专利名称：用来自羊水的胎儿间质干细胞改善皮肤状况的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及羊水中胎儿源间质干细胞的培养基。更具体地，本发明涉及用于改善皮肤状况的组合物，其包括将羊水中的胎儿源间质干细胞作为有效成分的培养基，其中皮肤状况包括白化、起皱、由UV线或皮肤拉提(拉皮，skin lifting)引起的皮肤损害。此外，本发明涉及用于制备该组合物的方法，包括步骤培养羊水中的胎儿源间质干细胞；以及收集该培养基。2.相关技术的描述干细胞具有通过适当的环境和刺激分化成各种细胞的能力，并且也具有自增殖的能力。有三种类型的干细胞从早期胚胎中分离的胚胎干细胞(ES细胞)、从胚胎阶段的原始生殖细胞中分离的胚胎生殖细胞(EG细胞)以及从成人骨髓中分离的多能成人祖细胞 (MAPC细胞)。干细胞具有发育成具有独特现象(unique phenomena)和特殊功能的细胞的潜力，因此将它们作为用于再生各种器官的有吸引力的细胞源而提出。迄今，已知成人干细胞具有分化成各种细胞的能力。成人干细胞是从骨髓 (Science 276,71-74, 1997 ；Science 284, 143-147,1999 ；Science 287,1442-1446, 2000)、骨骼肌(Proc. Natl Acad. Sci. USA 96,14482-14486,1999 ；Nature 401,390-394, 1999)以及脂肪组织(Tissue Eng 7，211-228，2001 ;J. Cell. Physiol. 206，229-237，2006) 中分离的，并且它们中的每个能分化成相似的细胞谱系。骨髓源间质干细胞是已经使用很长时间的成人干细胞，并且它们的效力也被证实。另外，最近的研究已经报道了从脂肪组织或其他组织中分离的细胞对骨髓源间质干细胞也具有相似的特性。然而，很难分离和纯化大量的间质干细胞，因此迫切需要其他可选的来源。因此，本发明人主要关注可被容易地分离而不对婴儿或其母亲造成任何危险的羊水。在受精卵植入到子宫壁后的几天，胚胎被充满羊水的羊膜囊包围。因为羊水包含大量由胎儿排泄的物质，可在羊水中检验胎儿的染色体异常或细菌感染。另外，羊水允许胎儿运动更容易，保护胎儿不受任何外部冲击和刺激的影响，防止细菌感染，以及帮助调节胎儿体温。在出生前，可通过检查羊水获得有关胎儿健康的信息。在此时，可在整个怀孕期间收集羊水，而不对母亲造成任何危险。检查中所用的细胞在检查后丢弃，并且在患者的准许下可用于研究目的。因此，因为可容易地获得大量细胞，所以羊水源干细胞相对于其他成人干细胞具有优势。目前，没有加入通过培养羊水中的胎儿源间质干细胞一段预定时间而获得的培养基是否影响成纤维细胞生长的报道。本发明人已经从羊水中的胎儿分离了间质干细胞并研究了它们的特性。此外，他们已经研究了在使用羊水中的胎儿源间质干细胞制备的条件培养基中存在的组分，并证明了在成纤维细胞中条件培养基的作用。此外，本发明人已经通过小鼠体内试验和临床试验， 证明了条件培养基组合物对皮肤弹性和再生的影响，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于改善皮肤状况的组合物，其包括将羊水中的胎儿源间质干细胞作为有效成分的培养基。本发明的另一个目的是提供用于制备该组合物的方法，包括以下步骤培养羊水中的胎儿源间质干细胞；以及收集该培养基。
