抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法

专利名称：抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及慢病毒表达载体，尤其是一种抗pl85MbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法。
背景技术：
C-erbB2/HER2/neu编码产物p 185ertB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体(EGFR)家族成员。C-erbB2/HER-2/neu基因的扩增和pl85eAB2蛋白的过度表达见于多种恶性肿瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。pl85OTbB2过度表达提示肿瘤预后差，如 转移、复发、易耐药及存活期短等。因此，pl85erbB2作为肿瘤抗原，是一个理想的肿瘤治疗靶点。1998年10月，美国食品及药物管理局(FDA)正式批准将一株抗pl85ertB2人源化抗体Trastuzumab (商品名Herceptin)用于临床治疗pl85MbB2高表达的转移性乳腺癌。但是，国外进口抗体药物价格昂贵，如何开发出拥有自主知识产权的抗pl85OTbB2基因工程抗体对于国内患者具有十分重要的实际意义，其中，表达载体构建尤为关键。目前对鼠单抗的人源化技术包括将鼠单抗恒定区替换为人的恒定区的嵌合抗体；将鼠单抗除互补决定区外的部分均替换为人的序列的改型抗体；将抗体片段进行改型的小片段抗体(包括=Fab片段、单链抗体和双链抗体等)；从抗库中直接筛选人抗体基因的抗体库技术。许多临床应用研究已经证明，大多数嵌合抗体在人体内只引起极弱的、甚至未引起HAMA反应，同时嵌合抗体较改型抗体和小分子抗体能更好地保持亲本鼠单抗的亲合力和特异性，而且构建表达技术较改型抗体和噬菌体抗体库技术更成熟、简单和成本低。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗p 185OTbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，为今后抗pl85OTbB2嵌合抗体的基础研究及临床应用奠定了基础。为解决上述技术问题采用如下技术方案抗pl85erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，该载体是pWPI/H-IRES-L，其中H和L分别是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体重链基因(SEQ.ID. No. 2)和抗pl85erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因(SEQ. ID. No. I)。上述抗P185OTbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，利用PCR法扩增出抗人pl85ertB2鼠源性单抗可变区基因vH和vL以及人IgGl的恒定区基因Y I和K ;再采用三引物PCR法将vH和Yl，vL和K进行拼接，得到嵌合重链H和嵌合轻链L基因，分别插入质粒pVAXl/IRES的IRES元件的上、下游；用内切酶将H-IRES-L从pVAXl/H-IRES-L上切下，插入慢病毒载体pWPI中，即得。上述抗P185ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤<1>鼠抗人P185ertB2单抗轻、重链可变区基因(vL、vH)和人IgGl轻、重链恒定区基因、Yl)的扩增以质粒pSRNC/C K -ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用L-A和L-B、Kappa-A和Kappa-B扩增出带信号肽的轻链可变区基因vL和人IgGl轻链恒定区基因k ；以质粒pSRDC/C y 1-ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用H-A和H-B、gammal_A和gammal-B扩增出带信号肽的鼠单抗重链可变区基因vH和人IgGl重链恒定区基因、I ;扩增反应条件为94°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸lmin 30s，35个循环，72°C延伸IOmin ;用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物；<2>嵌合轻链基因L和嵌合重链基因H的拼接按照三引物PCR法，以vL和K为模板，用HiFiTaq DNA聚合酶将两者拼接成嵌合轻链基因L ;以vH和Y I为模板，用HiFiTaq DNA聚合酶将两者拼接成嵌合重链基因H ；第一步在加入模板vL和K或vH和？1，不加引物的情况下，941预变性51^11，941变性lmin, 50°C退火lmin, 72°C延伸lmin, 10个循 环；第二步加入引物L-A和Kappa-B或H-A和gammal-B, 94°C变性 lmin,55°C退火 lmin, 72。。