本发明属于植物细胞培养基技术领域，具体涉及一种用于培养岩黄连细胞的培养基及其制备方法。
背景技术：
岩黄连，为紫堇科紫堇属多年生草本植物，是一种名贵的中药材，有近似黄连的功效，且生长于岩缝中或岩石旁，故得此名。岩黄连味苦性寒，具有清热解毒、抗炎利湿、止痛止血的功效，是民间作为治疗乙肝的特效药。岩黄连中的活性成分为岩黄连总碱，主要包括脱氢卡维、小聚碱、卡维丁等多种生物碱成分，其中脱氢卡维丁含量最高，为主要活性成分。
中国专利申请CN1422948A公开了一种植物细胞培养基及使用培养基培养植物细胞的方法，该培养基应用水培技术，含有1.0mM-6.0mM钙盐，1.0nM-6.0mM硝酸盐和1.0ng-5.0ng/L磷酸盐；优选的钙盐为CaCl2·2H2O，硝酸盐为NaNO3，磷酸盐为Ca3(P04)2。中国专利申请CN103548695A公开了一种岩黄连的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：(1)取岩黄连侧芽作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导得到丛生芽；(3)将所述丛生芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株；(4)将所述健壮植株置于MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；(5)取完整的带根苗进行炼苗后移植于沙土壤生长一个半月，再移栽至大田。
岩黄连主要分布于贵州，云南，四川等省，在广西多见于桂西及桂西北等地，以东兰，巴马，都安，靖西，德保较多。岩黄连对环境条件要求十分苛刻，野生状态下只生长在石灰岩地区阴湿的岩洞口，气温在15-25℃之间，局限于石灰岩山区，属石山特有种，产量极低，列入中国南部濒危植物名录。由于生长环境条件恶劣，其自然繁殖率很低，种群发展困难，资源蕴藏量十分有限。因此，研制出一种用于培养岩黄连细胞的培养基迫在眉睫。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于培养岩黄连细胞的培养基及其制备方法。本发明提供的用于培养岩黄连细胞的培养基，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，成分明确且价格较低，繁殖率高，可明显缩短岩黄连的生长繁殖周期。
本发明的技术方案是：
一种用于培养岩黄连细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：肌醇20-40mg/L，谷胱甘肽15-25μg/L，6-苄基腺嘌呤10-13mg/L，硝酸钠1.5-2.5mM，活性炭0.05-0.15g/L，绿原酸28-36μg/L，尿嘧啶2-5mg/L，氯化钙2-3mg/L，L-谷氨酰胺0.02-0.08mg/L，甘油酸12-20mg/L和果糖10-18g/L。
一种用于培养岩黄连细胞的培养基，优选的方案是，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-苄基腺嘌呤12mg/L，硝酸钠2.2mM，活性炭0.09g/L，绿原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化钙2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L，甘油酸17mg/L和果糖15g/L。
优选地，所述基础培养基为MS培养基或White培养基。
另外，本发明还提供了所述用于培养岩黄连细胞的培养基的制备方法，步骤如下：
S1向基础培养基中加入肌醇、硝酸钠、尿嘧啶、氯化钙和果糖，搅拌18-25分钟，加入谷胱甘肽、6-苄基腺嘌呤、活性炭、绿原酸和L-谷氨酰胺，继续搅拌15-23分钟，加入甘油酸，搅拌12分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.2-5.5，灭菌温度为118℃，灭菌时间为18-25分钟，即得。
优选地，所述步骤S1搅拌23分钟。
优选地，所述步骤S1继续搅拌17分钟。
优选地，所述步骤S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.3。
优选地，所述步骤S2灭菌时间为23分钟。
本发明所用主要原料的作用：
肌醇：肌醇是一种水溶性维生素；维生素B族中的一种，肌醇和胆碱一样是亲脂肪性的维生素，分子式(CHOH)6。又称为环己六醇，白色晶体粉末(无结晶水)，风化性结晶(含二分子结晶水)。有9种立体异构体，其中有医用价值的内消旋体，可促进细胞新陈代谢、助长发育、增进食欲，可由玉米浸泡液中提取。主要用于治疗肝硬变、肝炎、脂肪肝、血中胆固醇过高等症。肌醇广泛分布在动物和植物体内，是动物、微生物的生长因子。
谷胱甘肽：谷胱甘肽(分子式C10H17O6N3S)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽，具有抗氧化作用和解毒作用。谷胱甘肽在生命体内的作用机理和四大生理功能：1、清除人体细胞内的自由基，是细胞内最主要的抗氧化剂。2、与人体内的有毒物质结合并排出体外，是人体内重要的解毒剂。3、激活和保护免疫细胞，增强人体免疫功能，是重要的免疫增强剂。4、影响皮肤细胞酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，防止皮肤色斑的产生。
