专利名称：预靶向试剂盒、方法和其中使用的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于靶向的医学成像和/或治疗的预靶向方法(pretargeting method)，其中使用彼此显示出生物正交(bio-orthogonal)反应性的非生物(abiotic)反应性化学基团。本发明还涉及含有至少一种预靶向探针(pre-targeting probe)和至少一种效应物探针(effector probe)的预靶向试剂盒(kit)，其中所述预靶向探针包含主要靶向部分和第一生物正交反应性基团，和其中所述效应物探针包含效应物部分，例如标记物或药学活性化合物，和第二生物正交反应性基团。本发明还涉及在上述方法和试剂盒中使用的预靶向试剂。本发明特别地涉及核成像和放射疗法。
背景技术：
在医学诊断和治疗的许多领域，希望选择性地将试剂，例如治疗剂(药物)或诊断 (例如成像)剂递送到受试者(subject)例如病人体内的特定位点或有限区域。器官或组织的活性靶向通过所希望的活性部分(例如对比增强剂或细胞毒素化合物)对靶向结构的直接或间接结合实现，其与细胞表面结合或促进在感兴趣的靶位点处的细胞摄入。用于靶向此类试剂的靶向部分典型地是对细胞表面靶(例如膜受体)、结构蛋白(例如淀粉样斑)或细胞内靶(例如RNA、DNA、酶、细胞信号通路)具有亲和性的结构。这些部分可以是抗体(片段)、蛋白质、适体(aptamers)、寡肽、寡核苷酸、寡糖以及肽、拟肽 (peptoids)和已知在特定疾病或障碍处积累的有机药物化合物。作为选择，对比/治疗剂可以靶向代谢途径，其在疾病(例如感染或癌症)期间表达升高，例如DNA、蛋白质和膜合成和碳水化合物摄入。在患病组织中，上述标志物可以将患病细胞从健康组织区分并提供早期检测、特异诊断和(靶向的)治疗的独特可能性。通常对于成功的分子成像/治疗剂和特别对于核成像/治疗剂一个重要标准是它们呈现高靶摄取，同时显示出从非靶组织和从血液的快速清除(通过肾脏和/或肝胆体系)。 但是，这经常存在问题例如，人中的成像研究已经显示，在肿瘤位置处经放射标记的抗体在M小时内可达到最大浓度，但需要另外几天在循环体系中的所述经标记的抗体的浓度才下降到低至足以发生成功成像的水平。在靶组织中的缓慢或不充分积累以及从非靶区域缓慢清除所带来的这些问题(特别是对于核成像和治疗)已经导致预靶向方法的应用。预靶向是指在靶向方法中的步骤，其中向主要靶(例如细胞表面)提供预靶向探针。后者包括次要靶，其最后将通过装备有次级靶向部分的进一步的探针(所述效应物探针)进行靶向。这样，在预靶向中，将预靶向探针结合到主要靶。所述预靶向探针还携带次级靶， 其促进对诊断(成像)和/或治疗剂，所述效应物探针，的特异性结合。在形成所述预靶向探针的结构已经定位在靶位点处之后(花费时间例如M小时)，如果自然清除不充分，则可以使用清除剂从血液除去过量的部分。在第二培育步骤(优选采取较短的时间，例如1-6小时) 中，所述效应物探针通过它的次级靶向部分结合到所述(预)结合的预靶向探针。所述次级靶(存在于所述预靶向探针上)和所述次级靶向部分(存在于所述效应物探针上)应该以高特异性和高亲和性快速结合，并且在体内应该是稳定的。对于成像预靶向的一般概念在图1中绘出。在这里，所述效应物探针是包含用于成像模式的可检测标记物的成像探针。所述效应物探针通过其次级靶向基团结合到所述 (预)结合的预靶向探针。次级靶/次级靶向部分对的一般例子是生物素/抗生蛋白链菌素或抗体/抗原体系。为了有效，所述效应物探针必需快速从体内排出(例如通过肾脏)以提供所希望的具有相对低的非靶积累的高肿瘤积累。因此，这些探针通常很小。在核成像和放射疗法中，预靶向的概念具有进一步的益处，因为花费时间的预靶向步骤可以不必使用放射性核素实施，而使用放射性核素的次级靶向步骤能够更快地实施。后者使得能够使用较短寿命的放射性核素，具有将对病人的放射剂量最小化的优点，例如使用PET试剂代替SPECT试剂。此外，通常该方法有利于通用对比剂的使用。通常在生物学中(如抗体-抗原)和特别在预靶向中(生物素-抗生蛋白链菌素、抗体/半抗原、反义寡核苷酸)实施高度选择性相互作用的实体非常大。因此，使用肽和小有机部分作为主要靶向基团的预靶向，以及代谢成像和细胞内靶成像，由于次级靶的尺寸使得小主要基团的使用毫无意义而仍然无法实现。