图1显示了羊水中胎儿源细胞系的异质群体(左)和在2至3次继代培养后间质干细胞的同质富集(homogeneous enrichment)(右4代)；图2显示了将从母亲分离的羊水中胎儿源细胞进行核型分析的结果，其中XY性染色体说明该细胞源于羊水中的胎儿，而不是母亲；图3显示了使用流式细胞计量术的免疫表型分析的结果，其中羊水中的胎儿源细胞⑶具有与人骨髓源间质干细胞㈧相似的特性；图4显示了羊水中胎儿源细胞的脂肪形成分化(A)、成骨分化(B)和软骨形成分化 (C)，说明该细胞具有与多能骨髓源间质干细胞相似的分化能力；图5(A)显示了通过使用确立的羊水中的胎儿源间质干细胞和DMEM/F12-不含血清培养基制备条件培养基，其中在显微镜下观察到5X104个(a)、lX105个(b)、2.5X105 个(c)和5X105个(d)细胞；图5(B)显示了在接种每cm2的每个细胞计数后CFU测定的结果；图6至8显示了大量生长因子对成纤维细胞生长的作用，所述生长因子存在于使用确立的羊水中的胎儿源间质干细胞所获得的条件培养基中；图9显示了用于分析使用确定的羊水中的胎儿源间质干细胞所获得的条件培养基中蛋白质的抗体测定的结果，说明在培养基((A)DMEM/F12-不含血清的培养基，(B) DMEM/F12-不含血清的条件培养基)中产生了大量的生长因子；图10至11显示了使用羊水中的胎儿源间质干细胞所获得的条件培养基，在皮肤成纤维细胞中具有创伤愈合作用；图12显示了体内试验的结果，说明使用羊水中的胎儿源间质干细胞所获得的条件培养基在受伤的小鼠皮肤中具有再生作用；以及图13显示了临床研究的结果，说明使用羊水中的胎儿源间质干细胞所获得的条件培养基具有再生作用。
具体实施例方式为了实现以上目的，本发明的一个实施方式涉及用于改善皮肤状况的组合物，其包括将羊水中的胎儿源间质干细胞作为有效成分的培养基，其中所述皮肤状况包括白化、 起皱、由UV线或皮肤拉提引起的皮肤损害。如在此所用的，术语“间质干细胞(MSC) ”指的是分化成软骨、骨骼、脂肪、骨髓基质、肌肉、神经或类似物的细胞，其主要存在于成人骨髓中，但也在脐带血、周围血、其他组织或类似物中被发现，并且能够从中获得。就本发明的目的而言，本发明的间质干细胞是指羊水中的胎儿源间质干细胞。由胎儿排泄的各种化学物被包含在怀孕妇女的羊水中，它们可产生体内的大部分细胞，并且容易被收集。另外，细胞的异质群体在羊水中存在，本发明人鉴定了具有成纤维细胞样形态的间质干细胞的同质群体(homogeneous population)的存在，所述成纤维细胞样形态是间质干细胞的特性。本发明的特征在于羊水中的细胞源于胎儿。在本发明的优选实施方式中，进行核型分析以证实羊水中的细胞是否源于胎儿。 在羊水中，也存在一些母亲的细胞和胎儿细胞。在本发明中，进行染色体分析以检测到雄性，说明羊水中的细胞源于胎儿(图2)。优选地，本发明的组合物包括Apo-1/i^as、表皮生长因子(EGF)、IP-10、瘦蛋白、MIP4、MMP3、Rantes、干扰素γ (IFN γ )、人转化生长因子(TGF-β )、肿瘤坏死因子 α (TNFa)、肿瘤坏死因子受体I(TNFRI)、肿瘤坏死因子受体II (TNFRII)、细胞内黏着分子l(ICAM-l)、血管细胞黏着分子l(VCAM-l)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-1β (11^-13)、白细胞介素-1 受体 a (IL-IRa)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、 IL-7、IL-8、IL-12 和 IL-15。此外，由本发明的方法制备的羊水中的胎儿源间质干细胞，其特征在于显示(a) 对⑶13、⑶四和⑶44全部阳性的免疫特性，(b)生长并附着到细胞培养平板，并且显示纺锤形的形态，其是典型的成纤维细胞形态，以及(c)具有分化成中胚层细胞谱系的能力。如在此所用的，术语“分化”指的是如此现象，其中在细胞的分裂、增殖和生长期间，其结构或功能特化。多能间质干细胞产生分化成定型细胞谱系(例如中胚层细胞)的祖细胞，并且可进一步分化成其他类型的祖细胞(例如成骨细胞等)，其又生成在特殊组织 (例如骨等)中具有特殊功能的终末分化的细胞类型(例如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等)。