Reignat等人(2002)J. Exp. Med. 195:1089)。此外，在Peg-IFNa 2a治疗期间，在第24周时〉I log的血清HBsAg降低，具有持久的病毒学应答(SVR——定义为在治疗后I年时通过PCR不可检测的HBV DNA)的高预测值(92%) (Moucari 等人(2009) Hepatology 49:1151)。由于重叠的传播途径，许多人已经暴露于乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)，更少的人群是两种病毒的慢性感染者，特别是在诸如亚洲等HBV地方性流行的地区。据估测，多达10%的HCV感染者也可能具有HBV，同时20%的HBV感染者可能受到HCV的共同感染。但是，尚未较好地研究在HBV-HCV共同感染的个体中的乙型肝炎或乙型肝炎的治疗。HCV和HBV似乎抑制彼此的复制(尽管并非所有研究都已经观察到该相互作用)的事实，使得治疗复杂化。因此，完全抑制HBV的治疗可能潜在地允许HCV再度出现，或反之亦然。因此，本发明的ASO化合物可以有利地用于治疗被HBV和HCV感染的患者。丙型肝炎(HCV)的示例性的治疗选项包括干扰素，例如，干扰素a _2b、干扰素a _2a和干扰素alphacon-1。使用聚乙二醇化的干扰素(连接到聚乙二醇部分上的干扰素，所述部分会显著改善它的药代动力学特性)，可以实现更低频率的干扰素给药。还已经证实，干扰素a _2b(聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)和利巴韦林的联合治疗对于某些患者群体而言是有效的。目前处于开发中的其它药剂包括HCV RNA复制抑制剂(例如，ViroPharma的VP50406系列)、HCV反义剂、HCV治疗疫苗、HCV蛋白酶抑制剂、HCV解螺旋酶抑制剂和HCV抗体治疗齐[J(单克隆的或多克隆的)。本发明的实施方案提供了与SEQ ID NO: 1_13中的任一个基本上互补的ASO化合物，它们用于治疗被HBV和HCV感染的受试者，其中所述ASO化合物与HCV剂联合施用。所述HCV剂可以在与ASO化合物相同的药物制剂中施用，或可以在单独的制剂中施用。此外，所述HCV化合物可以与ASO HBV化合物同时地施用，或可以单独地施用，使得HBV ASO化合物和HCV剂各自的剂量在患者体内在时间上重叠。在有关的实施方案中，所述HCV剂可以选自干扰素a-2b、干扰素a _2a和干扰素alphacon-1 (聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)；利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂(例如，ViroPharma的VP50406系列);HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；和HCV抗体治疗剂(单克隆的或多克隆的)。在另一个实施方案中，本发明的HBV ASO化合物可以与第二种HBV治疗剂联合地 施用给被HBV感染的患者，其中所述第二种HBV治疗剂可以在与HBV ASO化合物相同的药物制剂中施用，或可以在单独的制剂中施用。所述第二种HBV治疗剂可以可以与ASO HBV化合物同时地施用，或可以单独地施用，使得HBV ASO化合物和HBV治疗剂各自的剂量在患者体内在时间上重叠。在有关的实施方案中，所述HBV治疗剂可以选自干扰素a _2b、干扰素a -2a和干扰素alphacon-1 (聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二种HBV反义化合物；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韦；替诺福韦；替比夫定(LdT);阿德福韦JPHBV抗体治疗剂(单克隆的或多克隆的)。图4是HBV转录的示意图，它显示了由HBV基因组编码的主要转录物(包括前核心蛋白和核心蛋白、RNA-和DNA-依赖性的DNA聚合酶(逆转录酶活性)、X蛋白和大、中和小S蛋白以及聚腺苷酸尾巴)、转录物的相对长度以及大、中和小S蛋白转录物的重叠区。也指示了 HBV DNA的+和-链。图5显示了对比来自HBV的多个基因型的基因组DNA的序列之间的同一性百分比的计算生物学分析，其按照HBV基因组区域进行绘制。如图5所示，鉴别出了在所述序列中具有100%同一性的多个区域，特别是聚合酶和大、中和小S蛋白转录的区域。图6是不同地理学HBV基因型的表。如该表所示，存在8个已经分类的不同的地理学HBV基因型，它们的基因组DNA相差大约8%。除了它们的地理学分布差异之外，HBV基因型也可以在临床史和它们对干扰素疗法的应答方面存在差异。使用扩展的计算生物学分析，与在图5中所例证的类似，分析了约2300个序列，并令人惊讶地鉴别出13个在不同基因型之间具有>95%同一性的序列。该分析已经允许设计单个反义寡聚体序列，它们各自靶向在多种转录产物和HBV基因组区域(在基因型之间)中具有>95%同一性的保守序列。