而且，现有的预靶向体系被与它们的生物特性相关的因素所限制。生物素是内源分子，并且它的缀合物(conjugates)能够通过血清酶生物素酶断开。当使用反义预靶向时，所述寡核苷酸会受到RNAse和DNAse的攻击。蛋白质和肽也经历自然分解途径。这些相互作用可被它们的非共价和动态特性以及有限的靶上驻留时间进一步削弱。因此，预靶向中加入两种组分之间的时间是有限的，这可能导致并非最优的靶对非靶比。而且，内源性生物素与生物素缀合物竞争抗生蛋白链菌素结合。最后，抗生蛋白链菌素是高度免疫原性的。近来的一个发展是避免与仅基于天然/生物靶向结构(即生物素/抗生蛋白链菌素、抗体/半抗原、反义寡核苷酸)的预靶向相关的缺点。在这方面，可以参考作为用于靶向的医学成像和/或治疗的预靶向方法公开的WO 2006/038185，其中利用了对彼此显示出生物正交反应性的非生物反应性化学基团。在该参考文献中，生物正交反应基团是施陶丁格连接反应(Staudinger ligation)中的反应参与者，即叠氮化物和膦。所描述的在预靶向中作为耦合化学选择施陶丁格连接反应导致了可利用这样的反应性参与者其是非生物的，在生理条件下形成稳定的加合物，以及仅彼此识别，同时忽略它们的细胞/生理环境(即它们是生物正交性的)。在预靶向方法中，关于利用对彼此显示出生物正交反应性的非生物反应性化学基团的另一参考文献是WO 2007/039858。在这里，所述生物正交反应性基团是[3+2]叠氮化物-炔环加成中的反应参与者。Neal K. Devaraj> Ralph Weissleder 禾口 Scott Hilderbrand 在 Bioconjugate Chem. 2008，19，2四7-2299中描述了另一类型的耦合化学。这涉及到生物正交四嗪环加成对活细胞标记的应用。在这里，反应参与者是3-(对苄基氨基)-1，2，4，5-四嗪和降冰片烯，即(IS, 2S, 4S)-双环[2，2，1]庚-5-烯-2-基乙酸，其经历Diels-Alder环加成接着经历逆Diels-Alder反应，其中释放双氮(N2)。这种耦合化学也称为逆电子需求(inverseelectron-demond)Diels-Alder反应。提及的是通过用降冰片烯标记的单克隆抗体曲妥珠单抗(赫塞汀)预靶向人乳腺癌SKBR3细胞，接着用与近顶荧光探针VT680连接的四嗪标记所述细胞。尽管有用，但上述类型的耦合化学仍在经历进一步的改进。尤其是需要相对高的反应物浓度的情况。特别地，这意味着为了充分地与预靶向探针结合，所述效应物探针需要相对长的循环时间和/或高浓度。希望能够降低所必需的效应物探针的浓度，同时保持上述生物正交预靶向方法的益处。此外，特别地当涉及核成像和放射疗法中应用时，希望存在快速和有效的生物正交耦合化学。
发明内容
为了更好地满足上述愿望，本发明一方面提供了用于靶向的医学成像和/或治疗的试剂盒，其包含至少一种预靶向探针和至少一种效应物探针，其中所述预靶向探针包含主要靶向部分和第一生物正交反应性基团，和其中所述效应物探针包含效应物部分(例如标记物或药学活性化合物)和第二生物正交反应性基团，其中所述第一和第二生物正交反应性基团的任一个是亲双烯体，而所述第一和第二生物正交反应性基团中的另一个是二烯，其中所述亲双烯体是满足式(1)的8元环亲双烯体
F 2 R2 /一\
R2CCR2
I I ⑴
R2C^ 乂 CR2 XC^=CY
其中每个R独立地代表H，或至多六次代表选自由以下组成的组的取代基烷基、0-烷基、S-烷基、F、Cl、Br、I、S02、N02、NR，R”(其中R，和R”各自独立地是H或烷基)、C(=0)0 烷基、C(=0)0芳基、CONR，R”(其中R，和R”各自独立地是H、芳基或烷基)、OCO烷基、OCO 芳基、NR，CO烷基(其中R，是H或烷基)、NR，CO芳基(其中R，是或烷基)、NR，C (=0)0烷基 (其中R’是H或烷基)、NR’ C(=0) 0芳基(其中R’是H或烷基)、0C0NR’烷基(其中R’是H或烷基)、0C0NR’芳基(其中R’是H或烷基)、NR’ CONR”烷基(其中R’和R”各自独立地是H或烷基)、NR，CONR”芳基(其中R，和R”各自独立地是H或烷基)、NR，CSNR”烷基(其中R，和 R”各自独立地是H或烷基)和NR，CSNR”芳基(其中R，和R”各自独立地是H或烷基);其中至少一个R包含在，任选地通过间隔体，至所述预靶向探针或效应物探针的连接体部分中， 并且其中X和Y各自独立地代表H或选自由以下组成的组的取代基烷基、0-烷基、S-烷基、F、Cl、Br、I、S02、N02*NRR，(其中R和R’各自独立地是H或烷基)，或一起形成键；并且其中选择所述二烯从而能够通过经历Diels-Alder环加成接着经历逆Diels-Alder反应与所述亲双烯体反应。