在优选实施方式中，本发明的羊水中的胎儿源间质干细胞具有分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的能力。在本发明的具体实例中，用于分化成脂肪细胞的培养基可包括高葡萄糖DMEMUmM 地塞米松，0. 5mM 3-异丁基-1-甲基-咖啡因(3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤)、lOng/ml胰岛素、IOOmM吲哚美辛和10% FBS。在本发明的具体实例中，用于分化成成骨细胞的培养基可包括高葡萄糖DMEM、 IOOmM地塞米松、IOmM β磷酸甘油、0. 2mM维生素C和10% FBS。在本发明的具体实例中，用于分化成软骨细胞的培养基可包括高葡萄糖DMEM， 0. IM 地塞米松、50g/ml AsAU00g/ml 丙酮酸钠、40g/ml 脯氨酸、10ng/ml TGF-I 和 50mg/ml ITS预混合料[6. 25g/ml胰岛素、6. 25g/ml转铁蛋白、6. 25g/ml亚硒酸、1. 25mg/ml BSA和 5. 35mg/ml 亚油酸]。在本发明中，在培养基中培养羊水中的胎儿源间质干细胞，对于每个分化培养7 至观天。通过这种方法，可证明羊水中的胎儿源细胞是否具有间质干细胞的特性(图4)。 因此，在本发明中，羊水中的胎儿源细胞为具有间质干细胞特性的细胞，并且可用作其他细胞以及骨髓的来源。
本发明的组合物显示了改善皮肤状况的作用，特别是白化，起皱，由UV线、皮肤再生或皮肤拉提引起的皮肤损害。在本发明的具体实例中，在皮肤源成纤维细胞中生成人工创伤，随后用本发明的组合物处理该细胞。结果显示细胞迁移提高，并且创伤愈合相关基因的表达在数量上增加， 说明了极好的创伤愈合作用(图10至11)。此外，在小鼠皮肤上生成人工创伤，随后向创伤运用本发明的组合物。结果显示创伤部位逐渐减少，说明了极好的创伤闭合和皮肤再生作用(图12)。此外，在使用本发明组合物的临床研究中，在本发明组合物的微疗法 (microtheraph)后，当用显微针刺激皮肤时，发现皮肤弹性提高，肤色变得更加明亮，微小皱纹减少，并且皮肤毛孔最小化。当以相同的方式进行观察6到7周时，观察到痤疮疤痕的红斑的改善和快速的创口再生，说明本发明的组合物显示了极好的改善白化、起皱、皮肤损害、皮肤再生和皮肤拉提的作用(图12)。根据本发明的优选实施方式，本发明的组合物为美容组合物。包含在本发明的美容组合物中的成分为有效成分，除了羊水中胎儿源间质干细胞的培养基之外，其还包括通常在美容组合物中使用的成分。这样的成分包括例如常规的辅助剂，如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料以及载体。另外，该美容组合物可进一步包括皮肤吸收增强剂，以便促进该作用。本发明的美容组合物可制备为任何在本领域中通常制备的制剂。该美容组合物可配制为例如，溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、乳霜、洗剂、粉剂、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳剂粉底、蜡粉底、喷雾剂或类似物，但不限于此。更具体地，该美容组合物可制备为制剂，例如软化爽肤水，营养爽肤水，营养乳霜，按摩乳霜，精油，眼霜，清洁乳霜，清洁泡沫，清洁水，面膜(pack)，喷雾剂或粉剂。如果本发明的制剂为糊剂、乳霜或凝胶， 则动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶(traganth)、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、 膨润土、硅石、滑石、氧化锌或类似物可用作载体成分。如果本发明的制剂为粉剂或喷雾剂，那么乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末可用作载体成分，特别地，如果该制剂为喷雾剂，可包含推进剂例如含氯氟烃、丙烷/ 丁烷或二甲醚。