延伸 2m in 15s, 35 个循环,72°C延伸 IOmin ；TP-PCR拼接产物嵌合轻链L或嵌合重链H经过胶回收试剂盒纯化回收后克隆至EZ-T载体，进一步测序验证；<3> 中间质粒 pVAXl/H-IRES-L 的构建用Nsi I和Xba I酶切嵌合轻链L的PCR产物以及质粒PVAX1/IRES，分别经琼脂糖凝胶电泳，纯化回收后，在T4连接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化DH-5a感受态细菌，抽提质粒后经PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆；进而用BamH I和Pvu I酶切嵌合重链H的PCR产物以及含有嵌合轻链的质粒pVAXl/IRES-L，按上述实验步骤构建并筛选出含嵌合重链的阳性克隆，经基因测序验证，获得共表达嵌合轻、重链的重组质粒PVAXl/H-IRES-L ；<4>慢病毒表达质粒pWPI/H-IRES-L的构建测序正确的pVAXl/H-IRES-L质粒用Pme I单酶切，琼脂糖凝胶分离纯化，用凝胶回收试剂盒回收片段H-IRES-L ;同时，用PmeI酶切慢病毒表达质粒pWPI，经SAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶与H-IRES-L连接，连接产物转化DH-5a感受态细菌，抽提质粒后用载体测序引物EFl a和重链下游引物gammal-B作PCR，筛选正向插入阳性克隆pWPI/H-IRES-L，并进行测序验证，即得；上述各引物为H-A :5’ -CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，H-B :5’ -GGG GAA GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA TGA GGA GAC GGT GAC CGAGGT-3，；gamma I-A :5’ -TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC-3，，gammal-B :5，-ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG-3，；L-A :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3，，L-B :5，-GAT GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AGT GAT CAC CAC CTT GGT CCCCCC-3，；Kappa-A :5，-ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC-3，，Kappa-B :5，-GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，；EFla :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，。本发明在已经克隆了抗人pl85eAB2鼠单抗的轻、重链可变区基因的基础上，以内部核糖体进入位点(IRES)连接人鼠嵌合轻、重链，构建抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体全长基因，并且选择慢病毒载体系统作为嵌合抗体基因转移的工具，从而构建了抗pl85MbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体。慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以目的基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能转染终末分化细胞和非分裂细胞，整合于靶细胞基因组的目的基因能够长期、稳定表达，被常用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。本发明构建抗pl85MbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，为肿瘤基因工程抗体的治疗研究奠定了基础。


图I是本发明重组慢病毒表达载体pWPI/H-IRES-L的构建策略图。图2是抗人pl85ertB2鼠单抗可变区基因vL、vH和人IgGl恒定区基因k、Y I的PCR产物电泳图，图中M DNA marker DL2000，I含信号肽的轻链可变区(vL)，2含信号肽的重链可变区(vH)，3人IgGl的K链恒定区，4人IgGl的Y I链恒定区。图3是抗人pl85eAB2单抗嵌合轻、重链融合基因的PCR产物电泳图，图中MDNAmarkerDL2000,1 5嵌合轻链基因(L)，6 10嵌合重链基因(H)。图4 是质粒 pVAXl/H-IRES-L 的鉴定电泳图，图中M DNA marker DL10000,lpVAXl/IRES 质粒，2pVAXl/IRES-L 质粒，3pVAXl/H_IRES_L 质粒，4pVAXl/H_IRES_L 的 BamHI和Xba I双酶切产物。图5是慢病毒表达质粒pWPI/H-IRES-L的酶切和PCR鉴定电泳图，图中M DNAmarkerDLlOOOO, IpffPI 质粒，2 5 及 13pWPI/H_IRES_L 质粒，6 I 嵌合轻链基因(L)，8 9嵌合重链基因(H)，10 11载体引物EFla与重链下游引物gammal-B对正向连接质粒的PCR扩增条带，12pffPI/H-IRES-L的Pme I酶切产物。图6是慢病毒质粒在293T细胞中的GFP表达荧光显微镜观察图。图中A B空载体pWPI在293T细胞中的GFP表达(A荧光视野，B可见光视野)，C D重组慢病毒质粒pWPI/H-IRES-L在293T细胞中的GFP表达(C荧光视野，D可见光视野)。图7是抗pl85ertB2单抗嵌合轻、重链表达的RT-PCR鉴定电泳图，图中MDNAmarkerDL2000,1 2嵌合抗体轻链基因，3 4嵌合抗体重链Fd片段。