另一方面，本发明提供了预靶向方法，以及在其中使用的预靶向试剂，和其中使用所述试剂盒的靶向的医学成像或疗法。再一方面，本发明是满足式(1)的化合物，其用于动物或人类中的预靶向方法中。
将就特定的实施方案并参考某些附图描述本发明，但本发明并不受这些所限制而只由权利要求限制。权利要求中的任何附图标记都不应解释为限制范围。所描述的附图仅仅是示意性的而非限定性的。在所述附图中，出于说明目的一些要素的尺寸可能被夸大并且不按比例画出。在本说明书和权利要求中当使用术语“包含”时，其并不排除其它要素或步骤。当涉及单数名词使用不定冠词或定冠词例如“a”或“an”、“the”时，除非另外特别说明否则其包括多个(种)所述名词。此外，还要注意说明书和权利要求中使用的术语“包含”不应被解释为限于随后列举的设备；其不排除其它要素或步骤。因此，表述“包含设备A和B的装置”的范围不应被限定为仅由组件A和B组成的装置。其表示就本发明而言，所述装置的仅有相关组件是A 和B。在几个化学式中涉及“烷基”和“芳基”。在这方面，“烷基”各自独立地表示不超过十个碳原子的脂肪族直链、支链或环状烷基基团，其可包括1-3个杂原子例如0、N或S，并且优选具有1-6个碳原子，和“芳基”各自独立地表示不超过十个碳原子的芳基或杂芳基， 其可包括1-3个杂原子例如N或S。在几个化学式中，关于字母例如“A”、“B”、“X”、“Y”和各种编号的“R”基团表示了基团或取代基。这些字母的定义将参考各式进行解读，即在不同的式中，除非另外说明，否者这些字母可各自独立地具有不同的意义。
图1描绘了如上所述的预靶向概念的一般方案；
图2提供了(3，6)-二-(2-吡啶基)-S-四嗪和E-环辛烯之间的W+2]Diels-Alder 反应接着是逆Diels Aider反应的反应方案，其中形成产物和氮气。由于反式环辛烯衍生物不像经典Diels Aider反应中那样含有吸电子基团，因此这种类型的Diels Aider反应区别于经典Diels-Alder反应，并且通常被称为“逆电子需求Diels Aider反应”。在下文中，将两个反应步骤序列即初始的Diels-Alder环加成(典型地是逆电子需求Diels Aider 环加成)和后续的逆Diels Aider反应将简称为“逆Diels Aider反应”； 图3 (a和b)描绘了使用逆Diels-Alder化学的预靶向的一般方案； 图4到图7示出了在实施例中使用的化合物的合成方案； 图8-9示出了在体内实施例中使用的化合物的合成方案； 图10-12示出了本发明的体内可行性。
具体实施方式
逆 Diels-Alder 反应
逆Diels-Alder耦合化学通常包括耦合以形成不稳定中间体的反应物对，所述中间体通过逆Diels-Alder反应消除作为唯一副产物的小分子(取决于起始化合物其可以是例如 N2、C02、RCN)以形成稳定产物。所述成对反应物包括作为一种反应物(即一种生物正交反应性基团)的适合的二烯，例如四嗪的衍生物，和作为另一种反应物(即另一种生物正交反应性基团)的根据式(1)的环辛烯或环辛炔。所述逆Diels-Alder耦合化学通常包括耦合以形成不稳定中间体的反应物对，所述中间体通过逆Diels-Alder反应重排成为稳定的加合物。所述成对反应物包括作为一种反应物(即一种生物正交反应性基团)的二烯例如缺电子四嗪等，和作为另一种反应物(即另一种生物正交反应性基团)的根据式(1)的张力(strained)环辛烯或环辛炔。