因而，发明人已经令人惊讶地且意外地鉴别出单个ASO序列关闭多种转录产物的方法，且相同的单个ASO也在所有地理学HBV基因型之间具有增加的活性。这样的方案考虑到一种药物组合物，所述组合物包含单个ASO序列作为活性化合物，且所述组合物具有比现有HBV疗法极大增加的效能，将严重地限制HBV株的形成抗性的能力，并将导致90%或更大的病毒载量减少，这通过HBV DNA和HBV抗原HBeAg和HBsAg的存在予以证实。本发明的药物组合物因而将为遭受慢性HBV感染的患者提供一种改善的治疗性处理，所述处理能够提供完全血清转换，并最终导致慢性HBV感染的完全治愈。这样的方案也会减轻HBV相关肝病，诸如肝硬化、肝细胞癌(HCC)和纤维化和炎症，导致更少的肝移植需求，并帮助预防死于肝病。另外，除了极大提高的病毒载量减少以外，本发明的ASO会提供其它益处。认为HBeAg具有免疫抑制作用，认为HBsAg会促进T细胞耗 竭。因此，使用本发明的ASO的治疗，会通过降低HBeAg和HBsAg水平来支持患者的免疫应答，允许免疫系统更好地控制感染。也预见到，肝中HBV抗原呈递的减少，将有助于使HBV感染发作(flare-up)的程度最小化(免疫系统恢复的结果)，它们都会增加完全治愈慢性HBV感染的机会。提供了用于减少靶细胞中的乙型肝炎病毒基因组量的方法和组合物。在主题方法中，以足以减少靶细胞中病毒基因组的量的方式，抑制几种特异性HBV靶蛋白中的任一种的表达，例如，通过将反义RNA抑制剂导入靶细胞中。也提供了用于实践主题方法的药物组合物。主题发明的实施方案可以用于多种用途，包括治疗遭受病毒介导的疾病状况(例如，HBV介导的疾病状况)的受试者。这样的病症包括、但不限于肝的纤维化和炎症、肝硬化和肝细胞癌(肝癌)。本发明的一个实施方案提供了一种反义寡聚体(AS0)，其用于治疗哺乳动物(包括人类)的HBV感染，其中所述ASO与SEQ ID NO: 1_13中的任一个基本上互补，且可以有效地降低病毒载量或抗原水平至少40%、更优选至少50%、更优选至少60%、更优选至少70%、更优选80%和最优选90%。所述ASO可以包含至少2个修饰的核苷，包括锁定的核酸(LNA)单元，其中所述LNA单元具有2’ 0-烷基-4’ C连接，导致在修饰的LNA核苷掺入ASO序列中的ASO位置处的二环糖。本发明的反义寡聚体是单链寡核苷酸，其包含核苷类似物(诸如LNA)或核苷酸类似物(诸如硫代磷酸酯)，它们形成反义寡核苷酸的连续核酸序列的一部分。反义寡聚体的序列由连续的核苷酸或核苷序列组成。本文使用的术语“反义”是指这样的核酸寡核苷酸序列当从5’ -端至3’ -端看时，其包含与DNA的有义链基本上互补的序列，即，所述反义寡核苷酸具有与DNA的有义链(也称作编码链)相反的序列朝向(从5’至3’ _)，所以所述反义寡聚体与给定的DNA编码区或基因的有义链基本上互补。在本发明的上下文中，与术语“寡聚体”可互换地使用的术语“寡核苷酸”(或简称“寡物”)表示，通过2个或更多个核苷酸的共价连接形成的分子。当用于本发明的寡核苷酸(也称作单链寡核苷酸)的上下文中时，在一个实施方案中，术语“寡核苷酸”可能具有例如10-26个核苷酸，更具体地，本发明的寡核苷酸可能具有12-20个核苷酸，或更具体地
14-18个核苷酸。术语“核苷酸”表示这样的分子其具有3种组分，即杂环含氮碱基(有时称作核苷碱基，包括嘧啶和嘌呤碱基)、戊糖(核糖或脱氧核糖)和磷酰基(磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯等)，实例包括但不限于=DNA核苷酸诸如脱氧腺苷_5’_单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷-5’- 二磷酸(dGDP)、脱氧胸苷-5’ -三磷酸(dTTP)和脱氧胞苷-5’ -三磷酸(dCTP)，和RNA核苷酸诸如腺嘌呤-5’ -单磷酸(AMP)、胞苷-5’ - 二磷酸(⑶P)、肌苷-5’ -单磷酸(IMP)、尿苷-5’ -三磷酸(UTP)和鸟苷-5’ -三磷酸(GTP)。本文使用的核苷酸包括磷酸酯类似物诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、H-膦酸酯或烷基膦酸酯类似物。应当认识到，在某些方面，术语核苷碱基也可以用于表示天然存在的或非天然存在的核苷酸一在这方面，术语核苷碱基和核苷酸可以在本文中可互换地使用。核苷碱基包括、但不限于鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5，6- 二氢尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胸腺嘧啶、N7-甲基鸟嘌呤、N7-甲基肌苷、5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶以及其它。本文提供的寡聚体化合物可以包含一种或多种单体，包括核苷或核苷酸，其具有修饰的糖部分。例如，可以以许多方式修饰核苷的呋喃糖基糖环，所述方式包括、但不限于添加取代基、桥接2个未成对的环原子以形成锁定的核酸(LNA)。在某些实施方案中，寡聚体化合物包含一个或多个单体，所述单体是LNA。在某些这样的实施方案中，LNA包括、但不限于如下描绘的(A) a-L-亚甲基氧基(4’ -CH2_0_2’ )LNA、(B) 3-D-亚甲基氧基(4，-CH2-0_2，) LNA、(C)亚乙基氧基(4，-(CH2)2H ) LNA、(D)氨基氧基(4，-CH2-O-N (R)-2’ ) LNA 和(E)氧基氨基(4，-CH2-N (R)-0-2 ’ ) LNA。
