一种人鼠嵌合单克隆抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 血管抑素受体（Angiostatin Receptor F1F0-ATP合成酶)对肿瘤细胞中ATP合成 起重要作用。在正常人体组织中，血管抑素受体主要在线粒体内膜上定位，但也有少量存在 于内皮细胞的细胞膜上。相对而言，很多肿瘤细胞超量表达血管抑素受体，并大量定位于细 胞膜上。因而肿瘤细胞膜上的血管抑素受体是一个潜在的抗肿瘤药物靶标。近年发现，ATP 合成酶不仅存在于线粒体内膜，在内皮细胞和肿瘤细胞质膜表面也有表达。
[0003] Moser和Pizzo (1995)对血管抑素(环饼域1-3)在内皮细胞表面的结合位点进行 了鉴定，通过对人脐静脉内皮细胞（HUVEC)膜组分进行配体杂交，成功分离了与血管抑素结 合的蛋白分子，大小约55kD，通过对获得的蛋白进行氨基末端测序、肽指纹图谱及免疫学分 析表明，抗肿瘤血管新生药血管抑素在该细胞表面的受体为人F1R)-ATP合成酶的a亚 基(基因名分别为ATP5A1和ATP5B)，通过流式细胞术和免疫荧光分析的方法证实，这一受 体在细胞表面的有所表达。另外，血管抑素能与重组ATP5A1结合，抗ATP5A1的抗体能将血 管抑素的抗细胞增殖效果抑制掉90%。综上所述，细胞表面的ATP5A1/ATP5B是血管抑素在 内皮细胞表面的受体，血管抑素可能通过与ATP5A1/ATP5B亚基的结合，抑制内皮细胞的增 殖和迁移，从而抑制血管新生。肿瘤的生长和转移需要异常的血管新生作为条件，通过抑制 新生血管生成而阻止肿瘤的发展和转移是肿瘤临床治疗中的一个有效的新方向。
[0004] 传统认为，人F1R)-ATP合成酶仅存在于细胞线粒体内膜，但Moser的发现表明其 在内皮细胞表面也有定位。在Moser的研究公开前，关于F1R)-ATP合成酶在细胞膜表面定 位的报道仅有一例，是定位于肿瘤细胞系A549的表面。在Moser的研究公开后，血管抑素 与细胞表面ATP合成酶的结合，又被其它的研究团体在不同的肿瘤细胞类型证实。在除内 皮细胞外的许多其它类型细胞，包括肿瘤细胞都发现了定位于细胞膜表面的F1R)-ATP合 成酶，这些类型的细胞都具有较强的增殖力，而在红细胞中未发现，这提示F1R)-ATP合成 酶也许能作为肿瘤标志物来检测，对肿瘤的早期诊断和预后具有重大的意义。
[0005] 在Mozer提出哺乳动物细胞存在某些线粒体蛋白定位于胞膜表面的现象后，涌现 出大量有关线粒体基质蛋白定位于胞膜的报道，而这些蛋白在其异常定位上往往也是有某 种功能的，如蛋白P32,又名gClq，是补体蛋白Clq的受体，提示定位于胞膜表面的F1R)_ATP 合成酶也在行使某种特殊的功能。在Mozer的研究中，膜表面的F1R)-ATP合成酶作为血管 抑素抑制增殖的靶点而被发现，随后发现的具有膜表达人F1R)-ATP合成酶的细胞都属于 增殖力较强的类型，提示膜表达的人F1R)-ATP合成酶可能具有促增殖作用，不仅是肿瘤的 标志，还可能是癌变的促因。如果能成功验证膜表达的人F1R)-ATP合成酶对肿瘤的促进作 用，将使其肿瘤靶标的地位进一步巩固，并可针对其促增殖功能设计相应的药物进行抑制， 以期特异高效地治疗肿瘤。
[0006] 近年来研究发现肿瘤细胞膜表面的F1R)_ATP合成酶还具有调节细胞内pH的作 用，对肿瘤细胞在酸性微环境下的存活具有重要意义。血管抑素对肿瘤细胞的杀伤作用也 被证明具有pH依赖性，低pH下血管抑素对细胞的毒性更强。Moser等还发现内皮细胞即使 在类似肿瘤微环境的PH6. 5-6. 7条件下，依然能维持正常的细胞内pH，而且检测到此时细 胞膜表面F1R)-ATP合成酶的活性更强。在低pH环境下对内皮细胞给予血管抑素会使细胞 内pH迅速降低，导致多种代谢酶失活而最终致使内皮细胞死亡。值得一提的是，正常pH下 血管抑素并不能导致内皮细胞死亡，这证明pH压力是血管抑素诱导内皮细胞死亡的首要 因素。因此，血管抑素阻断的F1R)-ATP合成酶质子转运在提高pH压力的内皮细胞敏感性 上起重要作用。这些结果证实了类似肿瘤偏酸性微环境条件下，细胞膜表面F1R)-ATP合成 酶对肿瘤细胞以及内皮细胞存活的决定性作用，进一步论证了细胞膜表达F1R)-ATP合成 酶作为肿瘤治疗靶标的可行性。