例如缺电子诹代的)四嗪与例如张力E-环辛烯的异常快速的反应导致了连接反应中间体，所述中间体在[4+2]逆Diels-Alder环加成中通过消除作为唯一副产物的N2重排为稳定的二氢哒嗪。这在图2中示出。这两种反应性物类是非生物的，并且因此不经受快速的体内代谢。它们是生物正交的，例如它们在生理介质中彼此选择性地反应。关于所述逆电子需求Diels Aider反应和反应性物类对的行为的参考文献包括Thalhammer, F ； ffallfahrer, U ； Sauer, J, Tetrahedron Letters, 1990, 31 (47)，6851-6854； Wijnen, Jff； Zavarise, S； Engberts, JBFN, Journal Of Organic Chemistry, 1996，61，2001-2005; Blackman, ML; Royzen, M; Fox, JM, Journal Of The American Chemical Society, 2008， 130 (41), 13518-19)。应该理解，广义上，根据本发明上述耦合化学基本上能够应用于预靶向中能够使用的任何分子、基团或部分对。即这种对的其中之一将包含能够与主要靶结合的主要靶向部分，和进一步包含至少一个次级靶。另一个将是适合用于与所述次级靶结合的次级靶向部分，并且进一步包含适合施加治疗作用的部分(典型地是药学活性化合物)，或适合被成像技术寻址(addressed)的部分(即标记物)，或两者。因此，根据本发明，所述预靶向探针和所述效应物探针中的任一被环辛烯或环辛炔官能化，而另一个被四嗪或其它适合的二烯官能化。这在图3中示出。上部的方案(图 3a)示出了预靶向探针，含有通过连接体部分(优选包含柔性间隔体)与作为主要靶向部分的抗体连接的二吡啶基四嗪，和效应物探针，含有通过连接体(柔性间隔体)与可检测标记物连接的环辛烯(作为次级靶向部分)。下面的所述方案(图北)示出了正好相反的方案，即包含环辛烯的预靶向探针和包含四嗪的效应物探针。本领域技术人员知道在逆Diels-Alder反应中具有反应性的众多二烯。优选的二烯参照式(2)- (7)在下面给出。
权利要求
1.用于靶向的医学成像和/或治疗的试剂盒，其包含至少一种预靶向探针和至少一种效应物探针，其中所述预靶向探针包括主要靶向部分和第一生物正交反应性基团，和其中所述效应物探针包括效应物部分，例如标记物或药学活性化合物，和第二生物正交反应性基团，其中所述第一和第二生物正交反应性基团的任意一个是亲双烯体并且所述第一和第二生物正交反应性基团的另一个是二烯，其中所述亲双烯体是符合式(1)的8元张力环亲双烯体
2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述二烯选自由以下规定的式(2)、(3)、(4)、(5)和 (6)的化合物组成的组 其中R1选自由烷基、芳基、0-烷基、C(=0) 0-烷基、0-和NH2组成的组；A和B各自独立地选自由烷基取代的碳、芳基取代的碳、氮、N+0—、其中R是烷基的『R组成的 ，条件是A和 B不都是碳；X选自由0、N-烷基和C=O组成的组，和Y是CR，其中R选自由H、烷基、芳基、 C (=0)0烷基组成的组；
3.根据权利要求2的试剂盒，其中所述二烯满足式
4.根据上述权利要求任意一项的试剂盒，其中所述预靶向探针包括抗体作为主要靶向部分。
5.根据上述权利要求任意一项的试剂盒，其中所述效应物探针包括作为效应物部分的可探测标记物，优选是用于成像体系的对比剂，选自由以下组成的组可MRI-成像的试齐IJ、 自旋标记物、光学标记物、超声响应试剂、X射线响应试剂、放射性核素、FRET类染料、(生物) 发光或荧光分子或标签、生物素、顺磁性成像试剂和超顺磁性成像试剂。
6.根据上述权利要求任意一项的试剂盒，其中所述效应物探针包括药学活性化合物作为效应物部分。
7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述药学活性化合物是选自由以下组成的组的同位素 JUP^P^SCFeJcdd^Br^Bi^Sr^Nb^Y^Rdh^PcUmAg、 121Sn 127Te 131T 140I a 141Ce 142Pr 143Pr 144Pr 149Pm 149Tb 151Pm 153Sm 159Gd 161Tb 165Dv 166DvOil > 1 t； > ± > L<Cl > V^U > 11、 11、 11、 1 111 > 1 U > 1 111 > Olll、 VJU. > 1 U > Uy > Uy >ilo^Er/qm^Yb^Lu^Re^Re^Au^AiumAtjnBi^Bi^PlKWBi^Bi^Ra、 和鄉Ac。
