一种骨髓抑制小鼠模型的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学技术领域。具体涉及一种骨髓抑制小鼠模型的建立方法。
【背景技术】
[0002]骨髓抑制是大多数化疗、放疗药物共有的不良反应，表现为外周血单系或全系血细胞减少等造血系统的改变。环磷酰胺导致骨髓抑制的研究已有不少报道，但是采用环磷酰胺复制骨髓抑制模型尚无统一标准，环磷酰胺的使用剂量及时间尚存在争议，导致骨髓抑制动物模型的成模率低、可重复性差，从而影响其发病机理及药物防治骨髓抑制的疗效研究。
[0003]如何建立一种明确的、可重复性的骨髓抑制动物模型，对深入研究其发病机制及探讨其有效防治方法，以及验证各种抗骨髓抑制药物的疗效和作用机理，都是一项至关重要的课题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了解决目前骨髓抑制动物模型的成模率低、可重复性差的问题，提供一种成模率高、可重复性好的骨髓抑制小鼠模型的建立方法。本发明公开的建立骨髓抑制模型的方法，操作简单，成模率高，可重复性好，可以用于各种实验动物，为骨髓抑制实验研究奠定了基础，有利于客观、准确的验证各种药物防治骨髓抑制的疗效及作用机理，有利于进一步指导临床治疗方案的选择与评价，有利于指导治疗骨髓抑制新药的药理实验与开发研制。
[0005]为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案:
[0006]骨髓抑制小鼠模型的建立方法，选择6周龄N0D/SCID雄性小鼠55只，随机分为正常组、对照组及模型I组、模型2组、模型3组、模型4组。除正常组外，其余各组再分为a组(连续给药组)、b组(隔日给药组)，共11小组，每组5只。模型组分别经腹腔连续注射及隔日注射不同剂量环磷酰胺(50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg)，对照组以生理盐水代替，正常组不加任何干预措施，观察15d，评价各组小鼠存活率、外周血细胞数、骨髓病理形态、骨髓造血干细胞阳性率。
[0007]下面通过详细的实验结果来说明本发明一一骨髓抑制小鼠模型的建立方法。
[0008]I材料和方法
[0009]1.1材料
[0010]1.1.1实验动物及分组选用6周龄勵0/^10雄性小鼠55只，体重(23±4化，3??级，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，饲养在上海中医药大学实验动物中心室内，室温(27± I) °C，食用全价营养颗粒饲料。适应性喂养3天，随机分为5大组(正常组、对照组、模型I组、模型2组、模型3组、模型4组)，除正常组外，每组再分为a组(连续给药组)、b组(隔日给药组)，共11小组，每组5只。
[0011]1.1.2药物及试剂环磷酰胺注射液，购自江苏恒瑞医药股份有限公司。LineageCell Deplet1n Kit试剂盒，购自德国美天旎Miltenyi公司。生物素化抗体(CD3e、B220、Grl、Terll9、Macl)，购自BD Pharmingen公司。抗生物素微磁珠(Magnetic Beads)，购自德国美天旎Miltenyi公司。Sca — 1、c 一Kit抗体，购自eB1science公司。
[0012]1.1.3仪器设备LEICA—RM2135型切片机，LEICA—DME光学显微镜，上海徕卡显微系统有限公司。RT-7300全自动血细胞分析仪，中国深圳雷杜公司。BD Accuri C6流式细胞仪，美国BD公司。
[0013]1.2 方法
[0014]1.2.1给药方法根据初始体重给药，除正常组、对照组外，其余各组以环磷酰胺腹腔注射。
[0015]正常组:不加任何干预措施。
[0016]对照a组:生理盐水腹腔注射，每日I次，连续3d。
[0017]对照b组:生理盐水腹腔注射，隔日I次，连续3次。
[0018]模型Ia组:50mg/kg体重，每日I次，连续3d。
[0019]模型2a组:100mg/kg体重，每日I次，连续3d。
[0020]模型3a组:150mg/kg体重，每日I次，连续3d。
[0021 ] 模型4a组:200mg/kg体重，每日I次，连续3d。
[0022]模型Ib组:50mg/kg体重，隔日I次，连续3次。