权利要求
1.一种反义寡聚体或其盐、溶剂化物、水合物或酷，其用于减少哺乳动物细胞或生物体中的こ型肝炎病毒DNA和HBV抗原的量，其中所述反义寡聚体是长度为10-26个核苷的连续序列,且包含如式I所示的序列5’ -LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-N1-P-LNAr-P-LNArS,(式 I) 其中 LNA是锁定的核酸； P是选自下述的核苷间连接磷酸ニ酷、磷酸三酷、硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酷、H-膦酸酷或烷基膦酸酯连接，所述连接是在LNA和邻近的N之间，或在N和邻近的N之间，或在N和邻近的LNA之间，或在LNA和邻近的LNA之间，从式(I)序列的5’至3’方向；且其中 N选自G、C、A、T、U或Z核苷单元； η和r和P和q各自独立地是选自1、2或3的整数； I和m各自独立地是1-22的整数；且 其中Z选自肌苷、N7-甲基肌苷、N7-甲基胍、5-甲基尿苷、5-甲基-胞苷、5-氟尿苷、5-氟胸苷、黄苷、ニ氢尿苷、假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、7-甲基-7-脱氮鸟苷、7-乙基-7-脱氮鸟苷、N4-甲基胞苷、N4-こ基胞苷。
2.根据权利要求I或2所述的反义寡聚体，其中所述寡聚体的至少4个核苷单元是LNA単元，且其中存在于连续核苷序列的核苷单元之间的至少2个核苷间连接P是硫代磷酸酯核苷间连接，且所述LNA是具有2, -O-烷基-4' C连接的锁定的核酸単元，其中所述烷基是取代的或未取代的(；_6烷基。
3.根据权利要求I或2所述的反义寡聚体，其中存在于连续核苷酸序列的核苷酸单元之间的所有核苷酸间连接是硫代磷酸酯核苷酸间连接。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体包含与SEQIDNO. 1-13中的任ー个基本上互补的序列。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体基本上包含SEQ ID NO. 14-22中的任ー个的序列。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体包含与SEQIDNO. 1-13中的任ー个基本上互补的序列，且其中所述こ型肝炎病毒是人こ型肝炎病毒，且所述细胞或生物体是人。
7.根据权利要求5所述的反义寡聚体，其中n、p、r和q各自独立地是I或2，且I和m各自独立地是2、3、4、5或6。
8.根据权利要求7所述的反义寡核苷酸，其中n、p、r和q各自独立地是I，且I和m各自独立地是6。
9.根据权利要求5、7或8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述序列进ー步选自SEQID NO 14、16、16 或 20 中的任ー个。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的反义寡聚体，其中所述HBV抗原是HBsAg。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的反义寡聚体，其中所述HBV抗原是HBeAg。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的反义寡聚体，其中所述こ型肝炎病毒选自人地理学基因型中的任ー种A (欧洲西北部、北美洲、中美洲)；B (印度尼西亚、中国、越南)；C(东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南);D (地中海地区、中东、印度);E (非洲);F (美洲土著人、波利尼西亚);G (美国、法国)；或H (中美洲)。
13.ー种用于治疗哺乳动物的こ型肝炎病毒感染的药物制剂，其包含有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的核酸寡聚体或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或酯和药学上可接受的稀释剂。