8.预靶向试剂，其包含主要靶向部分和生物正交反应性基团，其中所述生物正交反应性基团是说明书中规定的式(2)- (7)任意一个的二烯与权利要求1中规定的式(1)的亲双烯体之间[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。
9.成像探针，其包含可探测的标记物，优选是选自由以下组成的组的同位素3H、"C、 13N、150、18F、19F、51Cr、52Fe、52Mn、55CO、6°CU、61CU、62ai、62CU、63ai、64CU、66Ga、67Ga、68Ga、7°AS、71AS、 72AsJ4AsJ5SeJ5BiN76BiN77Br^BiN82BiN82RlK86YJ8YJ9SiN 89^n97Riu 99TClrK111IrK113IrK 114In、117Sn、12(lI、122Xe、123I、124I、125I、166HO、167Tm、16i3Yb、193Pt、195Pt、201Tl 和 2°3Pb，和生物正交反应性基团，其中所述生物正交反应性基团是说明书中规定的式(2)- (7)任意一个的二烯与权利要求1中规定的式(1)亲双烯体之间[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。
10.治疗探针，其包含药学活性化合物，优选是选自由以下组成的组的同位素24Na、 32P、33P、47Sc、59Fe、67CU J6AsJ7AsJqBin82Bin89Sin9qNIk9qYJq3Ru ^5RtKic19PcU111AgJ21SrK127Th 131I、14°La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、1H3Gd、161Tb、165Dy、166Dy、16fiH0、169Er、 172Tm、mYb、177LU、186Re、188Re、198AU、199AU、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra 和 225Ac,以及生物正交反应性基团，其中所述生物正交反应性基团是权利要求2中规定的式(2)- (7)任意一个的二烯与权利要求1中规定的式(1)亲双烯体之间[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。
11.预靶向方法，其包括向受试者给予根据权利要求8的预靶向试剂并使所述试剂在所述受试者的体系中循环有效完成所述主要靶向部分到主要靶的结合的一段时间，接着从身体清除未结合的试剂。
12.成像方法，其包括实施根据权利要求11的预靶向方法，接着给予根据权利要求9的成像探针，其中所述预靶向试剂中和所述成像探针中的所述生物正交反应性基团一起形成所述[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。
13.受试者中的靶向的医学治疗方法，其包括实施根据权利要求11的预靶向方法，接着给予根据权利要求10的治疗探针，其中所述预靶向试剂中和所述治疗探针中的所述生物正交反应性基团一起形成所述[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。
14.根据权利要求10的试剂用于根据权利要求13到15任意一项的方法。
15.用于动物或人类中的预靶向方法的化合物，其符合式(1)， R全文摘要
描述了用于靶向医学成像和/或治疗的预靶向方法和相关的试剂盒，其中使用彼此显示出生物正交反应性的非生物反应性化学基团。对于提供预靶向探针和效应物探针之间的耦合，本发明涉及[4+2]逆电子需求(逆)Diels-Alder化学的利用。为了该目的，这些探针之一包含缺电子四嗪或其它适合的二烯，并且另一个是环辛烯或环辛炔。
文档编号A61K47/48GK102395380SQ201080017007
公开日2012年3月28日 申请日期2010年4月12日 优先权日2009年4月16日
发明者伯丁斯基 D., 卢布 J., S. 罗比拉尔德 M., 雷纳特弗柯克 P., 罗辛 R. 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司