具体实施例方式抗P185MbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法研究I材料与方法I. I质粒、菌株和细胞
含有IRES的质粒PVAXl/IRES由军事医学科学院基础医学研究所惠赠。慢病毒表达质粒pWPI为加拿大渥太华大学临床肿瘤中心实验室惠赠。转化用大肠杆菌DH-5 a、293T细胞、质粒pSRNC/C K -ZC26 (含有抗pl85OTbB2鼠单抗轻链可变区基因vL和人IgGl轻链恒定区基因K )和质粒PSRDC/C y 1-ZC26 (含有抗p 185erbB2鼠单抗重链可变区基因vH和人IgGl重链恒定区基因Yl)均为广西壮族自治区肿瘤防治研究所保存。I. 2工具酶和主要试剂
限制酶BamH I、Pvu I、Nsi I、Xba I、Pme I、T4DNA连接酶等均购自纽英伦生物技术公司。HiFiTaq DNA聚合酶、小量质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、EZ-T载体快速连接试剂盒购自Genstar公司。DNA marker> Pyrobest DNA聚合酶、奸碱性磷酸酶(SAP)购自大连宝生物工程有限公司。E. Z.N.A.⑧无内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。TRIzol试齐[|、LipofectamineTM2000 购自 Invitrogen 公司。逆转录试剂盒购自 MBI Fermentas 公司。100mL/L胎牛血清购自四季青生物公司。羊抗人IgG-HRP购自Sigma公司。人erbB2胞外区重组蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司。PCR引物合成及产物测序由Invitrogen公司完成。I. 3 引物嵌合抗体轻、重链的扩增引物按照三引物PCR(TP-PCR)法设计。 扩增带信号肽的重链可变区基因的引物为H-A(SEQ. ID. No. 3) :5’ -CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3’(含 BamH I 酶切位点 GGA TCC)，H-B (SEQ. ID. No. 4) :5，-GGG GAA GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA TGA GGA GACGGT GAC CGA GGT-3’(其中，人 IgGl 恒定区基因 GGG GAA GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA,鼠抗人pl85eAB2单抗可变区基因TGA GGA GAC GGT GAC CGA GGT);扩增人IgGl重链恒定区基因的引物为gammal-A(SEQ. ID. No. 5) :5，-TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC-3，，gammal-B (SEQ. ID. No. 6) :5，-ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAGAG-3’ (含 Pvu I 酶切位点 C GAT CG)；扩增带信号肽的轻链可变区基因的引物为L-A(SEQ. ID. No. 7) :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3，(含 Nsi I 酶切位点 ATG CAT)，L-B (SEQ. ID. No. 8) :5，-GAT GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AGT GAT CAC CACCTT GGT CCC CCC-3，(其中，人 IgGl 恒定区基因 GAT GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AGT，鼠抗人 pl85eAB2 单抗可变区基因 GAT CAC CAC CTT GGT CCC CCC)；扩增人IgGl轻链恒定区基因的引物为Kappa-A(SEQ. ID. No. 9) :5，-ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC-3，，Kappa-B (SEQ. ID. No. 10) :5，-GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAAGCT-3’ (含 Xba I 酶切位点 TCT AGT)；pWPI质粒克隆位点前的测序引物为EFla (SEQ. ID. No. 11) :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，;用于检测抗人pl85erbB2嵌合抗体重链mRNA表达的引物为H-F(SEQ. ID. No. 12) :5，-AAG TCC AAC TGC AGC AGT CTG G-3，，H-R(SEQ. ID. No. 13) :5，-CTC GGG GCT GCC CTT TGG-3’ ；用于检测抗人 pl85erbB2嵌合抗体轻链mRNA表达的引物为L-F(SEQ. ID. No. 14) :5，-GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA-3，，L-R(SEQ. ID. No. 15) :5，-CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，。