如果本发明的制剂为溶液或乳剂，那么溶剂、增溶剂或乳化剂可用作载体成分，其例子包括水、乙醇、界丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1， 3-丁基乙二醇油(butylglycol oil)、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或山梨糖醇酐脂肪酸酯。如果本发明的制剂为悬浮液，那么液体稀释剂例如水、乙醇和丙二醇，悬浮剂例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、胺黄树胶或类似物可用作载体成分。如果本发明的制剂为含表面活性剂的清洁剂，那么脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉锡盐衍生物、甲基牛磺酸盐(methyltaurate)、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯或类似物可用作载体成分。此外，本发明的组合物可制备为药物组合物。如果本发明的组合物制备为药物组合物，那么本发明的药物组合物包括药学上可接受载体。包括在本发明的药物组合物中的药学上可接受载体为配制时通常使用的那些，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、 微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯和丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除了以上的成分之外，本发明的药物组合物还可进一步包括润滑剂、湿润剂、增甜剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂或类似物。 合适的药学上可接受的载体和制剂在Remington，s Pharmaceutical Sciences (19th ed.， 1995)中描述。本发明的药物组合物可通过多种途径施用于哺乳动物例如大鼠、小鼠、家畜和人，所述途径例如口服和肠胃外途径，例如口、直肠或静脉内、肌肉内、皮下、硬膜内 (intraepidural)或脑血管内注射，优选肠胃外途径中的经皮途径，更优选局部应用。可根据多种因素确定本发明药物组合物的合适剂量例如配制方法(formulation method)、给药模式、患者年龄、体重、性别和健康状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和药物敏感性。对于口服给药，对成人，可以以0. l-100mg/kg的日剂量一次或几次施用本发明的药物组合物。此外，对于局部给药，对成人，可优选以1.0至3. Oml的日剂量一至五次施用本发明的药物组合物1个月或更长时间。然而，本发明的范围并不意欲被剂量限制。使用药学上可接受载体和/或赋形剂，根据本领域技术人员已知的方法，本发明的药物组合物可被配制成单位剂型或多剂量容器。该药物组合物可被配制成任何合适的制剂，包括口服制剂例如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糖浆和气溶胶，局部外用制剂例如软膏和乳霜，栓剂或用于注射的无菌溶液。该药物制剂可进一步包括分散剂或稳定剂。本发明的其他实施方式涉及用于制备该组合物的方法，包括以下步骤培养羊水中的胎儿源间质干细胞；以及收集培养基。更优选地，本发明涉及用于制备该组合物方法，包括以下步骤(a)分离从怀孕妇女获得的羊水中的胎儿源细胞；(b)在补充有FBS和bFGF的培养基中继代培养该细胞，以便获得羊水中的胎儿源间质干细胞；(c)在不含血清的培养基中培养所获得的羊水中的胎儿源间质干细胞1至10天，以便制备条件培养基；以及(d)收集该条件培养基。