[0007] Chi等采用纯化的E. coli F1-ATP合成酶免疫小鼠，得到21株单克隆抗体(mAb)， 其中只有一株mAb是针对催化亚基ATP5B的，其余20株均是针对非催化亚基ATP5A1的，而 只有针对0亚基的那株mAb具有抑制F1-ATP合成酶活性的作用。而Mozer之前的研究报 道，血管抑素在HUVEC表面的受体由ATP5A1和ATP5B共同构成，本研究着重研究制备针对 ATP5B亚基制备的单克隆抗体并进行人源化，以期开发相应的抗体药物。
[0008] 19世纪末，人们用癌细胞免疫动物产生抗血清来治疗癌症。然而，由于抗血清是多 克隆抗体，其中含有众多分别针对不同抗原的抗体，缺乏特异性，故用其治疗癌症不可能取 得确切的疗效。
[0009] 20世纪后期，Georges Kohler和Cesar Milstein用细胞杂交技术使经绵羊红细 胞（SRBC)免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立了世界上首株B细胞杂交瘤细 胞株，该细胞株能长期、稳定地分泌特异、均质的分泌抗SRBC的单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb)。这一技术获得1984年的诺贝尔生理医学奖。mAb对抗原的高特异性使定 向攻击肿瘤细胞成为可能。之后的数十年里，mAb在疾病诊断领域成为常规试剂，而在治疗 领域对其的研究也迅速升温。
[0010] 在20世纪末期，由于目前技术的局限，制备的多为鼠杂交瘤，产生的mAb就多为 鼠源性，在人体中极易产生人抗鼠抗体（HAMA)反应，使mAb用于治疗的研究受到限制，进 入了低谷阶段。随着基因工程的发展，研究者把基因工程技术引入单抗研究，通过基因操 作的手段将鼠源mAb嵌合或人源化改造。最早报道的基因工程抗体是莫里森（Morrison) 等研制的人-鼠嵌合抗体，该技术对抗体的临床应用影响深刻，嵌合抗体是通过基因工程 将鼠源单抗可变区和人抗体恒定区拼接的抗体，相对于其它人源化抗体的优点在于其技术 路线简单；抗体完整性好，体内滞留期长，免疫原性大大降低。利妥昔单抗（rituximab)于 1997年获得FDA批准，是全球第一个上市的抗肿瘤mAb药物，用于治疗⑶20阳性的B淋 巴细胞性非霍奇金淋巴瘤，该抗体就是一个人鼠嵌合抗体，第一个用于临床的嵌合抗体是 阿来组单抗（alemtuzumab)，用于治疗非何杰金氏淋巴瘤和类风湿性关节炎。曲妥珠单抗 (trastuzumab)于1998年获批，是一种可以抑制HER-2/neu阳性乳腺癌的mAb药物，该抗体 是一个全人源化抗体。吉妥单抗（gemtuzumab ozogamicin)于2000年获批，用于治疗⑶33 阳性的急性复发性髓性白血病，该抗体也是一个人源化抗体。近年来，先后获批用于治疗肿 瘤的抗体药物还有 90Y-ibritumomab、131I-tositumomab、cetuximab 和 bevacizumab 等，其 中嵌合或人源化的抗体所占的比例逐年提升，全人抗体已成为治疗类抗体在抗体类型上必 然趋势。目前已有超过20种嵌合抗体已进入临床试验阶段，还有为数众多的嵌合或人源化 抗体处于临床前研究阶段。
[0011] 嵌合抗体可变区基因的克隆，通常是参考Kabat数据库中的抗体序列，针对抗体 可变区的保守区域设计若干套通用引物，采用RT-PCR法从杂交瘤细胞株或者病人的淋巴B 细胞的cDNA文库中扩增可变区基因，该方法简单实用，通常5'端通用引物设计在第一骨架 区或前导肽区；3'端通用引物设计在恒定区或J链区。
[0012] 嵌合抗体恒定区由抗体亚型决定，不同的亚型具有不同的免疫效应，故可根据需 要的免疫效应选择不同的亚型恒定区进行扩增。IgGl适于介导抗体依赖的细胞毒作用 (A