I. 4鼠抗人pl85ertB2单抗轻、重链可变区基因(vL、vH)和人IgGl轻、重链恒定区基因(K、Yl)的扩增以质粒pSRNC/C K -ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用L-A和L-B、Kappa-A和Kappa-B扩增出带信号肽的轻链可变区基因vL(SEQ. ID. No. 16)和人IgGl轻链恒定区基因K (SEQ. ID. No. 17)；以质粒pSRDC/C y 1-ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用H-A和H-B、gamma I-A和gammal-B扩增出带信号肽的鼠单抗重链可变区基因vH(SEQ. ID. No. 18)和人IgGl重链恒定区基因y I (SEQ. ID. No. 19)，扩增反应条件为94°C预变性 5min, 94°C变性 lmin, 56°C退火 lmin, 72°C延伸 lmin 30s, 35 个循环,72°C延伸 IOmin ；用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物。I. 5嵌合轻链基因(L)和嵌合重链基因(H)的拼接
按照三引物PCR(TP-PCR)法，以vL和k为模板，用HiFiTaq DNA聚合酶将两者拼接成嵌合轻链基因(L);以沾和Yl为模板，用HiFiTaq DNA聚合酶将两者拼接成嵌合重链基因01)。第一步在加入模板(vL和K或vH和？1)，不加引物的情况下，941预变性5min, 94°C变性lmin, 50°C退火lmin, 72。。延伸lmin, 10个循环。第二步加入引物(L-A和Kappa-B 或H-A和 gammal-B), 94°C变性 lmin, 55°C退火 lmin, 72°C延伸 2minl5s, 35 个循环，72°C延伸lOmin。TP-PCR拼接产物(嵌合轻链L或嵌合重链H)经过胶回收试剂盒纯化回收后克隆至EZ-T载体，进一步测序验证。I. 6 中间质粒 pVAXl/H-IRES-L 的构建用Nsi I和Xba I酶切嵌合轻链L的PCR产物以及质粒PVAX1/IRES，分别经琼脂糖凝胶电泳，纯化回收后，在T4连接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化DH-5a感受态细菌，抽提质粒后经PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆。进而用BamH I和Pvu I酶切嵌合重链H的PCR产物以及含有嵌合轻链的质粒pVAXl/IRES-L。按上述实验步骤构建并筛选出含嵌合重链的阳性克隆，经基因测序验证，获得共表达嵌合轻、重链的重组质粒PVAXl/H-IRES-L0I. 7慢病毒表达质粒pWPI/H-IRES-L的构建测序正确的pVAXl/H-IRES-L质粒用Pme I单酶切，琼脂糖凝胶分离纯化，用凝胶回收试剂盒回收片段H-IRES-L。同时用PmeI酶切慢病毒表达质粒pWPI，经SAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶与H-IRES-L连接，连接产物转化DH_5 a感受态细菌，抽提质粒后用载体测序引物EFl a和重链下游引物gammal-B作PCR，筛选正向插入阳性克隆pWPI/H-IRES-L，并进行测序验证。慢病毒表达质粒pWPI/H-IRES-L的构建策略见图I。I. 8嵌合抗体在293T细胞中的表达I. 8. I检测绿色荧光蛋白GFP的表达按照LipofectinTM2_说明书分别用重组慢病毒表达载体pWPI/H-IRES-L和空载体pWPI转染293T细胞，以未转染的293T细胞为空白对照。转染后48h，通过荧光显微镜观察293T细胞GFP表达情况。I. 8. 2RT-PCR检测嵌合抗体mRNA的表达用Trizol —步法提取293T细胞总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，用RT-PCR鉴定嵌合抗体在转录水平上的表达。以L-F为5'端引物，以L-R为3'端引物扩增人-鼠嵌合抗体轻链。以H-F为5'端引物，以H-R为3'端引物扩增人-鼠嵌合抗体重链Fd片段。I. 8. 3直接ELISA检测嵌合抗体的表达