在步骤(a)中，从怀孕开始直到分娩，都可收集羊水，而不对母亲造成任何危险。 在出生前，可通过羊水检查获得关于胎儿健康的信息，检查中所使用的细胞在检查后丢弃。 此时，在患者的准许下，该细胞可用于研究目的。因此，可容易地获得大量细胞。将从母亲获得的羊水离心，以分离羊水中的胎儿源细胞。在步骤(b)中，继代培养从羊水中分离的细胞，以便获得羊水中的胎儿源间质干细胞。在继代培养中使用的培养基优选地是细胞培养基本培养基(CCMM)，其通常包含碳源、 氮源和微量元素。细胞培养基本培养基的例子包括DMEM(Dulbecco改性fegle培养基)、 MEM (基本必需培养基)、BME (Eagle基础培养基)、RPMI1640、F-10、F-12、α MEM ( α基本必需培养基)、GMEM(Glasgow基本必需培养基)和IMEM(Iscove改性Dulbecco培养基)，但不限于此。另外，该培养基可包含抗生素，例如青霉素、链霉素和庆大霉素。在本发明中，羊水中的胎儿源间质干细胞可通过在补充有FBS和bFGF的基础培养基中培养从羊水分离的细胞获得，优选地通过在补充有4ng/ml bFGF的含10% FBS的低葡萄糖DMEM培养基中培养细胞获得。在本发明的优选实例中，低葡萄糖DMEM培养基可进一步包含10% FBSU% L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素，以及如g/ml bFGF溶液。
在步骤(c)中，在不含血清的培养基中培养所获得的羊水中的胎儿源间质干细胞 1至10天，以制备条件培养基。如在此所用的，术语“条件培养基”指的是通过以下步骤制备的培养基当悬浮培养的细胞达到对数生长期时，通过离心或过滤去除分裂细胞，并且只收集培养基，并与培养基质(culture substrate)混合。这是使用从分裂细胞分泌到培养基中的未知生长因子的方法，通常用于以低密度铺板细胞或用于原生质体培养。对于本发明的目的，本发明的条件培养基组合物指的是包含通过从胎儿源间质干细胞的培养基中移出胎儿源间质干细胞而制备的溶液的组合物，并且指的是包含源于胎儿源间质干细胞的大量物质例如生长因子的组合物，并且优选包括Apo-1/i^s、表皮生长因子 (EGF)、IP-10 (干扰素γ诱导蛋白10)、瘦蛋白、]\0卩4、匪卩3、1^壯68、干扰素y (IFN y),A 转化生长因子(TGF- β )、肿瘤坏死因子α (TNF α )、肿瘤坏死因子受体I (TNFRI)、肿瘤坏死因子受体Π (TNFRII)、细胞内黏着分子-1 (ICAM-I)、血管细胞黏着分子_1 (VCAM-I)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-1 β (11^-1旧、白细胞介素-1受体α (IL-1R α )、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-12 和 IL-15。在本发明中，为了获得胎儿源间质干细胞的条件培养基，从羊水中分离和获得的间质干细胞优选在不含血清的培养基中进行培养，该培养基包含含有氨基酸或其类似物和维生素或其类似物的Ham’ s F-12营养混合物。根据本发明，包含Ham’ s F-12营养混合物的不含血清的培养基基于没有PH指示剂例如酚红的DMEM，并且以大约1 0.5-2的比率向其中加入Ham's F-12营养混合物。关于这一点，可以加入氧化营养物例如L-谷氨酰胺、能量代谢物例如丙酮酸钠以及碳源例如碳酸氢钠。在该混合物中，帮助维持细胞生长和稳态并且涉及增加在间质干细胞的初期培养后的继代培养中细胞的安全和维持的多种无机物质和氨基酸、能刺激由胎儿源间质干细胞分泌的生长因子更高产量的维生素营养物、和其他因子以给定的比率相互混合。在本发明的具体实例中，在从母亲获得的羊水中分离的胎儿源细胞，在补充有FBS 和bFGF的培养基中进行继代培养，以便获得羊水中的胎儿源间质干细胞。