[0023]模型2b组:100mg/kg体重，隔日I次，连续3次。
[0024]模型3b组:150mg/kg体重，隔日I次，连续3次。
[0025]模型4b组:200mg/kg体重，隔日I次，连续3次。
[0026]实验自给药开始起，连续观察15天。
[0027]1.2.2观察症状体征实验自开始起，每周称重I次，观察小鼠的体形、毛色、步态、觅食及活动情况，并记录动物每天死亡只数。
[0028]1.2.3外周血细胞数实验自开始起，每3日尾部取血I次，2mM EDTA/PBS稀释50倍，全自动血细胞分析仪检测外周血白细胞、红细胞、血小板数。
[0029]1.2.4观察骨髓病理形态第15日用颈椎脱臼法处死小鼠，取右侧股骨，4%多聚甲醛固定24小时，10 %EDTA脱钙液脱钙28d，石蜡包埋，分别制成4张厚约4m连续石蜡切片，将石蜡切片置于37°C烤箱过夜后，经二甲苯脱蜡后梯度乙醇复水，苏木精染色5min，经1%盐酸乙醇分色，自来水充分冲洗蓝化后，再用0.1 %伊红复染5min，最后经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，封片。普通光镜下观察骨髓组织切片病理形态的改变。
[0030]1.2.5骨髓造血干细胞阳性率取左侧股骨、双侧髋骨、双侧胫骨，置于5ml含2mMEDTA的PBS液中，用3ml注射器反复冲洗骨髓腔，收集全部骨髓细胞，Ficoll密度梯度离心法分选BMNC细胞，MACS冲洗I遍，Lineage Cell Deplet1n免疫磁珠分选Lin—细胞(根据试剂盒操作)，加入SAV-FITC、Scal —PE、c 一Kit-APC荧光抗体，冰上孵育30min，MACS冲洗I遍，流式细胞仪检测骨髓造血干细胞(Lineage——Scal+—c-Ki t+，LSK细胞)阳性率。
[0031 ] 2 结果
[0032]2.1症状表现
[0033]除正常组外，其它各组小鼠于造模后逐渐均出现体重、体温下降，活动减少，反应迟钝，畏寒蜷卧，体毛疏松，失去光泽，进食量、饮水量减少，尿量增多等表现，于造模后第9 一 12天左右，上述症状达到最高峰。造模后第15天开始，上述症状逐渐减轻。
[0034]2.2存活率统计
[0035]与正常组相比，对照a组、对照b组、模型Ia组、模型Ib组、模型2a组、模型2b组及模型3b组未出现死亡，模型3a组出现少量死亡，模型4a组、模型4b组在观察期间出现大量死亡或全部死亡(图1)。
[0036]2.3外周血细胞数
[0037]我们将无小鼠死亡的组别一一正常组、生理盐水a组、生理盐水b组、模型Ia组、模型Ib组、模型2a组、模型2b组以及模型3b组外周血细胞数进行比较，结果如下:
[0038]2.3.1白细胞数
[0039]与正常组比较，生理盐水Ia组、生理盐水Ib组、模型Ia组、模型Ib组各时间点白细胞数未见明显差异(P>0.05)。模型2a组、模型2b组白细胞数自第3日起呈现逐渐下降趋势，第9日开始逐渐上升，至15日时基本恢复正常。模型3b组在第6日时下降到最低点(P〈0.01),至15日时，仍保持在较低水平，与正常组比较，差异有非常显著性意义(P〈0.01)(图2)。
[0040]2.3.2红细胞数
[0041 ] 与正常组比较，生理盐水Ia组、生理盐水Ib组、模型Ia组、模型Ib组各时间点红细胞数未见明显差异。模型2a组、模型2b组、模型3b组红细胞数自第3日起呈现逐渐下降趋势。其中，模型2a组在第9日时下降到最低点、模型2b组在第6日时下降到最低点，其后逐渐恢复。模型3b组在第12日时下降到最低点(P〈0.01)，至15日时仍保持在较低水平(P〈0.01)(图
3)0
[0042]2.3.3血小板数
[0043]与正常组比较，生理盐水Ia组、生理盐水Ib组、模型Ia组、模型Ib组各时间点血小板计数未见明显差异。模型2a组、模型2b组、模型3b组血小板数自第3日起呈现逐渐下降趋势，其中，模型2b组在第9日时下降到最低点，模型2a组、模型3b组在第12日时下降到最低点(Ρ〈0.01)(图4)。
[0044]2.4普通光镜观察结果
[0045]普通光镜观察正常组、生理盐水Ib组、模型3b组骨髓组织病理形态，结果如下:
[0046]正常组、生理盐水Ib组:小鼠骨髓组织结构完整，可见大量红细胞、单核细胞及巨核细胞，