以5mg/L人erbB2胞外区重组蛋白包被酶标板，4 V过夜，50g/L BSA的封闭液37 °C封闭2h后，分别加入pWPI/H-IRES-L和pWPI感染后的293T细胞培养上清液，以及未感染的293T细胞上清，同时以PBS为对照。37°C孵育2h，经常规洗涤，加入羊抗人IgG-HRP酶标抗体孵育，OPD显色，室温避光反应5min，酶联免疫仪测定A490值，检测细胞是否分泌人鼠嵌合抗体，及其嵌合抗体是否具有与人erbB2胞外区抗原结合的特异性。计量数据采用平均数土标准差表示，采用DPS 7. 05统计软件进行方差分析。2 结果2. I抗pl85ertB2鼠单抗轻、重链可变区基因和人IgGl轻、重链恒定区基因的扩增以质粒pSRNC/C K -ZC26为模板，用引物L_A和L-B扩增出带信号肽的鼠单抗轻链可变区基因vL，大小约500bp ;用引物Kappa-A和Kappa-B扩增出人IgGl轻链恒定区基因K，大小约330bp ；以质粒pSRDC/C y 1-ZC26为模板，用引物H-A和H-B扩增出带信号肽的鼠单抗重链可变区基因vH,大小约550bp ;用引物gammal-A和gammal-B扩增出人IgGl重 链恒定区基因Y 1，大小约1600bp(图2)。2. 2人鼠嵌合轻链基因L和嵌合重链基因H的拼接采用TP-PCR法，以vL和K为模板，以L-A和Kappa-B为引物，用HiFiTaq酶将两者拼接成嵌合轻链基因(L)，大小约810bp ;以vH和Yl为模板，以H-A和gammal-B为引物，用HiFiTaq酶将两者拼接成嵌合重链基因(H)，大小约2100bp (图3)。纯化回收后的嵌合轻、重链基因经Invitrogen公司测序，全长测序结果显示嵌合轻、重链基因均成功获得，无任何突变。2. 3 中间质粒 pVAXl/H-IRES-L 的构建将嵌合轻链通过Nsi I和Xba I双酶切克隆入质粒pVAXl/IRES，获得含有嵌合轻链的质粒pVAXl/IRES-L，进而将嵌合重链通过BamH I和Pvu I双酶切克隆人质粒pVAXl/IRES-L，获得共表达嵌合轻、重链的重组质粒pVAXl/H-IRES-L。用BamH I和Xba I双酶切鉴定，酶切片段为 3000bp (pVAX)和 3500bp (H-IRES-L)(见图 4)。 2. 4慢病毒表达质粒pWPI/H-IRES-L的构建将测序正确的pVAXl/H-IRES-L用Pme I单酶切后，切胶回收片段H-IRES-L，并且用PmeI酶切慢病毒表达质粒pWPI，将片段H-IRES-L插入克隆位点。为了确保H-IRES-L基因连接方向的正确，WpWPI载体上的引物EFl a和重链下游引物gammal-B作PCR，若插入的融合基因是正向的，PCR应扩增出大小为2400bp的片段，若基因插入方向是反向的，则PCR扩增不出条带。并且用Pme I酶切鉴定，酶切片段为llOOObp(pWPI)和3500bp (H-IRES-L)(图5)。测序结果显示成功构建了含抗人pl85eAB2人鼠嵌合抗体全长基因的慢病毒表达载体pWPI/H-IRES-L。2. 5重组慢病毒质粒pWPI/H-IRES-L在293T细胞中的荧光表达转染后48h，荧光显微镜下观察293T细胞转染pWPI和pWPI/H-IRES-L的293T细胞都有GFP表达，未转染239T细胞则无荧光表达。其中，转染pWPI/H-IRES-L的293T细胞中GFP的表达量较转染pWPI的293T细胞明显减少(见图6)。可见，当空载体pWPI插入了一个较大的嵌合抗体片段(约3. 5Kb)后，其转染效率会降低。2. 6从转录水平上鉴定嵌合抗体轻、重链基因的表达经RT-PCR检测，转染重组慢病毒载体pWPI/H-IRES-L后，293T细胞有嵌合轻链基因和嵌合重链基因的表达(图7)。2. 7嵌合抗体的表达及特异性鉴定用人erbB2胞外区抗原包被酶标板，用HRP标记的羊抗人IgG为二抗，进行直接ELISA检测。结果显示，转染pWPI/H-IRES-L的细胞上清为阳性反应，而转染空载体pWPI的细胞上清和未转染的细胞上清为阴性反应(见表I)。这表明转染pWPI/H-IRES-L后的293T细胞上清中分泌有嵌合抗体，而且嵌合抗体具有与人erbB2胞外区抗原结合的特异性。表I直接ELISA分析嵌合抗体的特异性
权利要求
1.一种抗pl85eAB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于该载体是pWPI/H-IRES-L，其中H和L分别是抗pl85eAB2人鼠嵌合抗体重链基因和抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体轻链基因。
2.根据权利要求I所述抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于利用PCR法扩增出抗人pl85ertB2鼠源性单抗可变区基因vH和vL以及人IgGl的恒定区基因Y1和K ;再采用三引物PCR法将vH和yl，vL和K进行拼接，得到嵌合重链H和嵌合轻链L基因，分别插入质粒pVAXl/IRES的IRES元件的上、下游；用内切酶将H-IRES-L从pVAXl/H-IRES-L上切下，插入慢病毒载体pWPI中，即得。