随后，不同数量的羊水细胞在DMEM/F-12不含血清的培养基中培养3天，离心和过滤所获得的培养基，以便制备条件培养基(图5)。在步骤(d)中，收集条件培养基，以便制备本发明的用于改善皮肤状况的组合物。 可通过本领域技术人员已知的方法进行条件培养基的收集，例如通过离心或过滤。在下文中，将参考实施例更加详细地描述本发明。然而，这些实施例仅是为了说明的目的，本发明不意欲被这些实施例限制。实施例1 培养从怀孕妇女获得的羊水中的胎儿源细胞系，并且在培养条件下进行同质间质干细胞的形态学鉴定在从怀孕妇女获得的羊水中有很多漂浮颗粒。为了分离它们，将羊水放在T形烧瓶中并在37°C下温育。第二天，除了附着在底部的细胞，所有的细胞都被去除。使用胰蛋白酶使附着在底部的细胞与底部分离，随后通过离心进行收集。随后，将细胞悬浮在包含10% FBS、1 % L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素以及^g/ml bFGF的低葡萄糖DMEM的基础培养基中，并且将悬浮的细胞接种在IOOmm细胞培养平板中。在12-M小时后，用新鲜培养基代替该培养基。发现羊水中的胎儿源细胞系显示异质群体(图IA :a-d)，并且在两至三次继代培养后，仅具有成纤维细胞样形态(图IA :e)。当细胞具有图1的形态时，每2-3天更换培养基一次，当细胞达到80%至90%汇合时，进行继代培养。实施例2 通过核型分析鉴定羊水中的胎儿源细胞为了检查细胞是否源于羊水中的胎儿，进行核型分析。核型显示了每个染色体类型的数量、大小和形状，进行染色体分析，以检测突变和确定胎儿性别。为了进行核型分析，用秋水仙酰胺1-2小时将细胞分裂停止在在中期，并且通过G显带染色进行染色体分析。核型分析结果显示羊水中的胎儿源细胞具有正常染色体和XY性染色体，说明细胞源于胎儿，而不是母亲(图2)。实施例3 分析羊水中的胎儿源细胞和间质干细胞之间的相似性检查了羊水中的胎儿源细胞是否具有多能间质干细胞的特性。首先，当用流式细胞计量术进行免疫表型分析时，与人骨髓源间质干细胞相比，在羊水中的胎儿源细胞中观察到CD13、CD^和CD44的表达(图幻。尽管它们的表达对于间质干细胞是特异性的，但每个细胞都可显示不同的特性。因此，检查了分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力，这是间质干细胞的代表性特性。羊水中的胎儿源细胞像人骨髓源间质干细胞一样进行分化，随后通过骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达证明了成骨分化，通过脂蛋白脂肪酶(LPL)、脂肪酸结合蛋白2(aP》和过氧化物酶体增殖子激活受体Y (PPARy)的表达，证明了脂肪形成分化，通过II型胶原、I 型胶原和聚集蛋白聚糖的表达——通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，证明了软骨形成分化。每种分化都用特定的染色方法进行鉴定成骨分化期间的钙化用茜素红S染色进行鉴定，脂肪形成分化期间的液滴积聚用油红0染色进行鉴定，在软骨形成分化期间的软骨基质用阿辛蓝染色进行鉴定(图4)。因此，发现本发明的羊水中的胎儿源细胞具有与骨髓源间质干细胞相似的特性。实施例4 制备来自羊水中的胎儿源间质干细胞的条件培养基根据羊水中的胎儿源间质干细胞的细胞计数确立条件培养基的制备条件。首先，通过胰蛋白酶处理，将确立的间质干细胞从IOOmm细胞培养平板的底部上分离下来。所分离的细胞被收集并放在15ml管中，随后离心。将收集的细胞悬浮在5-10ml 的培养基中并充分混合。取出管中20 μ 1的漂浮细胞，并用血细胞计数器计算细胞数。随后，在包含补充有10% FBS、1 % L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素以及^g/ml bFGF的低葡萄糖DMEM的IOOmm细胞培养平板中接种5 X 104、1 X IO5,2. 