6-苄基腺嘌呤：CAS号：1214-39-7，分子式：C12H11N5，分子量：225.25。6-苄基腺嘌呤，中文别名为2-苄氨基嘌呤，N-苄基腺苷，丙烯酸正丁酯，白色或类白色晶体，难溶于水，微溶于乙醇，在酸、碱中稳定，属广谱性植物生长调节剂，可促进植物细胞生长，抑制植物叶绿素的降解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老等。
活性炭：活性炭可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利。活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。
绿原酸：CAS号：327-97-9，分子式：C16H18O9，分子量：354.31。绿原酸具有广泛的生物活性，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。
尿嘧啶：CAS号：66-22-8，分子式：C4H4N2O2，分子量：112.09。白色或浅黄色针状结晶。尿嘧啶是RNA特有的碱基，相当于DNA中的胸腺嘧啶(T)，是组成RNA四种构成的碱基之一。
L-谷氨酰胺：白色结晶或晶性粉末，能溶于水，不溶于甲醇、乙醇、醚、苯、丙酮、氯仿和乙醇乙酯，无臭，稍有甜味。在中性溶液中不稳定，在醇、碱或热水中易分解成谷氨醇或丙酯化为吡咯羧醇，无臭，有微甜味。分子式：C5H10N2O3，分子量：146.15。L-谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，在体内可以由葡萄糖转变而来。
本发明提供的用于培养岩黄连细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加的添加剂包括肌醇、谷胱甘肽、6-苄基腺嘌呤和绿原酸等。在本发明的各种培养基的成分中，基础培养基能够提供岩黄连的生存和最低的生理活动。在本发明培养基中使用的肌醇，能够提供岩黄连细胞所需营养素，促进岩黄连细胞的发育。在本发明培养基中使用的谷胱甘肽，能够诱导细胞的增殖，避免过氧化物对岩黄连细胞的损害。在本发明培养基中使用的6-苄基腺嘌呤，可促进岩黄连细胞生长，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老。在本发明培养基中使用的活性炭，能够吸附岩黄连生长中代谢的有毒物质，但是，活性炭在吸附培养基中的有害物质的同时，也能吸附生长调节物质和其它培养基中的成分，发明人在使用活性炭时，考虑到活性炭的两面性，经大量实验，得到合适的活性炭与培养基中生长调节物质的配比，使其都能更好的发挥作用。在本发明培养基中使用的尿嘧啶，对岩黄连细胞的分裂起促进作用。在本发明培养基中使用的L-谷氨酰胺，作为岩黄连细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。发明人意外发现，在本发明培养基中使用绿原酸，能够与其它成分协同作用，促进岩黄连细胞生长增殖。在本发明培养基中使用的甘油酸和果糖，起到提供碳源的作用。本发明用于培养岩黄连细胞的培养基搭配合理，各成分间协同作用，能提供岩黄连细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，促进岩黄连细胞的增殖。
与现有技术相比，本发明提供的用于培养岩黄连细胞的培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的用于培养岩黄连细胞的培养基，能提供岩黄连细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境。
(2)本发明提供的用于培养岩黄连细胞的培养基，成分明确且价格较低。
(3)本发明提供的用于培养岩黄连细胞的培养基，繁殖率高，可明显缩短岩黄连的生长繁殖周期。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明MS培养基可购自上海研生生化试剂有限公司；White培养基可购自青岛海博生物技术有限公司。
实施例1、一种用于培养岩黄连细胞的培养基
所述用于培养岩黄连细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：肌醇20mg/L，谷胱甘肽15μg/L，6-苄基腺嘌呤10mg/L，硝酸钠1.5mM，活性炭0.05g/L，绿原酸28μg/L，尿嘧啶2mg/L，氯化钙2mg/L，L-谷氨酰胺0.02mg/L，甘油酸12mg/L和果糖10g/L。
所述基础培养基为MS培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入肌醇、硝酸钠、尿嘧啶、氯化钙和果糖，搅拌18分钟，加入谷胱甘肽、6-苄基腺嘌呤、活性炭、绿原酸和L-谷氨酰胺，继续搅拌15分钟，加入甘油酸，搅拌12分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.7，灭菌温度为118℃，灭菌时间为18分钟，即得。
实施例2、一种用于培养岩黄连细胞的培养基