3.根据权利要求2所述抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤 <1>鼠抗人pl85ertB2单抗轻、重链可变区基因vL、vH和人IgGl轻、重链恒定区基因K、Y I的扩增以质粒pSRNC/C K -ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用L-A和L-B、Kappa_A和Kappa-B扩增出带信号肽的轻链可变区基因vL和人IgGl轻链恒定区基因k ;以质粒pSRDC/C Y 1-ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用H-A和H_B、gamma I-A和gammal-B扩增出带信号肽的鼠单抗重链可变区基因vH和人IgGl重链恒定区基因、I ;扩增反应条件为94°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸Imin 30s，35个循环，72°C延伸IOmin ;用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物； <2>嵌合轻链基因L和嵌合重链基因H的拼接 按照三引物PCR法，以vL和K为模板，用HiFiTaq DNA聚合酶将两者拼接成嵌合轻链基因L ;以vH和Y I为模板，用HiFiTaq DNA聚合酶将两者拼接成嵌合重链基因H ;第一步在加入模板vL和K或vH和Y 1，不加引物的情况下，94°C预变性5min，94°C变性lmin，50°C退火lmin,72°C延伸lmin, 10个循环；第二步加入引物L-A和Kappa-B或H-A和gammal-B,94°C变性 lmin, 55°C退火 lmin, 72°C延伸 2min 15s, 35 个循环，72°C延伸 IOmin ；TP-PCR 拼接产物嵌合轻链L或嵌合重链H经过胶回收试剂盒纯化回收后克隆至EZ-T载体，进一步测序验证； <3>中间质粒pVAXl/H-IRES-L的构建 用Nsi I和Xba I酶切嵌合轻链L的PCR产物以及质粒PVAX1/IRES，分别经琼脂糖凝胶电泳，纯化回收后，在T4连接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化DH-5a感受态细菌，抽提质粒后经PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆；进而用BamH I和Pvu I酶切嵌合重链H的PCR产物以及含有嵌合轻链的质粒pVAXl/IRES-L，按上述实验步骤构建并筛选出含嵌合重链的阳性克隆，经基因测序验证，获得共表达嵌合轻、重链的重组质粒pVAXl/H-IRES-L ； <4>慢病毒表达质粒pWPI/H-IRES-L的构建 测序正确的pVAXl/H-IRES-L质粒用Pme I单酶切，琼脂糖凝胶分离纯化，用凝胶回收试剂盒回收片段H-IRES-L ;同时，用PmeI酶切慢病毒表达质粒pWPI，经SAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶与H-IRES-L连接，连接产物转化DH_5 a感受态细菌，抽提质粒后用载体测序引物EFl a和重链下游引物gammal-B作PCR，筛选正向插入阳性克隆pWPI/H-IRES_L，并进行测序验证，即得； 所述各引物为H-A :5’ -CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T_3’，H-B :5’-GGG GAA GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA TGA GGA GAC GGT GAC CGA GGT-3’；gammaI-A :5’ -TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC-3’，gammal-B :5’ -ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG-3’ ；L-A :5’ -TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T_3’，L-B :5’-GAT GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AGT GAT CAC CAC CTT GGT CCC CCC-3’； Kappa-A :5’ -ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC-3’，Kappa-B :5’ -GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3’ ；EFl a :5’ -TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3’。
全文摘要
本发明公开了一种抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，利用PCR法扩增出抗人p185erbB2鼠源性单抗可变区基因(vH和vL)和人IgG1的恒定区基因(γ1和κ)，再采用三引物PCR法将vH和γ1，vL和κ进行拼接，得到嵌合重链(H)和嵌合轻链(L)基因，分别插入质粒pVAX1/IRES的IRES元件的上、下游，用内切酶将H-IRES-L从pVAX1/H-IRES-L上切下，插入慢病毒载体pWPI中，构建成慢病毒表达pWPI/H-IRES-L。经相应酶切和测序鉴定，与预期设计一致。转染293T细胞后，有嵌合重链和嵌合轻链基因的共同表达，而且嵌合抗体能够与p185erbB2分子特异性结合。本发明为今后抗p185erbB2工程抗体的研究奠定了基础。
文档编号C12N15/66GK102618582SQ201210079950
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月24日 优先权日2012年3月24日
发明者刘芳, 张玮, 李力 申请人:广西壮族自治区肿瘤防治研究所