5 X IO5和5 X IO5个细胞。在 12小时后，用DMEM/F12不含血清的条件培养基代替该培养基，并且培养细胞72小时。在 72小时后，每个细胞计数的培养基被转移到管中，随后离心。使用0. 20针筒过滤器进行过滤，以制备条件培养基。在DMEM/F12不含血清的培养基中培养3天后，在得到CM后细胞的形态在图5A中示出。每cm2的细胞计数被分为四组，并且接种细胞以进行CFU测定。结果显示在100/cm2观察到最高值，并且根据每cm2的细胞计数观察到不同的图形(图5B)。实施例5 体外测试条件培养基的作用计数了羊水中的5X 104、1X 105、2. 5X IO5和5X IO5个胎儿源间质干细胞，并且它们中的每一个都在DMEM/F12不含血清的培养基中培养3天，以制备条件培养基。为了检查它们对成纤维细胞生长的影响，进行了以下实验。在CM中培养3天后，比较了细胞形态和生长。在CMQ.5X105个)中观察到最高的细胞生长(图6)。为了证明该结果，在用CM处理皮肤源成纤维细胞后，用PI染色鉴定细胞生长周期。结果，在CMC. 5X IO5个)中，在S 阶段(增殖)，观察到13. 83%的最高细胞生长，这与先前的实验相同(图7)。在细胞生长周期中，通过实时PCR检查了 S阶段相关的基因表达。发现该基因表达在CM处理组的细胞中增加。特别地，在CMC. 5X IO5个)中观察到高表达，这表示源于250，000个羊水细胞的 CM大大增加了细胞生长(图8)。在这些实验结果的基础上，检查了细胞生长相关蛋白质表达的增加，以确立最优培养条件。实施例6 鉴定羊水中的胎儿源间质干细胞中的条件培养基成分为了分析使用羊水中的胎儿源间质干细胞所获得的条件培养基的成分，通过抗体测定检查了表达蛋白数量上的变化。在DMEM/F12不含血清的培养基(不是条件培养基) 中没有观察到生长因子和蛋白表达(图9A)。分析了 DMEM/F12不含血清的条件培养基的成分。结果，发现在涉及增殖的全部36种细胞生长因子和蛋白质中的27种生长因子，例如 TGF β、VEGF, EGF、TNF α、IL8、IL6和ΜΜΡ3，被包括在条件培养基中(图9Β)。实施例7 在皮肤成纤维细胞中条件培养基的创伤愈合作用为了检查使用羊水源干细胞制备的条件培养基是否显示了创伤愈合作用，在皮肤源成纤维细胞上生成人工创伤，随后用条件培养基处理该细胞。在12小时时，在条件培养基处理的细胞中观察到较高的迁移，并且在CM(2.5X IO5个)中高得多。关于这一点，比较了相对迁移速率。在条件培养基O.5X105个)中观察到最高值，说明使用羊水源干细胞获得的条件培养基具有极好的创伤愈合作用(图10至11)。在迁移速率的测量期间，通过实时PCR检查了涉及创伤愈合的基因表达。与DMEM/F12不含血清的培养基(不是条件培养基)相比，在条件培养基O.5X105个)中观察到最高数量的表达，说明源于250，000个羊水细胞的条件培养基显示了最高的创伤愈合作用(图11)。实施例8 在小鼠体内条件培养基的皮肤再生作用检查了羊水中的胎儿源间质干细胞的条件培养基对皮肤创伤的小鼠是否显示皮肤再生作用。小鼠皮肤通过穿孔四_30讓2被人工弄伤，随后使用通常的DMEM/F12不含血清的培养基和DMEM/F12不含血清的条件培养基进行处理，观察创伤闭合。直到8天，在用通常DMEM/F12不含血清的培养基处理的创伤部位中没有观察到皮肤再生，但发现用DMEM/ F12不含血清的条件培养基处理的创伤部位逐渐减小(图12A)。创伤闭合的测量值在图中示出(图12B)。实施例9 通过临床研究检查条件培养基作用羊水中的胎儿源间质干细胞的条件培养基用于临床研究，以检查其皮肤再生作用。在条件培养基的微疗法后，用显微针刺激皮肤，每周一次。在8周后，观察到皮肤弹性提高，肤色变得更加明亮，微小皱纹减少，并且皮肤毛孔最小化(图13A)。当以相同的方式进行观察6-7周时，观察到痤疮疤痕的红斑的改善和快速的创伤再生(图13B)。本发明的效果在本发明中，培养源于羊水中胎儿的细胞，以获得多能间质干细胞，并且因此除了骨髓之外，提供另一间质干细胞来源。这就是说，本发明提出了源于羊水中胎儿的细胞作为多能间质干细胞的可能性，并且使用羊水中的胎儿源间质干细胞制备条件培养基，由此提供用于改善细胞生长和皮肤再生的极好的组合物。