14.ー种用于治疗哺乳动物的こ型肝炎病毒的药物制剂，其包含有效量的根据权利要求1-13中任一项所述的核酸寡聚体或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或酯和药学上可接受的稀释剂。
15.ー种根据权利要求1-14中任一项所述的用于治疗哺乳动物的こ型肝炎病毒感染的药物制剂，其另外包含药学上可接受的载体。
16.ー种用于治疗具有こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相关病症的哺乳动物的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1-11中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物施用给有此需要的哺乳动物，从而治疗所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相关病症。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述哺乳动物是人，其中所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相关病症是来自人こ型肝炎病毒的こ型肝炎病毒感染。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的用于治疗具有こ型肝炎病毒感染的哺乳动物的方法，其中所述人こ型肝炎病毒选自人地理学基因型中的任ー种A (欧洲西北部、北美洲、中美洲)；B (印度尼西亚、中国、越南)；C (东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南)；D(地中海地区、中东、印度);E (非洲);F (美洲土著人、波利尼西亚);G (美国、法国);或H (中美洲)。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人，且其中所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相关病症是人こ型肝炎病毒相关病症。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述人こ型肝炎病毒相关病症选自下述的任ー种黄疸、肝癌、肝炎症、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、弥散性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征或血清性肝炎。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，所述方法另外包括与额外治疗剂组合地施用反义寡聚体，其中所述反义寡聚体和所述额外治疗剂在単一制剂中一起施用，或在不同制剂中分开施用，且其中所述核酸寡聚体和所述第二种治疗剂的施用并行地或相继地进行。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述额外治疗剂选自HBV剂、HCV剂、化学治疗齐U、抗生素、止痛剂、非类固醇类抗炎(NSAID)剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗恶心剂、止泻剂和免疫抑制剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述额外HBV剂选自干扰素a_2b、干扰素a -2a和干扰素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二种反义寡聚体；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韦；替诺福韦；替比夫定(LdT);阿德福韦；和HBV抗体治疗剂(单克隆的或多克隆的)。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述额外HCV剂选自干扰素a_2b、干扰素a -2a和干扰素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)；利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂；HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；和HCV单克隆或多克隆抗体治疗剂。