所述用于培养岩黄连细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：肌醇40mg/L，谷胱甘肽25μg/L，6-苄基腺嘌呤13mg/L，硝酸钠2.5mM，活性炭0.15g/L，绿原酸36μg/L，尿嘧啶5mg/L，氯化钙3mg/L，L-谷氨酰胺0.08mg/L，甘油酸20mg/L和果糖18g/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入肌醇、硝酸钠、尿嘧啶、氯化钙和果糖，搅拌25分钟，加入谷胱甘肽、6-苄基腺嘌呤、活性炭、绿原酸和L-谷氨酰胺，继续搅拌23分钟，加入甘油酸，搅拌12分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.9，灭菌温度为118℃，灭菌时间为25分钟，即得。
实施例3、一种用于培养岩黄连细胞的培养基
所述用于培养岩黄连细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-苄基腺嘌呤12mg/L，硝酸钠2.2mM，活性炭0.09g/L，绿原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化钙2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L，甘油酸17mg/L和果糖15g/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入肌醇、硝酸钠、尿嘧啶、氯化钙和果糖，搅拌23分钟，加入谷胱甘肽、6-苄基腺嘌呤、活性炭、绿原酸和L-谷氨酰胺，继续搅拌17分钟，加入甘油酸，搅拌12分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.8，灭菌温度为118℃，灭菌时间为23分钟，即得。
对比例1、一种用于培养岩黄连细胞的培养基
所述用于培养岩黄连细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-苄基腺嘌呤12mg/L，硝酸钠2.2mM，活性炭0.09g/L，绿原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化钙2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L和果糖15.017g/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，没有添加甘油酸，增加果糖的浓度。
对比例2、一种用于培养岩黄连细胞的培养基
所述用于培养岩黄连细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-苄基腺嘌呤12mg/L，硝酸钠2.2mM，活性炭0.09g/L，异绿原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化钙2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L，甘油酸17mg/L和果糖15g/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将绿原酸替换为异绿原酸。
对比例3、一种用于培养岩黄连细胞的培养基
所述用于培养岩黄连细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-苄基腺嘌呤0.051g/L，硝酸钠2.2mM，活性炭0.051g/L，异绿原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化钙2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L，甘油酸17mg/L和果糖15g/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将6-苄基腺嘌呤和活性炭的终浓度均调整为0.051g/L。
试验例一、本发明用于培养岩黄连细胞的培养基对岩黄连细胞的培养效果
1、试验对象：本发明实施例1-3所得用于培养岩黄连细胞的培养基，以及对比例1-3所得用于培养岩黄连细胞的培养基。
2、试验方法：
将经愈伤组织诱导得到的稳定快速生长的岩黄连细胞系进行继代培养，接种8g鲜重细胞到250mL三角瓶中，分别以本发明实施例1-3所得用于培养岩黄连细胞的培养基，以及对比例1-3所得用于培养岩黄连细胞的培养基为继代培养基，进行培养，每瓶盛100mL培养基。置于摇床中进行悬浮培养，摇床转速120r/min，培养温度25℃，每天连续光照16h，光照强度为2000Lx。培养两周后，进行生物量测定。
测定生物量方法：培养物经布式漏斗抽滤，得到细胞鲜重，然后将所得细胞置50℃烘箱干燥至恒重，称重得到细胞干重。结果如表1所示。
表1：不同培养基所得细胞鲜重和干重比较
由表1可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3制备的培养基中所得细胞的鲜重和干重，明显高于生长在对比例1-3制备的培养基中所得细胞鲜重和干重。这说明，本发明实施例1-3制备的用于培养岩黄连细胞的培养基，更有利于岩黄连细胞的生长增殖。