权利要求
1.一种用于改善皮肤状况的组合物，其包括将羊水中的胎儿源间质干细胞作为有效成分的培养基，其中所述皮肤状况为白化、起皱、由UV线或皮肤拉提引起的皮肤损害。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述羊水中的胎儿源间质干细胞具有以下特性(a)显示对⑶13、⑶四和⑶44全部阳性的免疫特性；(b)生长并附着到细胞培养平板上，并显示纺锤形的形态；以及(c)具有分化成中胚层细胞谱系的能力。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述羊水中的胎儿源间质干细胞的培养基包括Apo-1/i^as、表皮生长因子(EGF)、IP-10 (干扰素γ诱导蛋白10)、瘦蛋白、ΜΙΡ4、ΜΜΡ3、 Rantes、干扰素γ (IFN γ )、人转化生长因子(TGF-β )、肿瘤坏死因子α (TNFa )、肿瘤坏死因子受体I (TNFR I )、肿瘤坏死因子受体II (TNFR II )、细胞内黏着分子-I(ICAM-I)、血管细胞黏着分子-I(VCAM-I)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-1 β (IL-Ιβ)、白细胞介素-I 受体 a (IL-IRa )、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-12 和 IL-15。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物为美容组合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物具有选自溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、 凝胶、乳霜、洗剂、粉剂、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳剂粉底、蜡粉底和喷雾剂的制剂。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物为药物组合物。
7.一种用于制备权利要求1所述的组合物的方法，包括以下步骤培养所述羊水中的胎儿源间质干细胞；以及收集所述培养基。
8.一种用于制备权利要求1所述的组合物的方法，包括(a)分离从怀孕妇女获得的羊水中的胎儿源细胞；(b)在补充有FBS和bFGF的培养基中继代培养所述细胞，以便获得所述羊水中的胎儿源间质干细胞；(c)在不含血清的培养基中培养所获得的羊水中的胎儿源间质干细胞1至10天，以便制备条件培养基；以及(d)收集所述条件培养基。
全文摘要
本发明涉及用于羊水中的胎儿源间质干细胞的培养基。更具体地，本发明涉及用于改善皮肤状况的组合物，其包括将羊水中的胎儿源间质干细胞作为有效成分的培养基，其中所改善的皮肤状况包括白化、起皱、由UV线或皮肤拉提引起的皮肤损害。此外，本发明涉及用于制备该组合物的方法，包括步骤培养羊水中的胎儿源间质干细胞；以及收集该培养基。
文档编号A61K8/98GK102395353SQ201080016925
公开日2012年3月28日 申请日期2010年3月19日 优先权日2009年3月20日
发明者全恩暻, 刘承权, 孟利朔, 尹炳善, 文哉喜, 曹敬植, 朴乙纯, 李宗远, 李章浩, 李重翰, 李黄熙, 郑惠年, 金俊成, 金钟建 申请人:生命医学股份公司