25.一种用于减少受こ型肝炎病毒感染的哺乳动物中的HBV DNA的量和/或HBV抗原的存在的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的反义寡核苷酸或有效量的根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物施用给有此需要的哺乳动物，从而与治疗之前哺乳动物中HBV DNA的量和/或HBV抗原的存在相比，减少所述こ型肝炎病毒感染和所述こ型肝炎抗原。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物是人，且其中所述こ型肝炎病毒是人こ型肝炎病毒。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述人こ型肝炎病毒选自人地理学基因型中的任一种A (欧洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亚、中国、越南);C (东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南)；D (地中海地区、中东、印度)；E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亚)；G (美国、法国)；或H (中美洲)。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中与施用反义寡聚体之前的量相比，DNA的量减少了 90%。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述HBV抗原是HBsAg。
30.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述HBV抗原是HBeAg。
31.根据权利要求25-27或29-30中任一项所述的方法，其中HBV抗原的存在被充分地減少以导致血清转换，所述血清转换定义为如果监测HBeAg作为血清转换的决定因子，血清HBeAg不存在+血清HbeAb存在，或者定义为如果监测HBsAg作为血清转换的决定因子，血清HBsAg不存在，所述存在和不存在由商业ELISA系统的目前可得到的检测限确定。
32.根据权利要求25所述的方法，所述方法另外包括与额外治疗剂组合地施用反义寡聚体，其中所述反义寡聚体和所述额外治疗剂在単一制剂中一起施用，或在不同制剂中分开施用，且其中所述核酸寡聚体和所述第二种治疗剂的施用并行地或相继地进行。
33.根据权利要求28所述的方法，其中所述额外治疗剂选自HBV剂、HCV剂、化学治疗齐U、抗生素、止痛剂、非类固醇类抗炎(NSAID)剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗恶心剂、止泻剂和免疫抑制剂。
34.根据权利要求29所述的方法，其中所述额外HBV剂选自干扰素a_2b、干扰素a -2a和干扰素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二种反义寡聚体；HBV治疗疫苗；HBV预防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韦；替诺福韦；替比夫定(LdT);阿德福韦；和HBV抗体治疗剂(单克隆的或多克隆的)。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述额外HCV剂选自干扰素a_2b、干扰素a -2a和干扰素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)；利巴韦林；HCV RNA复制抑制剂HCV反义剂；HCV治疗疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解螺旋酶抑制剂；和HCV单克隆或多克隆抗体治疗剂。
36.一种用于促进受こ型肝炎病毒感染的哺乳动物的血清转换的方法，所述方法包括 将治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物施用给受こ型肝炎病毒感染的哺乳动物； 监测HBeAg + HBeAb在哺乳动物血清样品中的存在；或监测HBsAg在哺乳动物血清样品中的存在，以致干，如果监测HBeAg作为血清转换的决定因子，则血清样品中HBeAg的不存在+HbeAb的存在，或者，如果监测HBsAg作为血清转换的决定因子，则血清样品中HBsAg的不存在，指示哺乳动物的血清转换，所述存在和不存在由商业ELISA系统的目前可得到的检测限确定。
37.根据权利要求16、25或36中任一项所述的方法，其中施用选自ロ服、口腔的、直肠的、肠胃外的、腹膜内的、真皮内的、透皮的或气管内的给药。
全文摘要
公开了反义寡聚体，其可用于调节乙型肝炎病毒感染，和用于治疗动物(包括人类)的乙型肝炎病毒(HBV)和乙型肝炎病毒相关病症。更具体地，公开了用于治疗动物的HBV的具有修饰的核苷酸的反义寡聚体，更具体地，所述反义寡聚体包含2′O-4′C-亚甲基桥接的糖类和具有其它2’O-4’C桥接的糖类的核苷酸，也称作锁定的核酸(LNA)，其用于治疗动物的HBV，更具体地，用于治疗人类的HBV。
文档编号A61K31/7115GK102762215SQ201080046632
公开日2012年10月31日 申请日期2010年10月15日 优先权日2009年10月16日
发明者R.哈马泰克 申请人:葛兰素集团有限公司